Optimasi Fase Gerak Dapar Fosfat PH 4,4-Metanol Pada Penetapan Kadar Campuran Amoksisilin Dan Kalium Klavulanat Dalam Tablet Secara Simultan Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

(1)

OPTIMASI FASE GERAK DAPAR FOSFAT

PH 4,4–METANOL PADA PENETAPAN KADAR

CAMPURAN AMOKSISILIN DAN KALIUM KLAVULANAT

DALAM TABLET SECARA SIMULTAN DENGAN

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

SKRIPSI

OLEH :

ALFAN MARTINA NIM 060804051

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

(2)

OPTIMASI FASE GERAK DAPAR FOSFAT

PH 4,4–METANOL PADA PENETAPAN KADAR

DALAM TABLET SECARA SIMULTAN DENGAN

SKRIPSI

Diajukan untuk Melengkapi Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar Sarjana Farmasi pada

Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

OLEH :

ALFAN MARTINA NIM 060804051

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

(3)

PENGESAHAN SKRIPSI

L

OPTIMASI FASE GERAK DAPAR FOSFAT PH 4,4–METANOL PADA PENETAPAN KADAR CAMPURAN AMOKSISILIN DAN KALIUM

KLAVULANAT DALAM TABLET SECARA SIMULTAN DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Oleh

ALFAN MARTINA NIM 060804051

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara Pada tanggal:...

Pembimbing I,

(Drs. Muchlisyam, M.Si., Apt.) NIP. 195006221980021001 Pembimbing II,

(Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt.) NIP. 195201041980031002

Panitia penguji,

(Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt.) NIP. 194908111976031001

(Drs. Muchlisyam, M.Si., Apt.) NIP. 195006221980021001

(Drs. Syafruddin, MS., Apt.) NIP. 194811111976031003

(Drs. Chairul Azhar Dalimunthe, M.Sc., Apt.) NIP. 194907061980021001

Medan, ... 200... Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Dekan,

(4)

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan rahmat, hidayah dan kemudahan kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Optimasi

Fase Gerak Dapar Fosfat pH 4,4-Metanol pada Penetapan Kadar Campuran

Amoksisilin dan Kalium Klavulanat dalam Tablet secara Simultan dengan

Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)” sebagai salah satu syarat

untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

KCKT merupakan metode yang paling umum digunakan untuk penetapan kadar campuran senyawa kimia. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan kondisi optimal metode KCKT dalam penetapan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet. Kombinasi obat ini sering digunakan untuk mengobati penyakit infeksi oleh β-laktmase. Hasil optimasi menunjukkan perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol 91:9 dengan laju alir 2 memberikan komdisi yang optimal. Hendaknya hasil penelitian ini menjadi masukan kepada industri obat tentang penetapan kadar campuran amokisilin dan kalium klavulanat dalam tablet secara KCKT.

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak Drs. Muchlisyam, M.Si., Apt. dan Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt. yang telah membimbing dengan penuh kesabaran, tulus dan ikhlas selama penelitian dan penulisan skripsi ini berlangsung. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. yang telah memberikan bantuan dan fasilitas selama masa pendidikan.

Penulis juga tidak lupa mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tulus kepada kedua orang tua, Ayahhanda Ham Hui Kock dan Ibunda Ng Lian Sin tercinta, serta abang dan kakak atas doa, dorongan dan pengorbanan baik moril maupun materil dalam penyelesaian skripsi ini.

Medan, Desember 2009 Penulis,

(5)

OPTIMASI FASE GERAK DAPAR FOSFAT

PH 4,4–METANOL PADA PENETAPAN KADAR

DALAM TABLET SECARA SIMULTAN DENGAN METODE

ABSTRAK

Obat dalam bentuk kombinasi sering digunakan untuk mengobati berbagai penyakit, termasuk diantaranya penyakit infeksi. Kombinasi amoksisilin dan kalium klavulanat merupakan kombinasi antibakteri yang terdiri dari antibiotik β -laktam amoksisilin dan penghambat β-laktamase kalium klavulanat. Kombinasi ini diberikan untuk mengatasi resistensi β-laktam. Obat ini dapat dianalisis secara serempak (simultan) menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

Untuk mendapatkan hasil analisis yang baik, maka perlu dilakukan optimasi terhadap metode KCKT yang digunakan. Adapun optimasi yang paling sederhana dan sering dilakukan yaitu terhadap perbandingan fase gerak dan laju alir.

Analisis menggunakan kolom Shim-pack VP-ODS (4,6 mm x 25 cm), detektor UV λ = 220 nm. Optimasi dilakukan terhadap perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol dengan perbandingan 98:2, 96:4, 94:6, 92:8, 91:9, dan 90:10. Dari hasil penelitian diperoleh perbandingan fase gerak yang terbaik adalah 91:9. Kemudian dengan perbandingan fase gerak yang terpilih dilakukan optimasi laju alir dari 1,0 ml/menit, 1,2 ml/menit, 1,4 ml/menit, 1,5 ml/menit, 1,6 ml/menit, 1,8 ml/menit, dan 2,0 ml/menit. Dari hasil optimasi diperoleh laju alir 2,0 ml/menit memberikan hasil yang terbaik dengan waktu tambat 3,9 menit untuk amoksisilin dan 2,5 menit untuk kalium klavulanat; resolusi 3,88; theoretical plate 1407 untuk amoksisilin dan 1346 untuk kalium klavulanat.

KCKT memiliki beberapa keuntungan dibandingkan dengan metode analisis lainnya, diantaranya kolom dapat digunakan kembali, memiliki berbagai jenis detektor, waktu analisis umumnya relatif singkat, ketepatan dan ketelitian relatif tinggi serta dapat digunakan untuk menganalisis kebanyakan senyawa kimia.

Penentuan linieritas kurva kalibrasi menunjukkan hubungan yang linier antara luas puncak dengan konsentrasi, untuk amoksisilin pada konsentrasi 100 sampai 1250 g/ml dengan koefisien korelasi, r = 0,9999 dan persamaan regresi

146176,518 3X

14997,2615

Y= + ; untuk kalium klavulanat pada konsentrasi 50 sampai 500 g/ml dengan koefisien korelasi, r = 0,9999 dan persamaan regresi

4 68440,9270 9X

17320,2392

(6)

Uji validasi yang dilakukan terhadap tablet generik (PT Indofarma), untuk amoksisilin diperoleh % recovery = 99,09%, simpangan baku relatif (RSD) = 0,21% dan untuk kalium klavulanat diperoleh % recovery = 99,71%, simpangan baku relatif (RSD) = 0,98%. Hasil ini menunjukkan metode KCKT yang digunakan memenuhi persyarat akurasi dan presisi. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) untuk amoksisilin berturut-turut adalah 34,23 mcg/ml dan 103,74 mcg/ml dan untuk kalium klavulanat adalah 8,83 mcg/ml dan 26,75 mcg/ml.

Hasil penetapan kadar kombinasi amoksisilin dan kalium klavulanat secara simultan memenuhi syarat USP XXX (2007).

.

(7)

OPTIMIZATION OF PHOSPHATE BUFFER PH 4,4–METHANOL AS MOBILE PHASE AND FLOW RATE OF THE SIMULTANEOUS

DETERMINATION OF AMOXICILLIN AND CLAVULANATE POTASSIUM MIXTURE IN TABLETS BY HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

ABSTRACT

Drug combinations are often used to treat any diseases, include bacterial infection. Combination of amoxicillin dan clavulanate potassium is antibiotic drug combination of the β-lactam antibiotic amoxicillin and the β-lactamase inhibitor clavulanate potassium. This combination is used to overcome β-lactam resistance. It can be analysed simultaneously by High-performance Liquid Chromatography (HPLC).

To get the optimum condition of analysis, it is important to optimization the HPLC method. The mobile phase composition and flow rate is the simplest and often be optimization.

The separation was achieved using the Shim-pack VP-ODS (4,6 mm x 25 cm), ultraviolet light detector at 220 nm, the mobile phase consisted of phosphate buffer pH 4,4 and methanol mixture. Optimization of mobile phase composition is determined from 98:2, 96:4, 94:6, 92:8, 91:9, and 90:10. Optimization result showed the best analysis condition was the mobile phase consisted of phosphate buffer pH 4,4-methanol 91:9. Optimization of flow rate with the best mobile phase is determined from 1,0 ml/minute, 1,2 ml/minute, 1,4 ml/minute, 1,5 ml/minute, 1,6 ml/minute, 1,8 ml/minute, and 2,0 ml/minute. The best analysis condition was the 2,0 ml/minute with retention time 3,9 minutes for amoxicillin and 2,6 minutes for clavulanate potasium; the resolution is 3,88; 1407 theoretical plates for amoksisilin and 1346 for clavulanate potassium.

Adventages of HPLC are the column can be reused, various detector, the shorter analysis time, the better accuracy and precision, and most material can be analysed by HPLC.

The determination of calibration curve linearity showed a linear correlation between the peak area versus concentration, for amoxicillin from 100 to 1250 g/ml with the correlation coefficient, r = 0.9999 and the regression Y =

146176,518 3X

14997,2615

Y= + ; for clavulanate potassium from 50 to 500 g/ml with the correlation coefficient, r = 0.9999 and the regression

4 68440,9270 9X

17320,2392

Y= + .

(8)

of amoxicillin = 34,23 mcg/ml and 103,74 mcg/ml. Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of clavulanate potassium = 8,83 mcg/ml and 26,75 mcg/ml.

The result of simultaneous determination of amoxicillin and cavulanate mixture in tablets fulfilled the requirement of the thirtieth edition United States Pharmacopoeia (2007).

(9)

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ... i

LEMBAR PENGESAHAN ... iii

KATA PANGANTAR... iv

ABSTRAK ... v

ABSTRACT ... vii

DAFTAR ISI ... ix

DAFTAR TABEL ... ix

DAFTAR GAMBAR ... x

DAFTAR LAMPIRAN ... xi

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 4

1.3 Hipotesis ... 5

1.4 Tujuan Penelitian ... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 21

3.1 Alat ... 21

3.2 Bahan ... 21

3.3 Sampel ... 22

3.4 Rancangan Penelitian ... 22

3.4.1 Penyiapan Bahan ... 22

3.4.1.1 Pembuatan Dapar Fosfat pH 4,4 ... 6

3.4.1.2 Pembuatan Pelarut ... 6

3.4.1.3 Pembuatan Fase Gerak Dapar Fosfat pH 4,4- Metanol ... 6

3.4.1.4 Pembuatan Larutan Induk Baku Amoksisilin ... 7

3.4.1.5 Pembuatan Larutan Induk Baku Kalium Klavulanat ... 7

(10)

3.4.2.1 Penyiapan Alat KCKT ... 7

3.4.2.2 Penentuan Komposisi Fase Gerak Dapar Fosfat pH 4,4 dan Laju Alir yang Optimum ... 8

3.4.2.3 Analisis Kualitatif ... 8

3.4.2.4 Analisis Kuantitatif ... 8

3.4.2.4.1 Penentuan Lineritas Kurva Kalibrasi Baku Pembanding Amoksisilin dan Kalium Klavulanat ... 8

3.4.2.4.2 Penetapan Kadar Amoksisilin dan Kalium Klavulanat dalam Sampel ... 9

3.4.2.5 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik . 10 3.4.3 Validasi Metode ... 11

3.4.3.1 Akurasi (Kecermatan) ... 11

3.4.3.2 Presisi (Keseksamaan) ... 11

3.4.3.3 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ... 12

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 13

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 26

5.1 Kesimpulan ... 26

5.2 Saran ... 26

DAFTAR PUSTAKA ... 27

(11)

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Data hasil analisis amoksisilin dan kalium klavulanat baku pada berbagai perbandingan komposisi fase gerak dan

laju alir 2 ml/menit ... 15 Tabel 2. Data hasil analisis amoksisilin dan kalium klavulanat baku

pada berbagai laju alir dengan fase gerak fosfat pH 4,4-metanol (91:9) ... 16 Tabel 3. Hasil pengolahan data dari sediaan tablet campuran amoksisilin

dan kalium klavulanat ... 21 Tabel 4. Hasil penetapan kadar amoksisilin dan kalium klavulanat

dalam berbagai sediaan tablet ... 22 Tabel 5. Data hasil pengujian akurasi dan presisi amoksisilin dengan

metode penambahan baku ... 23 Tabel 6. Data hasil pengujian akurasi dan presisi kalium klavulanat

(12)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Kromatogram identifikasi amoksisilin dan kalium klavulanat Baku sebelum dilakukan spiking (penambahan

baku) amoksisilin... 13 Gambar 2. Kromatogram identifikasi amoksisilin dan kalium

klavulanat baku setelah dilakukan spiking (penambahan

baku) amoksisilin... 14 Gambar 3. Kromatogram analisis campuran amoksisilin dan kalium

klavulanat dengan kolom Shim-pack VP-ODS, fase gerak larutan dapar fosfat pH 4,4–metanol (95:5) dan laju alir

2 ml/menit ... 14 Gambar 4. Kromatogram hasil analisis campuran amoksisilin dan kalium

klavulanat baku dengan fase gerak dapar fosfat pH 4,4–metanol (91:9) dan laju alir 2 ml/menit ... 17 Gambar 5. Kromatogram hasil analisis campuran amoksisilin dan kalium

klavulanat dalam tablet Clavamox dengan fase gerak dapar

fosfat pH 4,4–metanol (91:9) dan laju alir 2 ml/menit ... 18 Gambar 6. Kurva kalibrasi kalium klavulanat baku menggunakan KCKT

dengan kolom Shim-Pack VP-ODS (4,6 x 250 mm), fase gerak larutan dapar fosfat pH 4,4 dan metanol (91:9) dan laju alir

2,0 ml/menit ... 19 Gambar 7. Kurva kalibrasi amoksisilin baku menggunakan KCKT dengan

kolom Shim-Pack VP-ODS (4,6 x 250 mm), fase gerak larutan dapar fosfat pH 4,4 dan metanol (91:9) dan laju alir

(13)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Gambar Instrumen KCKT dan Syringe 100 l ... 29 Lampiran 2. Gambar Perangkat Pendukung Penelitian Lainnya ... 30 Lampiran 3. Kromatogram Penyuntikan Amoksisilin dan Kalium Klavulanat

Baku untuk Mencari Perbandingan Fase Gerak Larutan Dapar Fosfat pH 4,4 dan Metanol yang Optimum untuk Analisis ... 31 Lampiran 4. Kromatogram Penyuntikan Amoksisilin dan Kalium Klavulanat

Baku dalam Upaya Mencari Laju Alir yang Optimum

untuk Analisis ... 34 Lampiran 5. Kromatogram Hasil Penyuntikan Larutan Amoksisilin dan

Kalium Klavulanat Baku pada Pembuatan Kurva Kalibrasi ... 38 Lampiran 6. Perhitungan Persamaan Regresi dari Kurva Kalibrasi Amoksisilin

dan Kalium Klavulanat yang Diperoleh dengan KCKT pada

Panjang Gelombang 220 nm ... 41 Lampiran 7. Kromatogram Hasil Penyuntikan Larutan Tablet Generik

(PT Indofarma) ... 45 Lampiran 8. Analisis Data secara Statistik untuk Mencari Kadar Amoksisilin

dan Kalium Klavulanat Sebenarnya dari Hasil Penyuntikan

Larutan Tablet Generik (PT Indofarma) ... 48 Lampiran 9. Kromatogram Hasil Penyuntikan Larutan Tablet Claneksi

(PT Sanbe) ... 52 Lampiran 10. Analisis Data secara Statistik untuk Mencari Kadar Amoksisilin

Larutan Tablet Claneksi (PT Sanbe) ... 55 Lampiran 11. Kromatogram Hasil Penyuntikan Larutan Tablet Clavamox

(PT Kalbe Farma) ... 59 Lampiran 12. Analisis Data secara Statistik untuk Mencari Kadar Amoksisilin

(14)

Lampiran 13. Kromatogram Hasil Penyuntikan Larutan Tablet Augmentin

(PT Glaxo Smithkline Beecham) ... 66

Lampiran 14. Analisis Data secara Statistik untuk Mencari Kadar Amoksisilin dan Kalium Klavulanat Sebenarnya dari Hasil Penyuntikan Larutan Tablet Augmentin (PT Glaxo Smithkline Beecham) ... 69

Lampiran 15. Kromatogram Hasil Perolehan Kembali Amoksisilin dan Kalium Klavulanat Baku yang Ditambahkan pada Tablet Generik (PT Indofarma) ... 73

Lampiran 16. Data Perolehan Kembali Amoksisilin dan Kalium Klavulanat Baku pada Tablet Generik (PT Indofarma) dengan metode Penambahan Baku ... 76

Lampiran 17. Contoh perhitungan persen perolehan kembali ... 77

Lampiran 18. Analisis Data secara Statistik dari Hasil Perolehan Kembali Amoksisilin dan Kalium Klavulanat Baku pada Tablet Generik (PT Indofarma) dengan Metode Penambahan Baku ... 79

Lampiran 19. Perhitungan Penetapan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ... 82

Lampiran 20. Contoh Perhitungan Penimbangan Sampel ... 84

Lampiran 21. Tabel Hasil Analisa Kadar Amoksisilin dan Kalium Klavulanat dalam Sampel ... 85

Lampiran 22. Contoh perhitungan untuk mencari kadar Amoksisilin dan Kalium Klavulanat ... 89

Lampiran 23. Daftar spesifikasi sampel ... 91

Lampiran 24. Sertifikat Analisis Amoksisilin BPFI ... 92

Lampiran 25. Sertifikat Analisis Kalium Klavulanat Baku ... 93

Lampiran 26. Sertifikat Analisis Amoksisilin Baku ... 94

(15)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Obat dalam bentuk kombinasi sering digunakan untuk mengobati berbagai penyakit, termasuk diantaranya penyakit infeksi. Kombinasi amoksisilin dan kalium klavulanat merupakan kombinasi antibakteri yang terdiri dari antibiotik β -laktam amoksisilin dan penghambat β-laktamase kalium klavulanat. Kombinasi ini diberikan untuk mengatasi resistensi β-laktam. Obat ini dapat dianalisis secara serempak (simultan) menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Borisy, 2003; Ahuja, 2006; Berry, 2005; Olano, 2007).

Untuk mendapatkan hasil analisis yang baik, maka perlu dilakukan optimasi. Optimasi metode KCKT dilakukan untuk mendapatkan pemisahan yang lebih baik, analisis lebih cepat, meningkatkan sensitifitas dan menghemat biaya. Optimasi dilakukan terhadap beberapa variabel diantaranya perbandingan fase gerak, kecepatan alir fase gerak, fase diam atau kolom. Adapun optimasi yang paling sederhana dan sering dilakukan yaitu terhadap perbandingan fase gerak dan laju alir (Kromidas, 2006).

(16)

Menurut Undang-undang No. 36 tahun 2009 pasal 105 ayat 1 tentang kesehatan bahwa sediaan farmasi yang berupa obat dan bahan baku obat harus memenuhi syarat farmakope Indonesia atau buku standar lainnya.

Persyaratan kadar untuk sediaan tablet amoksisilin dan kalium klavulanat menurut USP XXX (United States Pharmacopoeia XXX) tahun 2007 yaitu mengandung amoksisilin, C16H19N3O5S, dan asam klavulanat, C8H9NO5, tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 120,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.

Menurut USP XXX (2007), tablet campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dapat ditentukan kadarnya secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi menggunakan kolom L1 (oktadesil silana) 4 mm x 30 cm dengan fase gerak larutan dapar fosfat pH 4,4 dan metanol (95:5), laju alir (flow rate) 2,0 ml/menit, dan deteksi dilakukan pada panjang gelombang 220 nm.

Berdasarkan hal tersebut diatas, penulis tertarik untuk melakukan optimasi metode KCKT dengan kolom Shim-pack VP-ODS (4,6 mm x 25 cm). Optimasi dilakukan terhadap perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 4,4–metanol dan laju alir. Kemudian perbandingan fase gerak dan laju alir yang terpilih digunakan untuk menetapkan kadar amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan persyaratan yang tercantum dalam USP XXX (2007).

(17)

tinggi serta dapat digunakan untuk menganalisis kebanyakan senyawa kimia (Meyer, 2004).

Untuk memperoleh validitas metode ini, maka dilakukan uji akurasi yang

dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery) dan uji presisi yang dinyatakan dalam Relative Standart Deviation (RSD). Kemudian ditentukan batas

deteksi (limit of detection) dan batas quantitasi (limit of quantitation) (Épshtein, 2004).

1.2 Perumusan Masalah

− Apakah fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol dapat memisahkan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet dengan metode KCKT?

− Berapakah perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol dan laju alir agar dapat menghasilkan pemisahan yang baik untuk campuran amoksisilin dan kalium klavulanat sesuai dengan kriteria harga resolusi tidak lebih kecil dari 3,5?

− Apakah kondisi optimal fase gerak dan laju alir yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis kuantitatif campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet dengan validasi metode yang memenuhi persyaratan?

1.3Hipotesis

(18)

− Fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol pada perbandingan tertentu dan laju alir yang terpilih dapat memisahkan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat sesuai dengan persyaratan harga resolusi tidak lebih kecil dari 3,5.

− Kondisi optimal fase gerak dan laju alir yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis kuantitatif campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet dengan validasi metode yang memenuhi persyaratan.

1.4Tujuan penelitian

− Melakukan pemisahan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dengan metode KCKT meggunakan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol.

− Melakukan optimasi fase gerak sehingga didapatkan komposisi dapar fosfat pH 4,4-metanol dan laju alir yang optimal untuk pemisahan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat yang baik.

− Melakukan uji validasi terhadap metode KCKT pada kondisi optimal fase gerak dan laju alir yang terpilih.

1.5 Manfaat Penelitian

(19)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Amoksisilin dan Kalium Klavulanat

Amoksisilin dan kalium klavulanat adalah kombinasi antibakteri oral yang terdiri dari antibiotik β-laktam amoksisilin dan penghambat β-laktamase kalium klavulanat. Kalium klavulanat melindungi amoksisilin agar tidak terhidrolisis oleh enzim β-laktamase sehingga dapat memperpanjang kerja amoksisilin (Berry, 2005).

Kombinasi amoksisilin dan kalium klavulanat lebih toksik daripada amoksisilin maupun kalium klavulanat yang diberikan secara tunggal. Kombinasi ini dapat menimbulkan gangguan saluran cerna seperti mual, muntah, nyeri perut dan diare. Kelebihan dosis kombinasi ini dapat menyebabkan terjadinya hipersensitivitas neuromuskular dan ketidakseimbangan elektolit sehingga terjadi gangguan ginjal. Sedangkan pemberian pada dosis subterapi dapat menyebabkan resistensi (Caron, 1991; Methews, 1995).

2.1.1 Amoksisilin

(20)

Gambar 1. Rumus bangun

amoksisilin

Gambar 2. Rumus bangun kalium

klavulanat

Amoksisilin merupakan antibiotik β-laktam berspektrum luas yang bekerja dengan menghambat sintesis dinding sel bakteri. Amoksisilin dpat dirusak oleh β -laktamase sehingga amoksisilin tidak efektif untuk melawan bakteri yang memproduksi β-laktamase (Unal, 2008).

2.1.2 Kalium Klavulanat

Kalium klavulanat memiliki rumus molekul C8H8KNO5 dngan berat molekul 237,25. Kalium klavulanat merupakan suatu senyawa obat dengan pemerian serbuk putih, dan berasa pahit. Kalium klavulanat mudah larut dalam alkohol dan air (1 gram dalam 2,5 ml alkohol atau dalam 1 ml air) (USP XXX, 2007; Gelone, 2005).

Asam klavulanat merupakan metabolit yang dihasilkan oleh Streptomyces clavuligerus. Penelitian menunjukkan asam klavulanat bekerja sebagai bakterisida

(21)

2.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan suatu metode kromatografi yang menggunakan suatu padatan, cairan, resin penukar ion (ion exchange resin) atau polimer berpori (porous polymer) pada kolom sebagai fase

diamnya, sedangkan fase geraknya berupa suatu cairan yang melewati kolom pada tekanan tinggi (Hamilton and Sewell, 1977).

KCKT merupakan metode yang sering digunakan untuk menganalisis senyawa obat. KCKT dapat digunakan untuk pemeriksaan kemurnian bahan obat, pengawasan proses sintesis dan pengawasan mutu (quality control) (Ahuja, 2005).

2.3.1 Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dapat dibagi menjadi beberapa metode, yakni: kromatografi fase normal (normal phase chromatography), kromatografi fase balik (reversed-phase chromatography), kromatografi penukar ion (ion-exchange chromatography) dan kromatografi eksklusi ukuran (size-exclusion chromatography) (Kazakevich, 2007).

Kromatografi fase balik merupakan kebalikan dari kromatografi fase normal. Kromatografi fase balik menggunakan fase diam yang bersifat hidrofobik, dan fase geraknya yang relatif lebih polar daripada fase diam. Fase diam yang populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18). Hampir 90 % senyawa kimia dapat dianalisis dengan kromatografi jenis ini (Meyer, 2004; Kazakevich, 2007).

2.3.2 Proses Pemisahan dalam Kolom KCKT

(22)

→ Fase gerak → Fase diam

Gambar 3. Ilustrasi proses pemisahan yang terjadi di dalam kolom KCKT. (sumber: Meyer, V.R. 2004. Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Edition. St. Gallen: John Wiley & Sons, Ltd. Page analit dengan permukaan fase diam sehingga terjadi perbedaan waktu perpindahan setiap komponen dalam campuran (Kazakevich, 2007).

(23)

Gambar 4. Kromatogram hasil analisis KCKT. (sumber: Meyer, V.R. 2004. Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Edition. St. Gallen: John Wiley & Sons, Ltd. Page 21)

2.3.3 Konsep Umum KCKT

2.3.3.1 Faktor Tambat (k)

Waktu tambat atau retention time (tR) adalah periode waktu yang dilalui dari penyuntikan sampel hingga diperoleh rekaman signal maksimum. Waktu tambat suatu zat selalu konstan pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dijadikan suatu dasar analisis kualitatif. Suatu puncak kromatografi dapat diidentifikasi dengan membandingkan waktu tambatnya terhadap baku (Meyer, 2004).

Gambar 4 menunjukkan, w adalah lebar puncak dan t0 disebut waktu hampa (void time/dead time) yaitu waktu tambat pelarut yang tidak tertahan atau waktu yang dibutuhkan oleh fase gerak untuk melewati kolom (breakthrough time) (Meyer, 2004).

Waktu tambat dipengaruhi oleh laju alir ( ) dan panjang kolom (L). Jika laju alir lambat atau kolom panjang, maka tR akan semakin besar dan sebaliknya.

t

L =

(24)

Oleh karena itu, diperlukan suatu ukuran derajat tambatan dari analit yang lebih independen yakni faktor tambat (k). Faktor tambat dihitung dengan membagi waktu tambat bersih (t’R) dengan waktu hampa (t0) seperti yang dapat dilihat pada rumus berikut ini.

0 0 0

'

t

k

=

R

=

R

−

(Ornaf and Dong, 2005).

Faktor tambat disebut juga sebagai faktor kapasitas (k’).

Idealnya, analit yang sama jika diukur pada dua instrumen berbeda dengan ukuran kolom yang berbeda namun memiliki fase diam dan fase gerak yang sama, maka faktor tambat dari analit pada kedua sistem KCKT tersebut secara teoritis adalah sama (Kazakevich, 2007).

2.3.3.2 Efisiensi Kolom (N)

Efisiensi adalah ukuran tingkat penyebaran puncak dalam kolom. Efisiensi kolom ditunjukkan dari jumlah lempeng teoritikal atau theoretical plates (N), yang dapat dihitung dengan rumus:

2

16 

    

= w t

N R (Kazakevich, 2007).

Kolom yang efisien adalah kolom yang mampu menghasilkan pita sempit dan memisahkan analit dengan baik. Nilai lempeng akan semakin tinggi jika ukuran kolom semakin panjang, hal ini berarti proses pemisahan yang terjadi semakin baik. Hubungan antara nilai lempeng dengan panjang kolom disebut sebagai nilai HETP/High Equivalent of a Theoretical Plate (H). H dapat dihitung dengan rumus:

N

L

(25)

Gambar 5. Kromatogram hasil analisis KCKT dengan berbagai selektifitas dan efisiensi. (sumber: Kazakevich, Y. 2007. HPLC for Pharmaceutical Scientists, New Jersey: John Wiley & Sons, Ltd. Page 21)

2.3.3.3 Selektifitas atau Faktor Pemisahan (αααα)

Selektifitas (α) adalah kemampuan sistem kromatografi untuk membedakan analit yang berbeda. Selektifitas ditentukan sebagai rasio perbandingan faktor tambat (k) dari analit yang berbeda:

0 1

0 2 2 1

t

k

R R

−

=

α

(Kazakevich, 2007).

(26)

2.3.3.4 Resolusi (Rs)

Resolusi (Rs) merupakan derajat pemisahan dari dua puncak analit yang bersebelahan. Resolusi didefinisikan sebagai perbedaan waktu tambat antara dua puncak dibagi dengan rata-rata lebar kedua puncak

(

)

[

1 2 /2

]

1 2

w w

t t

R R R

+ −

= (Ornaf and Dong, 2005).

Pada analisis kuantitatif, resolusi yang ditunjukkan harus lebih besar dari 1,5. Sementara itu, bila kedua puncak yang berdekatan memiliki perbedaan ukuran yang signifikan, maka diperlukan nilai resolusi yang lebih besar (Meyer, 2004).

2.3.3.5 Faktor Tailing dan Faktor Asimetri

Idealnya, puncak kromatogram akan memperlihatkan bentuk Gaussian dengan derajat simetris yang sempurna (Ornaf and Dong, 2005). Namun kenyataannya, puncak yang simetris secara sempurna jarang dijumpai. Jika diperhatikan secara cermat, maka hampir setiap puncak dalam kromatografi memperlihatkan tailing (Dolan, 2003). Pada Gambar 6 ditunjukkan tiga jenis bentuk puncak.

Pengukuran derajat asimetris puncak dapat dihitung dengan 2 cara, yakni faktor tailing dan faktor asimetris. Faktor tailing (Tf) dihitung dengan menggunakan lebar puncak pada ketinggian 5% (W0,05), rumusnya dituliskan sebagai berikut.

a b a Tf

2 + =

(27)

Gambar 7. Pengukuran derajat asimetris puncak. (sumber: Dolan, J.W. 2003.

Why Do Peaks Tail?. LC GC North America 21(7). Page 612) Sedangkan faktor asimetri (As) dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut.

a b As=

Nilai a dan b dalam perhitungan faktor asimetri merupakan setengah lebar puncak pada ketinggian 10% seperti yang ditunjukkan di Gambar 6. Jika nilai a sama dengan b, maka faktor tailing dan asimetri bernilai 1. Kondisi ini menunjukkan bentuk puncak yang simetris sempurna (Dolan, 2003). Bila puncak berbentuk tailing, maka kedua faktor ini akan bernilai lebih besar dari 1 dan sebaliknya bila puncak berbentuk fronting, maka faktor tailing dan asimetri akan bernilai lebih kecil dari 1 (Hinshaw, 2004).

2.3.4 Instrumen KCKT

(28)

Gambar 8. Instrumen dasar KCKT. (sumber: McMaster, M.C. 2007. HPLC A Practical User’s Guide, 2nd Edition. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. Page 106)

2.3.4.1 Wadah Fase Gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak menyimpan sejumlah fase gerak yang secara langsung berhubungan dengan sistem (Meyer, 2004). Wadah haruslah bersih dan inert, seperti botol pereaksi kosong maupun labu gelas. Adalah hal yang penting untuk men-degass fase gerak sebelum digunakan karena gelembung gas kecil dalam fase gerak dapat terkumpul di pump head atau pun detektor sehingga akan mengganggu kondisi KCKT (Brown and DeAntonis, 1997).

2.3.4.2 Pompa (Pump)

(29)

Gambar 9. Tipe injektor sampling valve. (sumber: Meyer, V.R. 2004. Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Edition. St. Gallen: John Wiley & Sons, Ltd. Page 69)

2.3.4.3 Tempat Injeksi Sampel (Injector)

Ada 3 jenis macam injektor, yakni syringe injector, sampling valve dan automatic injector. Syringe injector merupakan bentuk injektor yang paling

sederhana (Synder and Kirkland, 1979).

Sampling valve atau manual injector mengandung 6 katup saluran

dilengkapi dengan rotor, sample loop dan saluran jarum suntik (needle port). Larutan sampel akan disuntikkan ke dalam sampel loop dengan jarum suntik gauge 22 pada posisi “load” dan larutan sampel yang ada di sample loop kemudian akan dialirkan ke kolom dengan memutar rotor ke posisi “inject”. Ukuran sample loop eksternal bervariasi antara 6 l hingga 2 ml (Ornaf and Dong, 2005).

Automatic injector atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang

mirip, hanya saja sistem penyuntikannya bekerja secara otomatis (Meyer, 2004).

2.3.4.4 Kolom (Column)

(30)

tahan karat dan dikemas dengan fase diam tertentu. Ukuran kolom untuk tujuan analitik berkisar antara panjang 10 hingga 25 cm dan diameter dalam 3 hingga 9 mm (Brown and DeAntonis, 1997).

2.3.4.5 Detektor (Detector)

Karakteristik detektor yang baik adalah sensitif, batas deteksi rendah, respon yang linier, mampu mendeteksi solut secara universal, tidak destruktif, mudah dioperasikan, memiliki dead volume yang kecil dan tidak sensitif terhadap perubahan temperatur serta kecepatan fase gerak (Hamilton and Sewell, 1977). Beberapa detektor yang paling sering digunakan dalam KCKT adalah detektor spektrofotometri UV-Vis, photodiode-array (PDA), fluoresensi, indeks bias dan detektor elektrokimia (Rohman, 2007).

2.3.4.6 Perekam (Recorder)

Alat pengumpul data seperti komputer, integrator dan rekorder dihubungkan ke detektor. Alat ini akan menangkap sinyal elektronik dari detektor dan memplotkannya ke dalam kromatogram sehingga dapat dievaluasi oleh analis (Brown and DeAntonis, 1997).

2.4 Validasi Metode

Validasi metode adalah suatu proses yang menunjukkan bahwa prosedur analitik telah sesuai dengan penggunaan yang dikehendaki. Proses validasi metode untuk prosedur analitik dimulai dengan pengumpulan data validasi oleh pelaksana guna mendukung prosedur analitiknya (Bliesner, 2006).

(31)

Hasil validasi metode dapat digunakan untuk memutuskan kualitas, reabilitas dan konsistensi dari hasil analitik (Huber, 2007). Menurut USP (United States Pharmacopeia) XXX, ada 8 karakteristik utama yang digunakan dalam validasi

metode, yakni akurasi/kecermatan, presisi/keseksamaan, spesifisitas, batas deteksi, batas kuantitasi, linieritas, rentang dan kekuatan/ketahanan.

2.4.1 Akurasi/Kecermatan

Akurasi/kecermatan adalah kedekatan antara nilai hasil uji yang diperoleh lewat metode analitik dengan nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan kembail (%recovery) Akurasi dapat ditentukan dengan dua metode, yakni placebo recovery dan standard addition method. Pada spiked-placebo recovery atau metode simulasi, analit murni ditambahkan (spiked) ke

dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi, lalu campuran tersebut dianalisis dan jumlah analit hasil analisis dibandingkan dengan jumlah analit teoritis yang diharapkan. Jika plasebo tidak memungkinkan untuk disiapkan, maka sejumlah analit yang telah diketahui konsentrasinya dapat ditambahkan langsung ke dalam sediaan farmasi otentik. Metode ini dinamakan standard addition method atau metode penambahan baku. (USP XXX, 2007; Ermer, 2005;

Harmita, 2004).

2.4.2 Presisi/Keseksamaan

Presisi/keseksamaan adalah ukuran keterulangan metode analitik, termasuk di antaranya kemampuan instrumen dalam memberikan hasil analitik yang reprodusibel. Berdasarkan rekomendasi ICH (the International Conference on the Harmonisation), karakteristik presisi dilakukan pada 3 tingkatan, yakni

(32)

reprodusibilitas (reproducibility). Keterulangan dilakukan dengan cara menganalisis sampel yang sama oleh analis yang sama menggunakan instrumen yang sama dalam periode waktu singkat. Presisi antara dikerjakan oleh analis yang berbeda. Sedangkan reprodusibilitas dikerjakan oleh analis yang berbeda dan di laboratorium yang berbeda (USP XXX, 2007; Épshtein, 2004).

2.4.3 Spesifisitas

Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradatif dan komponen matriks. Secara umum, spesifisitas dapat ditunjukkan oleh pendekatan secara langsung maupun tidak langsung. Pendekatan langsung dapat ditunjukkan oleh minimalnya gangguan oleh senyawa lain terhadap hasil analisis misalnya mendapatkan hasil yang sama dengan atau tanpa senyawa pengganggu, resolusi kromatografik yang bagus dan kemurnian puncak (peak purity). Pendekatan tidak langsung adalah lewat pengamatan karakteristik akurasi dari metode tersebut. Bila akurasi metode telah dapat diterima (acceptable) dan valid, maka metode tersebut otomatis telah masuk kriteria sebagai metode yang spesifik (Ermer, 2005).

2.4.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

(33)

Menurut ICH, batas deteksi dan batas kuantitasi dapat ditentukan dengan 2 metode yakni metode non-instrumental visual dan metode perhitungan. Metode non-instrumental visual digunakan dalam analisis kromatografi lapis tipis dan metode titrimetri. Sementara itu, metode perhitungan banyak digunakan dalam analisis kromatografi cair kinerja tinggi (Rohman, 2007).

2.4.5 Linieritas

Linieritas adalah kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linieritas dapat ditentukan secara langsung dengan pengukuran analit atau sampel yang di-spiked pada konsentrasi sekurang-kurangnya lima titik konsentrasi yang mencakup seluruh rentang konsentrasi kerja (Ermer, 2005).

Berdasarkan rekomendasi ICH, linieritas dalam prakteknya diperkirakan pertama kali secara visual dari penampilan kurva plot luas area/tinggi puncak dengan konsentrasi. Bila terlihat linier, maka hubungan plot tersebut dipelajari lagi dengan metode analisis regresi. Untuk prosedur analitik penentuan kadar senyawa induk, CDER (Center for Drug Evaluation and Research, US FDA) merekomendasikan bahwa kriteria linieritasnya pada tingkat koefisien korelasi tidak lebih kecil dari 0,999 (Épshtein, 2004).

2.4.6 Rentang

(34)

mampu memberikan presisi, akurasi dan linieritas yang dapat diterima ketika digunakan untuk menganalisis sampel (USP XXX, 2007; USP Convention, 2006).

2.4.7 Kekuatan/Ketahanan

(35)

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

Metode penelitian yang dilakukan adalah metode eksperimental. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penelitian, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan. Pada bulan Agustus hingga Oktober 2009.

3.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi seperangkat instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) lengkap (Shimadzu Prominence series) dengan pompa (LC 20 AD), degasser (DGU 20 A5), injektor (Rheodyne 7225i), kolom Shim-Pack VP-ODS (4,6 x 250 mm), detektor UV/Vis (SPD 20 A); syringe 100 l (SGE); sonifikator (Branson 1510); pompa vakum (Gast DOA-P604-BN); alat penyaring sampel dan fase gerak dilengkapi dengan penyaring membran Whatman Cellulose Nitrate 0,45 m, Cellulose Nitrate 0,2 m dan PTFE 0,5 m; neraca analitik (Boeco BBL31); pH meter (Hanna) serta alat gelas lainnya.

3.2 Bahan

(36)

Clavamox (PT Kalbe Farma) dan tablet Augmentin (PT Glaxo Smithkline Beecham).

3.3 Sampel

Pengambilan sampel dilakukan secara purposif karena tempat pengambilan sampel dianggap homogen. Dari hasil sampling tersebut maka diperoleh tablet generik (PT Indofarma), tablet Claneksi (PT Sanbe), tablet Clavamox (PT Kalbe Farma) dan tablet Augmentin (PT Glaxo Smithkline Beecham) yang merupakan sampel yang digunakan dalam penelitian ini, yang mengandung masing-masing amoksisilin 500 mg dan kalium klavulanat 125 mg.

3.4 Rancangan Penelitian

3.4.1 Penyiapan Bahan

3.4.1.1 Pembuatan Dapar Fosfat pH 4,4

Dilarutkan NaH2PO4 sebanyak 7,8 gram dalam 900 ml air, disesuaikan pH 4,4 ± 0,1 dengan penambahan NaOH 10 N atau asam fosfat. Diencerkan dengan air hingga 1000 ml (USP XXX, 2007).

3.4.1.2 Pembuatan Pelarut

Dicampurkan larutan dapar fosfat pH 4,4 dan metanol dengan perbandingan 91:9.

3.4.1.3 Pembuatan Fase Gerak Dapar Fosfat pH 4,4–Metanol

Fase gerak dapar fosfat pH 4,4–metanol (91:9) dibuat dengan sistem elusi

(37)

melalui cellulose nitrate membrane filters 0,45 m dan membrane filters PTFE 0,5 m, lalu diawaudarakan selama lebih kurang 20 menit.

3.4.1.4 Pembuatan Larutan Induk Baku Amoksisilin

Ditimbang seksama sejumlah 125,0 mg Amoksisilin BPFI, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 2500 mcg/ml.

3.4.1.5 Pembuatan Larutan Induk Baku Kalium Klavulanat

Ditimbang seksama sejumlah 125,0 mg kalium klavulanat baku (mengandung campuran kalium kavulanat dan avicel 1:1), dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dilarutkan dan diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 2500 mcg/ml.

3.4.2 Prosedur Analisis

3.4.2.1 Penyiapan Alat KCKT

Kolom yang digunakan adalah Shim-Pack VP-ODS (4,6 x 250 mm). KCKT menggunakan detektor UV-Vis pada panjang gelombang analisis yang diperoleh dengan sensitifitas 1,000 AUFS. Pompa menggunakan mode aliran tetap dengan sistem elusi gradien.

(38)

3.4.2.2 Penentuan Komposisi Fase Gerak Dapar Fosfat pH 4,4–metanol dan

Laju Alir yang Optimum

Kondisi kromatografi divariasikan untuk mendapatkan hasil analisis yang optimum. Kondisi kromatografi yang divariasikan adalah perbandingan fase gerak dan laju alir. Perbandingan fase gerak yakni larutan dapar fosfat pH 4,4 dan metanol divariasikan 98:2, 96:4, 94:6, 92:8, 91:9, dan 90:10. Dari perbandingan fase gerak yang terpilih ditentukan laju alir dari 1,0 ml/menit, 1,2 ml/menit, 1,4 ml/menit, 1,5 ml/menit, 1,6 ml/menit, 1,8 ml/menit dan 2,0 ml/menit.

3.4.2.3 Analisis Kualitatif

Analisis kualitatif amoksisilin dan kalium klavulanat dilakukan dengan membandingkan puncak yang memiliki waktu retensi hampir sama (identik), pada kromatogram hasil analisis KCKT dari larutan baku pembanding amoksisilin dan kalium klavulanat dengan larutan sampel pada panjang gelombang 220 nm.

3.4.2.4 Analisis Kuantitatif

3.4.2.4.1 Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi Baku Pembanding

Amoksisilin dan Kalium Klavulanat

(39)

adalah 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm dan 500 ppm. Masing-masing larutan disaring melalui penyaring membran Cellulose Nitrate 0,2 m dan diawaudarakan selama ± 20 menit. Kemudian, filtrat larutan baku pembanding disuntikkan sebanyak 100 l ke dalam sistem KCKT melalui injektor dengan loop 20 l. Deteksi menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 220 nm. Direkam kromatogram dan dibuat kurva kalibrasi dari luas puncak, lalu dihitung persamaan regresi dan koefisien korelasi.

3.4.2.4.2 Penetapan Kadar Amoksisilin dan Kalium Klavulanat dalam

Sampel

Diambil 10 tablet yang telah bersih dari selaput film, ditimbang, dan digerus homogen. Ditimbang serbuk setara dengan 25 mg amoksisilin, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan ditambahkan dengan pelarut sampai garis tanda. Dikocok, lalu disaring (beberapa ml filtrat pertama dibuang). Larutan lalu disaring melalui penyaring membran Cellulose Nitrate 0,2 m dan diawaudarakan selama ±20 menit. Kemudian disuntikkan sebanyak 100 l ke dalam sistem KCKT melalui injektor dengan loop 20 l, menggunakan sistem elusi gradien dengan fase gerak larutan dapar fosfat pH 4,4–metanol (91:9), laju

(40)

3.4.2.5 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik

Data perhitungan kadar amoksisilin dan kalium klavulanat dianalisis secara statistik menggunakan uji t.

Rumus yang digunakan adalah:

1 -n

) X X

( 2

SD = ∑ −

n SD

X X

hitung

t

= −

Data diterima jika -ttabel < thitung < ttabel pada interval kepercayaan 99,5% dengan nilai α = 0,005.

Keterangan:

SD = standard deviation/simpangan baku X = kadar dalam satu perlakuan

X

= kadar rata-rata dalam satu sampel n = jumlah perlakuan

α = tingkat kepercayaan

Untuk menghitung kadar amoksisilin dan kalium klavulanat dalam sampel secara statistik digunakan rumus:

) n SD (t X ) (

Kadar µ = ± × Keterangan:

X

= kadar rata-rata dalam satu sampel

t = harga ttabel sesuai dengan derajat kepercayaan SD = standard deviation/simpangan baku

(41)

3.4.3 Metode Validasi

3.4.3.1 Akurasi (Kecermatan)

Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery) dengan menggunakan metode penambahan baku (the method of standard additives), yakni ke dalam tablet ditambahkan baku sebanyak 50% dari kadar yang diketahui terdapat dalam sampel, kemudian dianalisis dengan prosedur yang sama seperti pada sampel. Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut.

% 100 n ditambahka yang

baku kadar

B A Kembali

Perolehan

% = − ×

Keterangan:

A = kadar analit yang diperoleh setelah penambahan baku B = kadar analit sebelum penambahan baku (Ermer, 2005).

3.4.3.2 Presisi (Keseksamaan)

Presisi metode dinyatakan oleh simpangan baku relatif (Relative Standard Deviation/RSD) dari serangkaian data. RSD dapat dirumuskan sebagai berikut.

% 100 X SD

RSD = ×

Keterangan:

SD = standard deviation/simpangan baku

(42)

3.4.3.3 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Batas deteksi (Limit Of Detection/LOD) dan batas kuantitasi (Limit Of Quantitation/LOQ) dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut.

2 -n

Yi) Y

( 2

SY

= ∑ −

S SY 3,3

LOD = ×

S SY 10

LOQ = ×

Keterangan:

SY = simpangan baku residual

(43)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Identifikasi amoksisilin dan kalium klavulanat dilakukan dengan metode spiking yaitu dengan penambahan baku amoksisilin pada larutan baku campuran

amoksisilin dan kalium klavulanat yang telah dianalisis sebelumnya. Dari hasil kromatogram menunjukkan adanya peningkatan luas area amoksisilin. Hal ini menunjukkan kromatogram yang mengalami peningkatan luas area adalah amoksisilin sedangkan kromatogram yang tidak mengalami peningkatan luas area adalah kalium klavulanat. Kromatogram dapat dilihat pada Gambar 1 dan 2.

[image:43.612.133.506.414.733.2]

(44)

[image:44.612.128.502.60.365.2]

Gambar 3. Kromatogram analisis campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dengan kolom Shim-pack VP-ODS, fase gerak larutan dapar fosfat pH

[image:44.612.132.511.424.709.2]

Tahap pertama dilakukan analisis campuran amoksisilin dan kalium klavulanat baku dengan KCKT menggunakan kolom Shim-pack VP-ODS dan kondisi kromatografi menurut USP XXX (2007). Kromatogram dapat dilihat pada Gambar 3.

(45)

[image:45.612.132.540.414.610.2]

Tabel 1. Data hasil analisis amoksisilin dan kalium klavulanat baku pada berbagai

perbandingan komposisi fase gerak dan laju alir 2 ml/menit.

Kromatogram pada Gambar 3 menunjukkan hasil analisis yang cukup baik dengan resolusi 6,38; teoretical plate 2669 untuk amoksisilin dan 2501 untuk kalium klavulanat; waktu tambat 4,9 menit untuk amoksisilin dan 2,9 menit untuk kalium klavulanat.

Untuk mendapatkan waktu analisis yang relatif lebih singkat maka ditentukan perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol. Menurut penelitian yang dilakukan Nagaraju dan Kaza pada penetapan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat, analisis dilakukan dalam waktu yang relatif lebih singkat yaitu 5 menit. Data analisis campuran amoksisilin dan kalium klavulanat baku dengan KCKT menggunakan berbagai komposisi fase gerak pada laju alir 2 ml/menit dapat dilihat pada Tabel 1 dan kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 3.

Perbandingan

Fase Gerak Waktu Tambat Luas Puncak Theoretical Plate

Resolusi Dapar

Fosfat pH 4,4 (%)

Metanol (%)

Kalium Klavula

nat

Amoksi silin

Kalium

Klavulanat Amoksisilin

Kalium

98 2 4,633 9,193 643071 2741999 1467,550 1576,913 6,469 96 4 3,555 6,446 667042 2712624 1427,275 1431,872 5,467 94 6 3,015 5,009 666382 2706867 1392,643 1384,399 4,628 92 8 2,780 4,429 679084 2718066 1374,784 1247,684 4,114 91 9 2,586 3,948 666399 2736978 1346,643 1407,457 3,877 90 10 2,386 3,536 680856 2767703 1278,310 1205,748 3,414

(46)

[image:46.612.133.543.520.712.2]

Tabel 2. Data hasil analisis amoksisilin dan kalium klavulanat baku pada berbagai laju

alir dengan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol (91:9).

balik, konsentrasi metanol yang lebih besar akan mengakibatkan fase gerak semakin kuat sifat nonpolarnya sehingga proses elusi terjadi lebih cepat, oleh karena itu waktu tambat menjadi singkat (Snyder, 1979).

Efisiensi kolom pada HPLC dapat dilihat dari parameter theoretical plate pada setiap kromatogram dan daya pisah dapat dilihat dari parameter resolusi. Menurut USP XXX, theoretical plate setiap kromatogram dalam penetapan kadar tablet amoksisilin dan klavulanat secara simultan harus lebih besar dari 550 dan resolusi tidak lebih kecil dari 3,5. Dari hasil penelitian diperoleh perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 4,4–metanol yang terbaik untuk analisis adalah 91:9 dengan waktu tambat 3,9 menit untuk amoksisilin dan 2,6 menit untuk kalium klavulanat; teoretical plate 1346 untuk amoksisilin dan 1407 untuk kalium klavulanat; resolusi 3,88.

Selanjutnya dari fase gerak yang terpilih ditentukan laju alir yang optimal. Data analisis campuran amoksisilin dan kalium klavulanat baku dengan KCKT pada berbagai laju alir dengan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol (91:9) dapat dilihat pada Tabel 2 dan kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 4.

Laju Alir (ml/menit)

Tekanan (kgf/cm2)

Waktu Tambat Luas Puncak Theoretical Plate

Resolusi Kalium

Klavula nat

Amoksi silin

Kalium

(47)

[image:47.612.133.507.311.608.2]

Gambar 4. Kromatogram hasil analisis campuran amoksisilin dan kalium klavulanat baku dengan fase gerak dapar fosfat pH 4,4–metanol (91:9) dan laju alir 2 ml/menit

Sama seperti pada penentuan perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 4,4 dan metanol, parameter seperti waktu tambat, theoretical plate dan resolusi menjadi penentu pemilihan laju alir optimum. Dari hasil penelitian diperoleh laju alir yang terbaik untuk analisis adalah 2 ml/menit dengan waktu tambat 3,9 menit untuk amoksisilin dan 2,6 menit untuk kalium klavulanat; teoretical plate 1346 untuk amoksisilin dan 1407 untuk kalium klavulanat; resolusi 3,88.

Kromatogram hasil optimasi metode KCKT yang dilakukan terhadap campuran amoksisilin dan kalium klavulanat baku dengan fase gerak dapar fosfat pH 4,4–metanol (91:9) dan laju alir 2 ml/menit dapat dilihat pada Gambar 4.

(48)

[image:48.612.131.508.127.418.2]

Gambar 5. Kromatogram hasil analisis campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet Clavamox dengan fase gerak dapar fosfat pH 4,4–metanol (91:9) dan laju alir 2 ml/menit.

gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol (91:9) dan laju alir 2 ml/menit dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5 menunjukkan optimasi KCKT dengan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol (91:9) dan laju alir 2 ml/menit memberikan hasil optimal yang sama terhadap baku pembanding dengan waktu tambat 3,9 menit untuk amoksisilin dan 2,6 menit untuk kalium klavulanat; teoretical plate 1888 untuk amoksisilin dan 1691 untuk kalium klavulanat; resolusi 4,34.

(49)

[image:49.612.133.508.335.680.2]

Gambar 6. Kurva kalibrasi kalium klavulanat baku menggunakan KCKT dengan kolom Shim-Pack VP-ODS (4,6 x 250 mm), fase gerak larutan dapar fosfat pH 4,4-

Analisis kuantitatif ditentukan berdasarkan luas puncak karena kromatogram yang diperoleh tidak simetris. Pengukuran luas puncak tidak banyak dipengaruhi oleh kondisi kromatografi dibandingkan dengan tinggi puncak, kecuali laju alir. Oleh karena itu, pengukuran luas puncak merupakan pilihan yang terbaik dalam analisis kuantitatif secara KCKT (Poole, 2003).

(50)

[image:50.612.132.506.57.437.2]

Gambar 7. Kurva kalibrasi amoksisilin baku menggunakan KCKT dengan kolom Shim-Pack VP-ODS (4,6 x 250 mm), fase gerak larutan dapar fosfat pH 4,4-metanol (91:9) dan laju alir 2,0 ml/menit.

Dari kurva kalibrasi diperoleh hubungan yang linier antara luas puncak dan konsentrasi dengan koefisien korelasi, r = 0,9999 untuk kalium klavulanat dan amoksisilin. Koefisien korelasi ini telah memenuhi persyaratan yaitu lebih besar dari 0,999 (CMC CC, 1994).

(51)

Tabel 3. Hasil pengolahan data dari sediaan tablet campuran amoksisilin dan

kalium klavulanat

Kromatogram hasil penyuntikan larutan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat baku pada pembuatan kurva kalibrasi menunjukkan puncak yang melebar ke belakang (tailing). Parameter yang dapat digunakan sebagai indikator puncak yang tidak simetris yakni tailing factor. Tailing factor dari kromatogram penyuntikan amoksisilin dan kalium klavulanat baku untuk pembuatan kurva kalibarasi diperoleh berkisar dari 1,475 hingga 1,729 untuk amoksisilin dan 1,859 hingga 1,929 untuk kalium klavulanat. Hasil analisis ini masih dapat diterima karena tailing factor lebih kecil dari 2 (CMC CC, 1994).

Hasil pengolahan data dari sediaan tablet amoksisilin dan kalium klavulanat yang terdapat di perdagangan dapat dilihat pada Tabel 3.

No Nama Tablet Perlakuan

Kalium Klavulanat Amoksisilin

Luas Area

Kadar (%)

Luas Area

Kadar (%)

1 Tablet Generik (PT Indofarma)

1 2457623 92,4398 7674338 99,0904 2 2463655 91,9679 7669342 98,2611 3 2454383 94,1217 7676401 101,0523 4 2455063 95,4560 7663356 102,2785 5 2449870 92,1381 7731337 99,836 6 2453669 95,0232 7741037 102,9268

2 Tablet Claneksi (PT Sanbe)

[image:51.612.129.521.390.697.2] [image:51.612.132.523.392.698.2]

(52)

[image:52.612.127.522.77.320.2]

Tabel 4. Hasil penetapan kadar amoksisilin dan kalium klavulanat dalam berbagai sediaan tablet 3 Tablet Clavamox (PT Kalbe Farma)

1 2172067 92,5248 7678572 112,7025 2 2168783 92,0273 7698036 114,0103 3 2149864 90,6761 7612752 110,6534 4 2159629 90,9297 7654392 110,9173 5 2171574 91,1018 7704682 111,3795 6 2085395 90,9850 7604900 113,3436

4 Tablet Augmentin (PT Glaxo Smithkline Beecham)

1 2582257 97,3095 8311699 107,5263 2 2536487 95,7216 8229120 106,6437 3 2561923 98,4113 8334670 109,9390 4 2557315 97,4669 8275629 108,2986 5 2559851 97,9467 8237824 108,2150 6 2563159 95,8341 8257540 105,9994 Berdasarkan data pada Tabel 3 yang diolah menggunakan perhitungan statistik diperoleh kadar amoksisilin dan kalium klavulanat dalam sediaan tablet dengan nama dagang seperti pada Tabel 4 di bawah ini.

No Nama sediaan Kadar Kalium

Klavulanat (%)

Kadar Amoksisilin (%)

1 Tablet Generik (PT Indofarma) 5351 , 2 52445 ,

93 ± 100,5742±3,0142

2 Tablet Claneksi ® (PT Sanbe) 5458 , 2 8401 ,

92 ± 100,671±2,5007

3 Tablet Clavamox ®

(PT Kalbe Farma) 91,3741±1,2008 112,1678±2,2739

4

Tablet Augmentin® (PT Glaxo Smithkline

Beecham)

5457 , 2

(53)

Tabel 5. Data hasil pengujian akurasi dan presisi amoksisilin dengan metode

penambahan baku

Sediaan tablet amoksisilin dan kalium klavulanat yang ditentukan kadarnya berdasarkan luas area keseluruhannya memenuhi persyaratan yang ditetapkan USP XXX (2007) yaitu mengandung amoksisilin dan klavulanat tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 120,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.

Parameter validasi yang diuji adalah akurasi (kecermatan), presisi (keseksamaan), batas deteksi dan batas kuantitasi. Akurasi (kecermatan) metode dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery) yang ditentukan dengan menggunakan metode penambahan baku. Kromatogram hasil perolehan kembali dapat dilihat pada Lampiran 16. Presisi (kecermatan) dinyatakan dalam simpangan baku relatif. Data hasil pengujian akurasi dan presisi dapat dilihat pada Tabel 5 dan 6.

No. Analit yang ditambahkan

( g/ml) Luas Puncak

Perolehan Kembali (%)

1 252 11438921 99,1262

2 244 11453309 98,7748

3 248 11377394 99,0707

4 254 11476636 99,3357

5 254 11461869 98,9480

6 256 11505171 99,3029

Rerata perolehan kembali 99,0930

Simpangan baku (SD) 0,2130

[image:53.612.132.508.421.668.2]

(54)

Tabel 6. Data hasil pengujian akurasi dan presisi kalium klavulanat dengan

metode penambahan baku

No. Analit yang ditambahkan

( g/ml) Luas Puncak

Perolehan Kembali (%)

1 68 3614832 98,4162

2 66 3605623 100,5929

3 62 3536457 100,6418

4 70 3668019 99,9910

5 72 3685364 98,6044

6 72 3703305 100,0430

Rerata perolehan kembali 99,7148

Simpangan baku (SD) 0,9731

Simpangan baku relatif (RSD) 0,9759

Tabel 5 dan 6 menunjukkan bahwa rerata persen perolehan kembali yang diperoleh telah memenuhi syarat akurasi untuk validasi prosedur analitik karena rerata berada di antara rentang 98-102% yaitu 99,09% untuk amoksisilin dan 99,71% untuk kalium klavulanat. Simpangan baku relatif yang diperoleh telah memenuhi syarat presisi untuk validasi prosedur analitik karena lebih kecil dari 2% yaitu 0,22% untuk amoksisilin dan 0,98% untuk kalium klavulanat (Ermer, 2005).

Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh dalam kurva kalibrasi (Ermer and Burgess, 2005). Batas deteksi dan batas kuantitasi analisis amoksisilin yang diperoleh berturut-turut adalah 34,23 g/ml dan 103,74 g/ml. Sedangkan batas deteksi dan batas kuantitasi analisis kalium klavulanat yang diperoleh berturut-turut adalah 8,83 g/ml dan 26,75

[image:54.612.133.507.109.379.2]

(55)

(56)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Metode KCKT dengan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol dapat memisahkan campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet.

Perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol (91:9) dengan laju alir 2 ml/menit dapat menghasilkan pemisahan yang baik dengan waktu tambat 3,9 menit untuk amoksisilin dan 2,6 menit untuk kalium klavulanat; theoretical plate 1346 untuk amoksisilin dan 1407 untuk kalium klavulanat dengan resolusi

3,88 yang memenuhi persyaratan USP XXX (2007).

Hasil uji validasi metode KCKT pada penetapan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet secara simultan memberikan hasil akurasi dan presisi yang baik. Dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk penetapan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam tablet.

4.2 Saran

Disarankan agar dilakukan penelitian menggunakan perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 4,4-metanol 91:9 dan laju alir 2 ml/menit terhadap penetapan kadar campuran amoksisilin dan kalium klavulanat dalam bentuk sediaan lain seperti suspensi secara KCKT.

(57)

DAFTAR PUSTAKA

Ahuja, S. and M.W. Dong. (2005). Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC. Volume 7. New York: Elsevier Academic Press. Page 35.

Ahuja, S., and N. Jespersen. (2006). Comprehensive Analytical Chemistry. Volume 47. New York: Elsevier Academic Press. Page 7.

Berry, V., et.al. (2005). Comparative Bacteriological Efficacy of Pharmacokinetically Enhanced Amoxicillin-Clavulanate Againts Streptpcoccus pneumoniae with Elevated Amoxicillin MIC’s and Haemophilus influenza. Journal of Antimicrobial agent and Chemotherapy 49(3): 908-915.

Bliesner, D.M. (2006). Validating Chromatographic Methods A Practical Guide. New Jersey: John Wiley and Sons, Inc.. Page 1.

Borisy, A.A., P.J. Elliott, N.W. Hurst, M.S. Lee, J. Lehar, E.R. Price, G. Serbedzija, G.R. Zimmermann, M.A. Foley, B.R. Stockwell, C.T. Keith. (2003). Systematic Discovery of Multicomponent Therapeutics. Proc Natl Acad Sci USA. 10(13): 7977-82.

Brown, P. and K. DeAntonis. (1997). High-Performance Liquid Chromatography. In: F.A. Settle (eds). Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry. New Jersey: Prentice-Hall, Inc. Pages 149-154.

Caron, F., et.al. (1991). Effect of Amoxicillin-Clavulanate combination on the Motility of Small Intestine in Human Beings. Journal of Antimicrobial agent and Chemotherapy 35(6): 1085-88.

Chemistry Manufacturing Controls Coordinating Committee/CMC CC. (1994). Validation of Chromatographic Methods, Reviewer Guidance. Rockville: Center for Drug Evaluation and Research/CDER, Food and Drug Administration/FDA. Pages 12, 25.

Ditjen POM. (1995). Farmakope Indonesia. Edisi Keempat. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Hal 95-96.

Dolan, J.W. (2003). Why Do Peaks Tail?. LC GC North America 21(7): 612-616. Épshtein, N.A. 2004. Validation of HPLC Techniques for Pharmaceutical

Analysis. Pharmaceutical Chemistry Journal 38(4): 212-228.

(58)

Ermer, J. and C. Burgess (2005). Performance Parameters, Calculations and Tests: Detection and Quantitation Limit. In: J. Ermer and J.H. McB. Miller (eds). Method Validation in Pharmaceutical Analysis. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Page 101.

Finlay, J., L. Miller and J.A. Poupard. (2003). A Review of the Antimicrobial Activity of Clavulanate. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 52: 18-23.

Gelone, S. and J.A. O’Donnell. (2005). Anti-Infectives. In: D. Troy (ed). Remington the Science and Practice of Pharmacy. 21th Edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. Page 1638.

Hamilton, R.J. and P.A. Sewell. (1977). Introduction to High Performance Liquid Chromatography.Liverpool: Chapman and Hall, Ltd. Page 1, 53-54. Harmita. (2004). Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara

Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian I(3): 117-135.

Huber, L. (2007). Validation and Qualification in Analytical Laboratories, 2nd Edition. New York: Informa Healthcare USA, Inc.. Page 125.

Hinshaw, J.V. (2004). Anatomy of A Peak. LC GC North America 22(3): 252-260.

International Conference on Harmonisation/ICH. (1994). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1). ICH Harmonised Tripartite Guideline. Page 6.

Kazakevich, Y. and L. LoBrutto. (2007). Introduction. In: Y. Kazakevich and L. LoBrutto (eds). HPLC for Pharmaceutical Scientists. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. Page 18-19.

Kromidas, S. (2006). HPLC Made to Measure A Practical Handbook for Optimization. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA. Pages 19-20.

McMaster, M.C. (2007). HPLC A Practical User’s Guide, 2nd Edition. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. Page 106.

Methews, K.H. (2001). Antimicrobial Drug Use and Veterinary Cost in US Livestock Production. Agriculture Information Bulletin 766: 1-6.

(59)

Miller, J.N. and J.C. Miller (2005). Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5th Edition. Pearson Education, Ltd. page 116.

Nagaraju, R. and Kaza, R. (2008). Stability Evaluation of Amoxicillin and Potassium Klavulanate Tablets USP by Accelerated Studies. Turk Journal Pharmaceutical Science. 5 (3): 201-214.

Olano, D.G., et.al. (2007). Selective Sensitization to Clavulanic Acid and Penicillin V. J Invstig allergol Clin Immunol. 17(2): 119-21.

Ornaf, R.M. and M.W. Dong. (2005). Key Concepts of HPLC in Pharmaceutical Analysis. In: S. Ahuja and M.W. Dong (eds). Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC. San Diego: Elsevier, Inc. Pages 22-29.

Poole, C.F. (2003). The Essence of Chromatography. Amsterdam: Elsevier Science B.V. Page 68-69.

Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Cetakan Pertama. Yogyakarta. Pustaka Pelajar. Halaman 465-469.

Snyder, L.R. and J.J. Kirkland. (1979). Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd Edition. New York: John Wiley & Sons, Inc. Pages 52, 250.

Unal, K., et.al. (2008). Spectrophotometric Determination of Amoxicillin in Pharmaceutical Formulations. Journal of Pharmacy Science. 5(1): 1-16. United States Pharmacopeial Convention. (2006). The United States

Pharmacopeia (USP), 30th Edition. United States. Page 680.

United States Pharmacopeia. (2007). The National Formulary. 30th Edition . The United States Pharmacopeial Convention. Page 1407.

(60)

Seperangkat instrumen KCKT (Shimadzu Corp.) dan komputer (Hewlett-Packard) sebagai perangkat pendukung

Syringe 100 l

[image:60.612.162.459.97.633.2]

(61)

Lampiran 2. Gambar Perangkat Pendukung Penelitian Lainnya

Pompa vakum (Gast DOA-P604-BN) serta seperangkat penyaring sampel dan fase gerak (Whatman Ltd.)

[image:61.612.162.462.129.586.2]

(62)

Perbandingan fase gerak larutan dapar fosfat pH 4,4 dan metanol (96:4) dengan tekanan 151 kgf/cm2

(63)

(64)

Lampiran 3. (lanjutan)

(65)

Laju alir 1,0 ml/menit dengan tekanan 86 kgf/cm2

(66)

(67)

(68)

Lampiran 4. (lanjutan)

Kromatogram di atas merupakan hasil penyuntikan larutan amoksisilin dan kalium klavulanat baku dalam upaya mencari laju alir yang optimal untuk analisis menggunakan KCKT dengan kolom Shim-Pack VP-ODS (4,6 x 250 mm), volume penyuntikan 20 l, perbandingan fase gerak larutan dapar fosfat pH 4,4-metanol (91:9), laju alir 2,0 ml/menit, detektor UV pada panjang gelombang 220 nm dan sensitifitas 1,000 AUFS.

(69)

Lampiran 5. Kromatogram Hasil Penyuntikan Larutan Amoksisilin dan Kalium Klavulanat Baku pada Pembuatan Kurva Kalibrasi

Penyuntikan larutan amoksisilin dan kalium klavulanat baku dengan konsentrasi masing-masing 50 g/ml dan 100 g/ml