PENGARUH PAPARAN ASAP ROKOK ELEKTRIK TERHADAP MOTILITAS, JUMLAH SEL SPERMA dan KADAR MDA TESTIS MENCIT JANTAN (Mus musculus, L.)
TESIS
Oleh DARWIN KARIM
087008002 / BM
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIK
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
PENGARUH PAPARAN ASAP ROKOK ELEKTRIK TERHADAP MOTILITAS, JUMLAH SEL SPERMA dan KADAR MDA TESTIS MENCIT JANTAN (Mus musculus, L.)
TESIS
Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Magister Biomedik Dalam Program Studi Ilmu Biomedik
Pada Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
OLEH DARWIN KARIM
087008002
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIK
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
Judul : PENGARUH PAPARAN ASAP ROKOK ELEKTRIK TERHADAP MOTILITAS, JUMLAH SEL SPERMA dan KADAR MDA TESTIS MENCIT JANTAN
(Mus musculus, L.). Nama Mahasiswa : Darwin Karim
NIM : 087008002
Program Studi : Ilmu Biomedik
Menyetujui, Komisi Pembimbing
(Prof.Dr.Drs.Syaruddin Ilyas, M.Biomed) (dr.Dedi Ardinata, M.Kes, AIFM) Ketua Anggota
Ketua Program Studi, Dekan,
(dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D) (Prof. Dr. Gontar A. Siregar, Sp.PD, KGEH )
Telah diuji pada Tanggal : 17 Juni 2011
__________________________________________________________________
PANITIA PENGUJI TESIS
Ketua : Prof.Dr.Drs.Syafruddin Ilyas, M.Biomed Anggota : 1. dr.Dedi Ardinata, M.Kes, AIFM
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap motilitas, jumlah sel sperma dan kadar MDA testis mencit jantan (Mus musculus, L.). Penelitian ini memakai mencit jantan dewasa (Mus musculus, L.) sebanyak 30 ekor yang dibagi dalam 3 kelompok perlakuan. Kelompok pertama sebagai kelompok kontrol yang tidak mendapatkan paparan asap rokok elektrik. Kelompok kedua mendapatkan paparan asap rokok elektrik jenis A (rasa rokok tambahan / strawberry) selama 15 hari dan kelompok ketiga mendapatkan paparan asap rokok elektrik jenis B (rasa rokok konvensional / gudang garam) selama 15 hari. Hasil yang didapat menunjukkan adanya perbedaan yang nyata pada motilitas sperma kelompok yang mendapat paparan asap rokok elektrik jenis A dan B (p<0,05) dibandingkan dengan kelompok kontrol dan pada jumlah sperma didapati hasil yang berbeda nyata pada kelompok yang mendapat paparan asap rokok elektrik jenis B dibandingkan dengan kelompok kontrol tetapi kelompok yang mendapat paparan asap rokok elektrik jenis A hasilnya berbeda tidak nyata dengan kelompok kontrol. Kadar MDA testis kelompok mencit yang dipapari asap rokok elektrik jenis A dan B didapati hasil yang berbeda tidak nyata dengan kelompok kontrol (p>0,05) walaupun menunjukkan adanya sedikit perbedaan. Paparan asap rokok elektrik memberikan pengaruh negatif terhadap kemampuan reproduksi mencit dan hal ini kemungkinan dicetuskan oleh adanya produk radikal bebas yang dihasilkan oleh asap rokok elektrik.
ABSTRACT
This study aims to determine the influence of an electric cigarette smoke exposure on motility, the number of sperm cells and testicular MDA levels of male mice (Mus musculus, L.). This study using adult male mice (Mus musculus, L.) as many as 30 individuals who were divided into 3 treatment groups. The first group as a control group who did not get an electric cigarette smoke exposure. The second group get the electric cigarette smoke exposure type A (extra smoke flavor/strawberry) for 15 days and the third group to get exposure to cigarette smoke electric type B (conventional cigarettes taste/gudang garam) for 15 days. The results showed significant differences in sperm motility groups that receive electric cigarette smoke exposure types A and B (p<0.05) compared with the control group and in sperm count was found significantly different results in the group that received an alectric cigarette smoke exposure type B compared with the control group but the group that received exposure to cigarette smoke electric type A results are insignificantly different from the control group. Testicular MDA levels of group of mice that exposure electric cigarette smoke type A and B found no significantly different results with the control group (p>0.05). although showing slight differences. Exposure to cigarette smoke electrically negatively impact reproductive ability of mice and this was probably triggered by the presence of free radical products generated by the electric cigarette smoke.
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT atas rahmah dan berkah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dengan judul
”Pengaruh Paparan Asap Rokok Elektrik Terhadap Motilitas, Jumlah Sel Sperma dan Kadar MDA Testis Mencit Jantan (Mus Musculus, L.)”. Tesis ini merupakan
salah satu syarat dalam rangka menyelesaikan program pendidikan Magister Ilmu Biomedik pada Fakultas Kedokteran, USU Medan.
Selama proses pelaksanaan penelitian hingga selesainya tesis ini, penulis
memperoleh banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak Prof.Dr.dr.Syahril Pasaribu, DTM&H, MSc(CTM), Sp.A (K) selaku Rektor USU Medan beserta seluruh jajarannya.
2. Bapak Prof. dr. Gontar A. Siregar, Sp.PD, KGEH, selaku Dekan Fakultas
Kedokteran USU Medan beserta seluruh jajarannya.
3. Ibu dr. Yahwardiah Siregar, Ph.D, selaku Ketua Program Studi Ilmu Biomedik, Fakultas Kedokteran, USU Medan beserta seluruh jajarannya.
4. Bapak Prof. Dr. Drs. Syafruddin Ilyas, M.Biomed dan Bapak dr. Dedi Ardinata, M.Kes, AIFM, yang bersedia meluangkan banyak waktu, masukan
dan pemikirannya sebagai dosen pembimbing selama penyusunan tesis ini. 5. Dosen pembanding, Prof.Dr.Drs.Herbert Sipahutar, M.Sc, MS dan dr.Amira
Permata Sari Tarigan, Sp.P.
7. Ketua Program Studi Ilmu Keperawatan (PSIK) Universitas Riau, Bapak
Erwin, S.Kp, M.Kep beserta seluruh jajarannya. 8. Kedua orang tua dan ayah serta ibu mertua penulis.
9. Istri dan anak-anak penulis tercinta (Mela Fiyayanti Siregar, AMK,
M.Shahreza dan Zhurara Najjawfa) untuk dukungan dan do’anya kepada penulis serta kesabarannya untuk ditinggal sementara waktu oleh penulis.
10.Bapak Esmaulana Harahap dan Ibu Hafni Nasution sekeluarga atas segala bantuan dan motivasinya kepada penulis serta perhatiannya kepada keluarga penulis saat penulis meninggalkan istri dan anak-anak penulis selama
mengikuti pendidikan.
11.Om Budi, Bu Fitri, Bayu, Mayang Sari, Gita atas fasilitasnya kepada penulis.
12.Advennius Ginting, Juliadi Irwansyah Ritonga, Sugiono, Triswanto, Rudi Abadi Panjaitan, atas segala bantuan langsung maupun tidak langsung selama penulis mengikuti pendidikan.
13.Seluruh teman - teman seangkatan penulis.
Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk kesempurnaan tesis ini. Demikian tesis ini disampaikan semoga dapat bermanfaat
bagi ilmu pengetahuan.
Medan, Juni 2011 Penulis
RIWAYAT HIDUP
A. Identitas Diri
Nama : Darwin Karim
Tempat / Tanggal Lahir : Labuhan Bilik / 10 Juli 1977
Agama : Islam
Status : Menikah
Istri : Mela Fiyayanti Siregar, AMK
Anak : M.Shahreza, Zhurara Najjawfa
Alamat Kantor : Program Studi Ilmu Keperawatan UR, Jl.Kapt.Pattimura, No. 9, Gedung G, Kampus Universitas Riau, Pekanbaru
B. Riwayat Pendidikan
1984-1990 : SD Negeri No.112143 Rantauprapat 1990-1993 : SMP Negeri 2 Rantauprapat
1993-1996 : SMA Negeri 1 Rantauprapat
1996-1999 : Akademi Keperawatan Pemda Tk.II Labuhanbatu, Rantauprapat 2001-2003 : Program Studi Ilmu Keperawatan/Ners, FK USU, Medan
2008-2011 : Program Studi Magister Ilmu Biomedik, FK USU, Medan
C. Riwayat Pekerjaan
2004-2006 : Staf Pengajar Tetap Akademi Keperawatan Payung Negeri,
Pekanbaru
DAFTAR ISI
1.1.Latar Belakang ……….
1.2.Perumusan Masalah ………..
1.3.Kerangka Konsep ……….
1.4.Tujuan Penelitian ... 1.4.1. Tujuan Umum... 1.4.2. Tujuan Khusus... 1.5.Hipotesis... 1.6.Manfaat Penelitian...
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.2.1. Pengertian ... 2.2.2. Sejarah Rokok Elektrik ... 2.2.3. Kimiawi Asap Rokok Elektrik ... 2.2.4. Efek Rokok Elektrik Terhadap Kesehatan ... 2.3. Fisiologi Reproduksi Mencit Jantan ...
2.3.1. Testis ... 2.3.2. Struktur Sel Spermatozoa ... 2.3.3. Spermatogenesis ... 2.4. Radikal Bebas ... 2.5. Malondialdehyde ... 2.6. Mekanisme Kerja Radikal Bebas, Peoksidasi Lipid dan
Malondialdehyde ...
BAB 3. METODE PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian... 3.2. Variabel Penelitian ... 3.2.1. Variabel Independen ... 3.2.2. Variabel Dependen ... 3.3. Defenisi Operasional ... 3.4. Bahan dan Alat penelitian ... 3.4.1. Bahan Penelitian ... 3.4.2. Peralatan Utama Penelitian ... 3.5. Disain Penelitian ... 3.6. Pelaksanaan Penelitian ... 3.6.1. Pemeliharaan Hewan Coba ... 3.6.2. Perlakuan Hewan Coba ... 3.6.3. Pengamatan ... 3.7. Analisa Data dan Pengujian Hipotesis ... 3.8. Jadwal Penelitian ...
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian ... 4.1.1. Motilitas Sperma Mencit ... 4.1.2. Jumlah Sperma Mencit ……… 4.1.3. Kadar MDA Testis ……….. 4.2. Pembahasan ……….. 4.2.1. Motilitas Sperma Mencit ………. 4.2.2. Jumlah Sperma Mencit ……… 4.2.3. Kadar MDA Testis Mencit ………..
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1..Kesimpulan ………… ………...
5.2. Saran ……….
DAFTAR PUSTAKA ...……….
37 37 38 39 40 40 41 41
43 43
DAFTAR TABEL
No.Tabel Judul Halaman
1 Hasil Analisa Cartridge Rokok Elektrik ... 14
2 Komposisi Cairan dan Asap Rokok Elektrik ... 15
3 Persiapan Standar MDA Spektrofotometer ... 35
4 Jadwal Penelitian ... 36
5 Rata-Rata Persentase Motilitas Sperma ... 37
6 Rata-Rata Jumlah Sperma ... 38
DAFTAR GAMBAR
No.Gambar Judul Halaman
1 Kerangka Teori Pengaruh Paparan Asap Rokok Elektrik Terhadap Motilitas, Jumlah Sel Sperma dan Kadar MDA Testis Mencit ...
6
2 Rokok Elektrik dan Cartridge Rokok Elektrik ... 12
3 Struktur Rokok Elektrik ... 12
4 Satu Set Lengkap Rokok Elektrik ... 27
5 Cartridge Rokok Elektrik ... 27
6 Spuit Naso Gastric Tube Ukuran 60 mL ... 27
7 Discofix – 3 (tree way) ... 27
8 Alat Hisap dan Pompa Asap Rokok Elektrik ... 28
9 Kandang Perlakuan ... 28
10 Kandang Pemeliharaan ... 28
11 Spektrofotometer ... 28
12 Sentrifuge ... 28
13 Vortex Mixer ... 29
14 Water Bath ... 29
15 Cara Pemaparan Rokok Elektrik ... 31
16 Kamar Hitung Improved Neubauer ... 33
DAFTAR LAMPIRAN
No.Lampiran Judul Halaman
1 Hasil Pengolahan Data Secara Statistik ... 48 2 Rekomendasi Persetujuan Etik Penelitian
Kesehatan ………
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap motilitas, jumlah sel sperma dan kadar MDA testis mencit jantan (Mus musculus, L.). Penelitian ini memakai mencit jantan dewasa (Mus musculus, L.) sebanyak 30 ekor yang dibagi dalam 3 kelompok perlakuan. Kelompok pertama sebagai kelompok kontrol yang tidak mendapatkan paparan asap rokok elektrik. Kelompok kedua mendapatkan paparan asap rokok elektrik jenis A (rasa rokok tambahan / strawberry) selama 15 hari dan kelompok ketiga mendapatkan paparan asap rokok elektrik jenis B (rasa rokok konvensional / gudang garam) selama 15 hari. Hasil yang didapat menunjukkan adanya perbedaan yang nyata pada motilitas sperma kelompok yang mendapat paparan asap rokok elektrik jenis A dan B (p<0,05) dibandingkan dengan kelompok kontrol dan pada jumlah sperma didapati hasil yang berbeda nyata pada kelompok yang mendapat paparan asap rokok elektrik jenis B dibandingkan dengan kelompok kontrol tetapi kelompok yang mendapat paparan asap rokok elektrik jenis A hasilnya berbeda tidak nyata dengan kelompok kontrol. Kadar MDA testis kelompok mencit yang dipapari asap rokok elektrik jenis A dan B didapati hasil yang berbeda tidak nyata dengan kelompok kontrol (p>0,05) walaupun menunjukkan adanya sedikit perbedaan. Paparan asap rokok elektrik memberikan pengaruh negatif terhadap kemampuan reproduksi mencit dan hal ini kemungkinan dicetuskan oleh adanya produk radikal bebas yang dihasilkan oleh asap rokok elektrik.
ABSTRACT
This study aims to determine the influence of an electric cigarette smoke exposure on motility, the number of sperm cells and testicular MDA levels of male mice (Mus musculus, L.). This study using adult male mice (Mus musculus, L.) as many as 30 individuals who were divided into 3 treatment groups. The first group as a control group who did not get an electric cigarette smoke exposure. The second group get the electric cigarette smoke exposure type A (extra smoke flavor/strawberry) for 15 days and the third group to get exposure to cigarette smoke electric type B (conventional cigarettes taste/gudang garam) for 15 days. The results showed significant differences in sperm motility groups that receive electric cigarette smoke exposure types A and B (p<0.05) compared with the control group and in sperm count was found significantly different results in the group that received an alectric cigarette smoke exposure type B compared with the control group but the group that received exposure to cigarette smoke electric type A results are insignificantly different from the control group. Testicular MDA levels of group of mice that exposure electric cigarette smoke type A and B found no significantly different results with the control group (p>0.05). although showing slight differences. Exposure to cigarette smoke electrically negatively impact reproductive ability of mice and this was probably triggered by the presence of free radical products generated by the electric cigarette smoke.
BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Merokok merupakan suatu masalah kesehatan pada masyarakat dan merupakan ancaman besar bagi kesehatan di dunia (Emmons, 1999). Merokok memberikan
implikasi terhadap berbagai faktor utama resiko penyakit, seperti misalnya penyakit paru obstruktif kronik, emphisema dan berbagai penyakit jantung. Jumlah angka kematian akibat merokok jika pola merokok tetap berlanjut,
diperkirakan akan menjadi sekitar 10.000.000 orang per tahun pada tahun 2020, dan 70% diantaranya akan terjadi di negara-negara berkembang di berbagai
belahan dunia (World Health Organization, 2003).
Asap rokok yang dihirup seorang perokok, mengandung komponen gas dan partikel. Komponen gas sangat berpotensi untuk menimbulkan radikal bebas,
yang diantaranya terdiri dari karbon monoksida, karbondioksida, oksida dari nitrogen dan senyawa hidrokarbon. Sedangkan komponen partikel beberapa diantaranya terdiri dari tar, nikotin, benzopiren, fenol, dan cadmium (Zavos et all.,
1998).
Radikal bebas adalah molekul yang mempunyai atom dengan elektron yang
Kelebihan produksi radikal bebas atau oksigen yang reaktif (ROS, reactive
oxygen species) dapat merusak sperma, dan ROS telah diketahui sebagai salah satu penyebab infertilitas. Diketahui juga bahwa anion superoksida, radikal hidroksil dan hidrogen peroksida merupakan beberapa ROS utama yang terdapat
pada plasma semen (Agarwal et all., 2003).
Radikal bebas terdapat secara fisiologis pada sperma manusia (Zavos et all.,
1998), dan timbulnya radikal bebas dalam tubuh diimbangi dengan mekanisme pertahanan endogen, dengan memproduksi zat yang mempunyai pengaruh sebagai anti radikal bebas yang disebut antioksidan (Suryohudoyo, 2000). Akan tetapi,
pada saat level ROS meningkat melebihi dari sistem pertahanan antioksidan tubuh, terjadilah stress oksidatif (Moller et all., 1996; Sharma dan Agarwal, 1996;
Saleh et all., 2003).
Stress oksidatif merupakan kondisi dimana terjadi peningkatan ROS yang akan menyebabkan kerusakan sel, jaringan atau organ (Moller et all., 1996;
Sharma dan Agarwal, 1996; Saleh et all., 2003). Pada kondisi stres oksidatif, radikal bebas akan menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid membran sel dan merusak organisasi membran sel. Membran sel ini sangat penting bagi fungsi
reseptor dan fungsi enzim, sehingga terjadinya peroksidasi lipid membran sel oleh radikal bebas dapat mengakibatkan hilangnya fungsi seluler secara total (Evans,
2000; Singh, 1992). Stress oksidatif menyebabkan infertilitas melalui efek negatifnya ke spermatozoa seperti peningkatan hilangnya motilitas, peningkatan kerusakan membran, penurunan morfologi, viabilitas, dan kemampuan
Sebuah studi menyatakan bahwa merokok meningkatkan ROS dan
menurunkan antioksidan di cairan semen (Saleh et all., 2003) sehingga seorang perokok lebih rentan mengalami infertilitas karena meningkatnya produksi radikal bebas di dalam sperma (Agarwal dan Said, 2005), menyebabkan
kerusakan deoxyribonucleic acid (DNA) dan apoptosis sel sperma (Vine et all., 1996). Radikal bebas yang berasal dari partikel gas rokok juga menyebabkan
terjadinya aglutinasi sperma sehingga berakibat terhadap menurunnya motilitas sperma (Agarwal et all., 2003).
Peroksidasi lipid adalah mekanisme dari trauma sel, baik pada tumbuhan
ataupun hewan, dengan demikian peroksidasi lipid digunakan sebagai indikator dari stress oksidatif pada sel dan jaringan (Mc Kee dan Mc Kee, 2003).
Salah satu senyawa yang dihasilkan oleh pemecah lipid peroksida adalah malondialdehyde (MDA). MDA terbentuk akibat degradasi radikal bebas OH terhadap asam lemak tak jenuh, yang nantinya ditransportasi menjadi radikal
bebas yang sangat reaktif (Suryohudoyo, 2000), sehingga pengukuran MDA sering digunakan sebagai indikator peroksidasi lipid jaringan (Mc Kee dan Mc Kee, 2003).
Pada tahun 2004, sebuah perusahaan di Beijing, China, bernama Ruyan Grup, mengembangkan, mempatenkan dan meluncurkan produk rokok yang disebut
sebuah cartridge dan memiliki sensor (Action on Smoking & Health Scotland,
2009).
Analisa yang dilakukan oleh Westenberger dari bagian Pusat Evaluasi Obat-Obatan dan Divisi Penelitian Analisa Farmasi Badan Pengawas Makanan dan
Obat Amerika (FDA) menunjukkan hasil bahwa cartridge pada rokok elektrik memiliki kandungan bahan karsinogen, termasuk nitrosamin, bahan-bahan kimia
toksik seperti dietheline glikol dan komponen bahan spesisfik tembakau anabasine, myosmine, dan beta-nicotyrine yang diduga dapat membahayakan manusia (Westenberger, 2009).
Menurut Laugesen, direktur pelaksana Health New Zealand Ltd, sebuah perseroan terbatas yang berfokus pada bidang penelitian dan pemberian kebijakan
/ nasehat tentang penyakit jantung, kanker serta merokok dalam sebuah laporannya tentang hasil kandungan cartridge rokok elektrik menyimpulkan bahwa rokok elektrik lebih aman dan memiliki hanya sedikit efek toksik
dibanding rokok tradisional (Laugesen, 2008). Akan tetapi, belum ada data yang dipublikasikan secara ilmiah terkait dengan keamanan penggunaan rokok elektrik (American Legacy Foundation, 2009) dan WHO menyatakan pula bahwa rokok
elektrik belum terbukti aman untuk digunakan serta mengundang para ahli untuk melakukan analisa klinis dan analisa toksisitas terhadap rokok elektrik (World
Health Organization, 2008).
Masih sangat sedikit yang diketahui tentang keamanan penggunaan rokok elektrik terhadap berbagai aspek fisiologis manusia dan juga sangat sedikit sekali
Zaatari, 2010) dan sampai sejauh ini, penulis belum menemukan penelitian dan
perhatian khusus tentang rokok elektrik dan pengaruhnya terhadap kuantitas dan kualitas sperma dan di samping itu juga adanya rasa keingintahuan apakah rokok elektrik mempunyai potensi untuk menimbulkan stress oksidatif yang akan
mencetuskan produksi radikal bebas, mengingat bahwa rokok elektrik sangat berbeda dibandingkan dengan rokok konvensional (kandungan dan cara
penggunaannya).
Berdasarkan uraian di atas, rokok konvensional memiliki pengaruh terhadap kualitas dan kuantitas sel sperma mencit serta meningkatkan produksi radikal
bebas, tetapi belum dapat disimpulkan apakah rokok elektrik juga memiliki potensi untuk mencetuskan timbulnya radikal bebas dan mengganggu fungsi
normal sel sperma. Maka, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui bagaimana pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap motilitas, jumlah sel sperma dan kadar MDA testis mencit jantan (Mus musculus, L.).
1.2. Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian di atas, dapat dirumuskan masalah : bagaimana pengaruh
paparan asap rokok elektrik terhadap motilitas, jumlah sel sperma dan kadar MDA testis mencit jantan (Mus musculus, L.).
1.3. Kerangka Konsep
Rokok konvensional menginduksi stres oksidatif, mencetuskan produksi
spermatogenesis dan merusak morfologi spermatozoa sehingga mengakibatkan
penurunan fungsi sperma dan akhirnya mengakibatkan keadaan infertilitas. Tetapi belum diketahui apakah paparan asap rokok elektrik juga menimbulkan pengaruh yang sama seperti yang ditimbulkan oleh rokok konvensional.
Paparan asap rokok elektrik
Radikal bebas (stres oksidatif)?
Peroksidasi lipid ?
Motilitas sperma ? Jumlah sperma ?
Kadar MDA ?
Gambar 1. Kerangka teori pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap motilitas, jumlah sel sperma dan kadar MDA testis mencit
1.4. Tujuan Penelitian 1.4.1.Tujuan umum
Untuk mengetahui bagaimana pengaruh paparan asap rokok elektrik
terhadap kualitas, kuantitas sel sperma dan kadar MDA testis mencit.
1.4.2.Tujuan khusus
1.4.2.1. Untuk mengetahui apakah ada pengaruh paparan asap rokok elektrik
1.4.2.2. Untuk mengetahui apakah ada pengaruh paparan asap rokok elektrik
terhadap jumlah sel sperma mencit.
1.4.2.3. Untuk mengetahui apakah ada pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap kadar MDA testis mencit.
1.5. Hipotesis
1.5.1. Ha : Ada pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap motilitas sel sperma mencit.
Ho : Tidak ada pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap motilitas sel
sperma mencit.
1.5.2. Ha : Ada pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap jumlah sel
sperma mencit.
Ho : Tidak ada pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap jumlah sel sperma mencit.
1.5.3. Ha : Ada pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap kadar MDA testis mencit.
Ho : Tidak ada pengaruh paparan asap rokok elektrik terhadap kadar MDA
testis mencit.
1.6. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan memberi informasi dan manfaat ilmiah bagi ilmu kesehatan serta ilmu kedokteran dan juga dapat dijadikan referensi bagi
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Rokok Konvensional 2.1.1. Pengertian
Rokok adalah hasil olahan tembakau terbungkus termasuk cerutu atau bentuk
lainnya yang dihasilkan dari tanaman nicotina tabacum, nicotina rustica dan spesies lainnya atau sintetisnya yang mengandung nikotin dan tar dengan atau tanpa bahan tambahan, sedangkan nikotin adalah zat, atau bahan senyawa
pirrolidin yang terdapat dalam nikotiana tabacum, nicotiana rustica dan spesies lainnya atau sintetisnya yang bersifat adiktif dapat mengakibatkan ketergantungan
dan tar adalah senyawa polinuklir hidrokarbon aromatika yang bersifat karsinogenik (Peraturan Pemerintah Republik Indonesia Nomor.19, 2003).
2.1.2. Sepintas sejarah rokok
Tembakau sebagai bahan utama rokok telah digunakan oleh manusia lebih kurang pada 18.000 tahun yang lampau dan pertama sekali diolah sekitar 5000 – 7000 tahun yang lalu (Burns, 2007). Sekitar 1500 tahun lalu, beberapa rumpun
kesukuan di Amerika sebenarnya sudah mengolah tembakau menjadi beberapa bentuk lain yang digunakan sebagai bahan pengobatan dan juga termasuk untuk
penggunaan dalam ritual kepercayaan di suku mereka (Burns, 2007). Meskipun lebih dulu tembakau dikenal dan sudah diolah oleh penduduk pribumi Amerika, tetapi penemuan tembakau diklaim juga oleh beberapa kultur
Pada tahun 600 Masehi, seorang filosof Cina bernama Fang Yizhi mulai
menyebutkan bahaya kebiasaan merokok dalam jangka waktu yang lama akan dapat merusak paru. Tahun 1729 tercatat sebagai tahun pertama tentang adanya aturan tertulis melarang merokok di tempat-tempat ibadah di negara Bhutan. Pada
tahun 1761, dilakukan studi pertama tentang dampak merokok dan di tahun 1950 diterbitkan dua publikasi utama tentang hasil penelitian dampak merokok bagi
kesehatan, serta di tahun 1981 dilakukan penelitian besar tentang dampak merokok pasif oleh Hirayama di Jepang (Aditama, 2000).
2.1.3. Kandungan rokok konvensional
Rokok menghasilkan bahan-bahan kimia yang bersifat toksis, baik yang bersifat gas maupun bukan gas. Sebagian zat kimia bentuk gas yang bersifat toksis
dalam asap rokok antara lain : karbon monoksida, asetaldehida, nitrogen oksida, hidrogen sianida, akrolein, amoniak, formaldehid, piridina, akrilonitril, 2-nitripropan, hidrazina, uretan, dimentilnitrosamina, vinil klorida, dan berbagai
senyawa nitrosamin lainnya (Fajriwan, 1999).
Karbon monoksida merupakan salah satu komponen gas hasil pembakaran rokok yang paling berbahaya. Daya ikatnya dengan hemoglobin 230 kali lebih
kuat dibandingkan daya ikat zat asam sehingga dengan sejumlah besar ikatan COHb yang beredar, maka sel-sel jaringan dan organ tubuh menjadi kekurangan
zat asam (Fajriwan, 1999).
Partikel bukan gas dalam asap rokok antara lain tar, nikotin, uap air (Fajriwan, 1999), benzopiron, fenol, dan cadmium (Zavos et all., 1998). Tar merupakan
dari zat kimia, diantaranya golongan nitrosamin, amin aromatik, senyawa alkan,
asam karboksilat, logam (NI, As, Ra, Pb), selain itu juga sisa insektisida dan bambu-bambu tembakau dimana keseluruhan zat-zat di atas bersifat karsinogenik sehingga para perokok menghadapi resiko lebih besar menderita kanker
(Fajriwan, 1999).
2.1.4. Efek rokok konvensional terhadap kesehatan
Efek farmakologi nikotin terhadap berbagai sistem antara lain, sistem kardiovaskuler : meningkatkan tekanan darah, vasokonstriksi di kulit, takikardia; efek farmakologi nikotin terhadap sistem saraf otonom : stimulasi singkat yang
diikuti depresi seluruh ganglia; efek farmakologi nikotin terhadap kelenjar adrenal : pengeluaran adrenalin; efek farmakologi nikotin terhadap susunan saraf pusat :
stimulasi pusat muntah, vasomotor dan respirasi; efek nikotin juga akan berpengaruh terhadap pelepasan ADH, meninggalkan asam lemak bebas dalam serum serta meninggikan daya pengelompokan trombosit (Subroto, 1990).
Nikotin juga dapat mengiritasi faring dan bronkus, menyebabkan bronkitis kronik dan emfisema, kekerapan pneumoni pasca bedah yang meninggi, infark miokard, iskemia oleh karena sklerosis koroner dini, penyakit Buerger, mortalitas
ulkus peptikum meningkat, gangguan pertumbuhan janin, meningkatkan mortalitas prenatal, dan berbagai insiden terhadap timbulnya karsinoma (Subroto,
1990).
Efek bahan kimia rokok terhadap sistem reproduksi menunjukkan adanya gangguan spermatogenesis pada mencit (Bizzaro et all., 2003), menghambat sel
merugikan proses spermatogenesis dan fertilisasi sperma (Yamamoto et all.,
1998; Reddy et all., 1995), densitas, motilitas, viabilitas dan persentase normal morfologi sperma yang rendah (Merino et all., 1998; Chia et all., 1994).
2.2. Rokok Elektrik 2.2.1. Pengertian
Rokok elektrik terlihat dan berfungsi seperti rokok konvensional biasa, akan tetapi tidak membakar sejumlah tembakau. Rokok elektrik secara umum memiliki baterai dan perangkat elektronik yang memproduksi asap atau semacam kabut.
Kandungannya selalu berisi nikotin tetapi ada juga yang tidak memiliki kandungan nikotin sama sekali dan berisi propilen glikol (American Legacy
Foundation, 2009).
Asap yang dihasilkan rokok elektrik dihirup sebagaimana layaknya merokok konvensional dan sejumlah asap dilepaskan tetapi tidak berupa asap rokok.
Beberapa jenis rokok elektrik juga mempunyai sejenis lampu kecil yang akan menyala pada saat rokok elektrik dihisap, menyerupai pembakaran yang terjadi pada rokok konvensional. Nikotin tersimpan di dalam beberapa jenis cartridge
dan cartridge tersebut juga selalu memiliki kandungan zat kimia dan rasa tambahan, seperti misalnya rasa buah, coklat, permen dan kopi sehingga
menghasilkan perbedaan rasa pada saat dihisap (Action on Smoking & Health Scotland, 2009). Cartridge dapat selalu diisi ulang dan isi ulang tersebut merupakan bagian dari perangkat rokok elektrik (American Legacy Foundation,
merupakan suatu baterai yang dapat diisi ulang kembali (Westenberger, 2009) dan
saat dioperasikan, akan timbul panas yang dihasilkan oleh tenaga baterai yang selanjutnya akan memanaskan sejumlah cairan yang tersimpan di dalam cartridge untuk memproduksi asap yang akan dihisap oleh pengguna (Wollsheid dan
Kremzner, 2009).
Terdapat beberapa jenis rokok elektrik yang mempunyai kandungan
konsentrasi nikotin yang berbeda-beda, antara lain : 16 mg nikotin, 11 mg nikotin, 6 mg nikotin dan 0 mg nikotin (European Commision, 2008) dan dikarakteristikkan pula berbagai kandungan nikotin tersebut dalam beberapa
tingkatan, yaitu nol, rendah, sedang dan tinggi (Wollsheid dan Kremzner, 2009).
a b
Gambar 2. a; Rokok Elektrik, b; Cartridge Rokok Elektrik
2.2.2. Sejarah rokok elektrik
Rokok elektrik pertama sekali dibuat pada tahun 2004 di China oleh sebuah perusahaan di Beijing yang bernama Ruyan Grup. Mereka mengembangkan, mempatenkan dan meluncurkan produk rokok elektrik atau e-cigarette (Pauly et
all., 2007). Rokok elektrik digunakan dengan memakai tenaga baterai yang dapat diisi ulang, berisi sirkuit mikroelektrik yang menguapkan cairan yang tersimpan
di dalam sebuah cartridge dan memiliki sensor (Action on Smoking & Health Scotland, 2009). Di Inggris, produk rokok elektrik mulai populer sekitar tahun 2007 dan 2008 dan sampai saat ini, rokok elektrik telah terjual dan dipasarkan di
lebih 25 negara seluruh dunia (Wollscheid dan Kremzer, 2009).
2.2.3. Kimiawi asap rokok elektrik
Cartridge pada rokok elektrik berisi sintetis nikotin yang terlarut di dalam propilen glikol, air dan zat pemberi rasa, selain itu terdeteksi pula bahan tambahan berupa diethilen glikol (komponen anti pembekuan dan bersifat toksis pada
manusia) dan nitrosamin (zat bersifat karsinogen) pada setengah dari sampel penelitian (Westenberger, 2009). Beberapa bahan yang merupakan komponen spesifik tembakau yang bersifat berbahaya bagi manusia (anabasine, myosamine,
dan beta-nycotyrine) juga terdeteksi pada kandungan rokok elektrik (Westenberger, 2009).
Observasi yang dilakukan oleh Alliance Technologies untuk melihat komposisi utama rokok elektrik dan konsentrasi relatif lainnya yang tersimpan di dalam cartridge termasuk juga asap yang diproduksi oleh rokok elektrik dengan
detector) menemukan bahwa propilen glikol, nikotin dan gliserin dijumpai pada
cairan dan asap rokok elektrik (Alliance Technologies, 2009). Tergantung dari jenis cartridge rokok elektrik tersebut, setiap cartridge dapat memiliki kandungan antara 0 – 16 mg nikotin dengan variasi rasa yang dimiliki seperti rasa rokok
konvensional dan dengan rasa buah-buahan, seperti apel, cherry, coklat, rasa permen, dan kopi (Westenberger, 2009; American Legacy Foundation, 2009).
Berikut disampaikan hasil analisa kandungan kimiawi rokok elektrik seperti terlihat pada tabel berikut ini :
Tabel 1. Lanjutan
Tabel 2. Komposisi Cairan dan Asap Rokok Elektrik (Alliance Technologies, 2009)
Composition Profile for Liquid and Vapor
20090399-01
2.2.4. Efek rokok elektrik terhadap kesehatan
Sampai saat sekarang ini, belum ada data yang dipublikasikan terkait keamanan penggunaan rokok elektrik (American Legacy Foundation, 2009) dan sangat sedikit sekali yang diketahui tentang rokok elektrik serta hanya beberapa
laporan penelitian saja yang dipublikasikan (Henningfield dan Zaatari, 2009), oleh karena itu rokok elektrik tidak dapat dijual dan dipasarkan di Australia, Brazil,
Canada, Denmark dan Switzerland (American Legacy Foundation, 2009).
Rokok elektrik kemungkinan mempunyai resiko merugikan yang lebih kecil dibandingkan dengan rokok konvensional, tetapi rokok elektrik lebih berbahaya
bila dibandingkan dengan perangkat inhalasi nikotin (Westenberger, 2009; World Health Organization, 2008).
2.3. Fisiologi Reproduksi Mencit Jantan
Sistem reproduksi mencit jantan terdiri atas testis dan kandung skrotum, epididimis dan vas deferens, sisa sistem ekskretori pada masa embrio yang berfungsi untuk transport sperma, kelenjar asesoris, uretra dan penis. Selain uretra dan penis, semua struktur ini berpasangan (Rugh, 1976).
2.3.1. Testis
Setiap testis ditutupi dengan jaringan ikat fibrosa, tunika albuginea, bagian
tipisnya atau septa akan memasuki organ untuk membelah menjadi lobus yang mengandung beberapa tubulus disebut tubulus semineferus. Bagian tunika memasuki testis dan bagian arteri testicular yang masuk disebut sebagai hilus
Pada mencit jantan, gonad sewaktu embrio berdiferensiasi menjadi testis yang
akan dibungkus oleh skrotum. Fungsi testis ini untuk menghasilkan hormon seks jantan yang disebut andogen dan juga menghasilkan gamet jantan yang disebut sperma. Di dalam testis terdapat dua komponen penting yaitu komponen
spermatogenesis dan komponen interlobular. Komponen spermatogenesis terdiri dari sel germinal dan sel sertoli pada tubulus semineferus. Komponen interlobular
terdiri dari sel interstesial Leydig dan jaringan peritubular serta sistem vascular dan limfatik (Russel et all., 1990).
Lebih dari 90% testis terdiri dari tubulus semineferus yang merupakan tempat
menghasilkan sperma. Tubulus tersebut tersusun berliku-liku di dalam testis dan sangat panjang. Pada mencit jantan muda struktur tubulus terdiri dari epithelium
lembaga yang menghasilkan sel-sel spermatogonia dan sel sertoli. Pada jantan yang lebih tua spermatogonia tumbuh menjadi spermatosit primer yang setelah pembelahan meiosis pertama tumbuh menjadi spermatosid sekunder haploid.
Spermatosid sekunder akan menjadi spermatid yang menjalani spermatogenesis yang akhirnya akan menjadi sperma yang terdiri dari kepala, tubuh dan ekor (Nalbandov, 1990).
2.3.2. Struktur sel spermatozoa
Sel sperma yang normal terdiri dari kepala, leher, bagian tengah dan ekor. Kepala ditutupi oleh tudung protoplasmik (galea kapitis). Galea kapitis biasanya larut bila sperma diberi pelarut lemak yang biasanya digunakan untuk pengecatan. Bila bergerak, sperma berenang dalam cairan suspensinya seperti ikan dalam air.
kepala sperma berbentuk kait. Leher dan ekor tersusun dari flagellum tunggal
yang padat tetapi tersusun dari 9-18 fibril yang dibungkus oleh satu selubung. Pada ujung ekor, selubung menghilang, fibril menyembul dalam bentuk sikat yang telanjang (Nalbandov, 1990).
2.3.3. Spermatogenesis
Sel germinal primordial mencit jantan muncul sekitar 8 hari kehamilan dengan
jumlah hanya 100, yang merupakan awal dari jutaan spermatozoa yang akan dirpoduksi dan masih berada di daerah ekstra gonad. Karena sel germinal kaya akan alkalin fosfatase untuk mensuplai energi pergerakannya melalui jaringan
embrio, maka sel germinal dapat dikenal dengan teknik pewarnaan. Pada hari ke-9 dan ke-10 kehamilan, sebagian mengalami degenerasi dan sebagian lain
mengalami proliferasi dan bahkan bergerak (pada hari ke-11 dan ke-12) ke daerah genitalia. Pada saat itu jumlahnya mencapai sekitar 5000 dan proses identifikasi testis dapat dilakukan. Proses proliferasi dan diferensiasi berlangsung di daerah
medulla testis. Menuju akhir masa fetus, aktivitas mitosis sel germinal primordial dalam bagian genitalia berkurang dan beberapa sel mulai degenerasi menjelang hari ke-19 kehamilan. Tidak berapa lama setelah kelahiran, sel tampak lebih
besar, yaitu spermatogonia. Setelah itu akan ada spermatogonia dalam testis mencit sepanjang hidupnya dan terdapat 3 jenis spermatogonia : tipe A, tipe
intermediate dan tipe B (Rugh, 1976).
Tipe A adalah induk stem cell yang mampu mengalami mitosis sampai menjadi spermatozoa. Spermatogonia tipe A yang paling besar dan mengandung inti
eksentrik. Kromosom metafasenya panjang dan tipis. Dapat meningkat melalui
spermatogonia intermediate menjadi spermatogonia B yang lebih kecil, lebih banyak dan mengandung inti kromatin serpihan kasar di atas atau dekat permukan dalam membran inti. Terdapat plasmosom mirip nukleolus yang terletak di
tengah. Kromosom metafase biasanya pendek, bulat, dan mirip kacang. Spermatogonia tipe B membelah dua untuk meningkatkan jumlahnya atau
berubah menjadi spermatosit primer, lebih jauh dari membran dasar. Diperkirakan lamanya waktu dari metafase spermatogonia menjadi profase meiosis sekitar 3 sampai 9 hari, menuju metafase kedua selama 4 hari atau kurang, dan menuju
spermatozoa imatur selama 7 hari atau lebih. Maka, waktu dari metafase spermatogonia menjadi spermatozoa imatur paling sedikit 10 hari (Rugh, 1976).
Sel tipe A pertama kali muncul 3 hari setelah kelahiran. Ketika jumlahnya meningkat, sel germinal primordial yang merupakan asalnya dan kemudian berada di samping membran dasar akan berkurang jumlahnya. Pembelahan meiosis
dalam testis mulai 8 hari setelah kelahiran. Tanda pertama bahwa spermatogonia B akan metamorfosis menjadi spermatosit primer adalah pembesaran dan bergerak menjauhi membran dasar. Spermatosit primer membelah menjadi 2 spermatosit
sekunder yang lebih kecil, yang kemudian membelah menjadi 4 spermatid. Mereka mengalami metamorfosis radikal menjadi spermatozoa matur dengan
jumlah yang sama, kehilangan sitoplasmanya dan berubah bentuk (Rugh, 1976). Antara tahap spermatosit primer dan sekunder, materi kromatin harus membelah. Sintesa premeiotik DNA terjadi di spermatosit primer selama fase
Tidak ada pembentukan DNA terjadi pada tahap akhir spermatogenesis. Proses
spermatogenesis mencit pada dasarnya sama dengan mamalia lain. Satu siklus epitel semineferus selama 207±6 jam, dan 4 siklus yang mirip terjadi antara spermatogonia A dan spermatozoa matur. Testis dan khususnya spermatozoa
matur, merupakan sumber hyaluronidase terkaya dan enzim ini efektif membubarkan sel cumulus sekitar ovum matur pada saat fertilisasi. Setiap
spermatozoa membawa enzim yang cukup untuk membersihkan jalan melalui sel cumulus menuju matriks sel ovum. Bahan asam hialuronik semen cenderung bergabung ke sel granulosa cumulus, agar kepala sperma dapat disuplai dengan
enzim melimpah (Rugh, 1976).
2.4. Radikal Bebas
Radikal bebas adalah atom atau molekul yang mempunyai elektron yang tidak berpasangan pada orbital terluarnya dan dapat berdiri sendiri (Clarkson dan
Thompson, 2000). Kebanyakan radikal bebas bereaksi secara cepat dengan atom lain untuk mengisi orbital yang tidak berpasangan, sehingga radikal bebas normalnya berdiri sendiri hanya dalam periode waktu yang singkat sebelum
menyatu dengan atom lain. Simbol untuk radikal bebas adalah sebuah titik yang
berada di dekat simbol atom (R
·
).ROS (Reactive Oxygen Species) adalah senyawa pengoksidasi turunan oksigen yang bersifat sangat reaktif yang terdiri atas kelompok radikal bebas dan
kelompok nonradikal. Kelompok radikal bebas antara lain superoxide anion (O2
·),
hydrogen peroxide (H2O2), dan organic peroxides (ROOH) (Halliwell and
Whiteman, 2004). Senyawa oksigen reaktif ini dihasilkan dalam proses metabolisme oksidatif dalam tubuh misalnya pada proses oksidasi makanan menjadi energi. ROS yang paling penting secara biologis dan paling banyak
berpengaruh pada sistem reproduksi antara lain superoxide anion (O2
·
-), hydroxylradicals (OH·), peroxyl radicals (RO2
·
) dan hydrogen peroxide (H2O2)
(Tremallen, 2008). Bentuk radikal bebas yang lain adalah hydroperoxyl (HO2
·
),
alkoxyl (RO·), carbonate (CO3
·-), carbon dioxide (CO2
·-), atomic chlorine (Cl·),
dan nitrogen dioxide (NO2·) (Halliwell danWhiteman, 2004).
2.5. Malondialdehyde
Salah satu senyawa yang dihasilkan oleh pemecah lipid peroksida adalah malondialdehyde (MDA) yang terbentuk akibat degradasi radikal bebas OH
terhadap asam lemak tak jenuh yang nantinya ditransportasi menjadi radikal bebas yang sangat reaktif (Suryohudoyo, 2000). Peroksidasi lipid ini dapat ditentukan
secara tidak langsung dengan mengukur kadar MDA yaitu produk akhir peroksidasi lipid berupa senyawa dialdehida yang dapat diukur mengikuti tes standar Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS test). (Slater, 1984;
2.6..Mekanisme Kerja Radikal Bebas, Peroksidasi Lipid, dan Malondialdehyde
Penelitian yang ekstensif dengan menggunakan sistem model dan dengan material biologis in vitro, secara jelas menunjukkan bahwa radikal bebas dapat
menimbulkan perubahan kimia dan kerusakan terhadap protein, lemak, karbohidrat, dan nukleotida. Bila radikal bebas diproduksi in vivo, atau in vitro di
dalam sel melebihi mekanisme pertahanan normal, maka akan terjadi berbagai gangguan metabolik dan seluler. Jika posisi radikal bebas yang terbentuk dekat dengan DNA, maka bisa menyebabkan perubahan struktur DNA sehingga bisa
terjadi mutasi atau sitotoksisitas. Radikal bebas juga bisa bereaksi dengan nukleotida sehingga menyebabkan perubahan yang signifikan pada komponen
biologi sel. Bila radikal bebas merusak grup thiol maka akan terjadi perubahan aktivitas enzim. Radikal bebas dapat merusak sel dengan cara merusak membran sel tersebut. Kerusakan pada membran sel ini dapat terjadi dengan cara: (a) radikal
bebas berikatan secara kovalen dengan enzim dan/atau reseptor yang berada di membran sel, sehingga merubah aktivitas komponen-komponen yang terdapat pada membran sel tersebut; (b) radikal bebas berikatan secara kovalen dengan
komponen membran sel, sehingga merubah struktur membran dan mengakibatkan perubahan fungsi membran dan/atau mengubah karakter membran menjadi seperti
antigen; (c) radikal bebas mengganggu sistem transport membran sel melalui ikatan kovalen, mengoksidasi kelompok thiol, atau dengan merubah asam lemak
menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid membran sel. Peroksida-peroksida lipid
akan terbentuk dalam rantai yang makin panjang dan dapat merusak organisasi membran sel. (Sikka et al., 1995). Peroksidasi ini akan mempengaruhi fluiditas membran, cross-linking membran, serta struktur dan fungsi membran (Slater,
1984; Powers dan Jackson, 2008).
Mekanisme kerusakan sel atau jaringan akibat serangan radikal bebas yang
paling awal diketahui dan terbanyak diteliti adalah peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid paling banyak terjadi di membran sel, terutama asam lemak tidak jenuh yang merupakan komponen penting penyusun membran sel. Pengukuran tingkat
peroksidasi lipid diukur dengan mengukur produk akhirnya, yaitu MDA yang merupakan produk oksidasi asam lemak tidak jenuh dan yang bersifat toksik
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu
Penelitian akan dilaksanakan di Laboratorium Biologi FMIPA USU dan Laboratorium Terpadu FK USU selama lebih kurang 7 minggu.
3.2. Variabel Penelitian 3.2.1. Variabel Independen
3.2.1.1. Rokok elektrik A (rasa tambahan / “x”).
3.2.1.2. Rokok elektrik B (rasa rokok konvensional / ”y”).
3.2.2. Variabel Dependen
3.2.2.1. Motilitas sperma. 3.2.2.2. Jumlah sperma.
3.2.2.3. Kadar MDA di dalam testis.
3.3. Definisi Operasional
3.3.1. Rokok elektrik A (rasa tambahan / “x”) adalah rokok elektrik yang diproduksi dengan tambahan berbagai zat perasa seperti rasa buah, coklat,
permen dan kopi.
3.3.2. Rokok elektrik B (rasa rokok konvensional / ”y”) adalah rokok elektrik yang diproduksi dengan cita rasa rokok konvensional yang umum beredar
3.3.3. Motilitas sperma adalah gerakan spermatozoa diamati dan dikategorikan
sebagai berikut :
A. Jika sperma bergerak cepat dan lurus ke depan (gerak maju sangat baik).
B. Jika geraknya lambat atau sulit maju lurus atau bergerak tidak lurus (gerak lemah).
C. Jika tidak bergerak maju. D. Jika sperma tidak bergerak.
Motilitas dikatakan normal jika kategori A ≥ 25% atau kategori A + B >
50% (Hayati et al., 2005).
3.3.4. Jumlah sperma adalah banyaknya sperma yang diperoleh dari cauda
epididimis dalam 1 ml suspensi.
3.3.5. Kadar malondialdehyde (MDA) dalam testis : kadar MDA (µM) dalam 1 ml suspensi jaringan testis.
3.4. Bahan dan Alat Penelitian 3.4.1. Bahan penelitian
Bahan biologis. Bahan biologis yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan (Mus musculus, L.) strain DD Webster dewasa fertil berumur
± 3 bulan dengan berat badan 25-40 gram yang diperoleh dari FMIPA Biologi Universitas Sumatera Utara. Jumlah hewan uji perkelompok ditentukan dengan rumus Federer (t-1) (n-1) ≥ 15. Jika t adalah jumlah perlakuan (dalam penelitian
jumlah n yang diharapkan (teoritis) adalah 8 (Federer, 1963). Sehingga jumlah
keseluruhan hewan coba yang diperlukan dalam penelitian ini adalah sebanyak 24 ekor yang dipilih dari hasil perbanyakan untuk keperluan penelitian. Untuk menjaga adanya kematian mencit dalam penelitian, maka ditambahkan pada
masing-masing kelompok penelitian 2 ekor mencit (total mencit / kelompok = 10 ekor).
Bahan kimia. Bahan kimia yang dibutuhkan adalah NaCl 0,9 %, alkohol 70 %, larutan buffer phosphate, thiobarbituric acid, tetramethoxypropane 99 %, acetic acid glacial, larutan NaOh, aquadest.
3.4.2. Peralatan utama penelitian
Alat utama yang digunakan dalam penelitian antara lain: satu set lengkap rokok elektrik beserta cartridge isi ulang dengan kandungan rasa rokok konvensional dan rasa rokok tambahan, spuit naso gastric tube ukuran 60 mL produksi Terumo sebagai alat untuk menghisap dan mengeluarkan asap rokok
elektrik, Discofix-3 (tree way) produksi B-Braun sebagai alat penghubung dan pemutus aliran asap rokok, selang karet diameter 0,5 cm dengan panjang 13 cm dan 5 cm, kandang perlakuan mencit dengan ukuran 30 x 20 x 15 cm dan dibagian
atas kandang ditutupi dengan plastik kaca yang sudah diberikan ventilasi dengan diameter 1 cm sebanyak 3 buah pada kedua sisinya dengan penempatan ventilasi
yang disesuaikan, bak bedah dan dissecting set, gelas arloji, cawan petri, batang pengaduk, vortex mixer, sentrifuge, spektrofotometer, kamar hitung Improved
Gambar 4. Satu set lengkap rokok elektrik
Gambar 5. Catridge rokok elektrik
Gambar 6. Spuit naso gastric tube ukuran 60 mL
Gambar 8. Alat hisap dan pompa asap rokok elektrik
Gambar 9. Kandang perlakuan
Gambar 10. Kandang pemeliharaan
Gambar 13. Vortex mixer
Gambar 14. Water bath
3.5. Disain Penelitian
Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental yang didisain mengikuti
Rancangan Acak Lengkap (RAL). Penelitian ini terdiri atas 3 kelompok perlakuan, yaitu:
a) Kelompok I (P0) = terdiri dari 10 ekor mencit jantan dewasa yang tidak
diberi perlakuan (kelompok kontrol).
b) Kelompok II (P1) = terdiri dari 10 ekor mencit jantan dewasa yang diberi paparan asap rokok elektrik A setiap hari selama 15 hari.
c) Kelompok III (P2) = terdiri dari 10 ekor mencit jantan dewasa yang diberi paparan asap rokok elektrik B setiap hari selama 15 hari.
P2 →→→→→→→ Paparan asap rokok elektrik B →→→→→→→→→
P1 →→→→→→→ Paparan asap rokok elektrik A →→→→→→→→→
P0 →→→→→→→→→→→→ Kontrol →→→→→→→→→→→→
0 hari 15 hari
3.6. Pelaksanaan Penelitian 3.6.1. Pemeliharaan hewan coba
Pemeliharaan terhadap hewan coba dilakukan di kandang hewan Laboratorium Struktur Hewan Departemen Biologi FMIPA Universitas Sumatera
Utara. Perlakuan terhadap hewan coba berpedoman pada prinsip-prinsip penelitian kesehatan yang menggunakan hewan menurut etis, prosedur dan standar yang
dibuktikan dengan Ethical Clearance dari Komite Etik Penelitian Hewan Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara.
Mencit diaklimatisasi selama 1 minggu dan ditempatkan di dalam kandang yang terbuat dari bahan plastik (ukuran 40 x 30 x 13 cm) yang ditutup dengan kawat kasa. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5-1 cm dan diganti setiap 3 hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang (pukul 06.00
sampai dengan pukul 18.00) dan 12 jam gelap (pukul 18.00 sampai dengan pukul 06.00), sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran
3.6.2. Perlakuan hewan coba
- Pemaparan dengan asap rokok elektrik diberikan ke dalam kandang perlakuan yang diisi dengan 10 ekor mencit, dilakukan 1 kali sehari dalam 24 jam selama 15 hari dan dimulai pada jam yang sama setiap harinya yaitu pukul 10.00 WIB.
- Saat rokok elektrik dihisap, bagian Discofix-3 (tree way) yang terhubung dengan rokok elektrik (bagian hisap) diatur pada posisi on dan saluran keluaran asap
menuju kandang perlakuan diatur pada posisi off sehingga asap rokok elektrik tertarik masuk ke dalam spuit naso gastric tube.
- Asap yang terkumpul di dalam spuit naso gastric tube lalu dipompakan keluar
menuju kandang perlakuan dengan mengatur ulang Discofix-3 (tree way) yaitu memposisikan bagian hisap asap rokok elektrik pada posisi off dan bagian saluran
keluaran asap rokok elektrik pada posisi on sehingga asap rokok mnegalir masuk ke dalam kandang perlakuan pada saat dipompakan.
- Lamanya waktu pemaparan asap rokok elektrik adalah lebih kurang 30 menit
dan dilakukan sekitar 55 kali tarikan spuit naso gastric tube dalam setiap kali pemaparan asap rokok elektrik. Teknik dan cara pemaparan asap rokok elektrik diperlihatkan pada gambar berikut ini :
Gambar 15b. Cara pemaparan asap rokok elektrik
3.6.3. Pengamatan
Setelah 15 hari perlakuan, masing-masing hewan coba dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Selanjutnya dilakukan pengamatan sebagai berikut :
Pengambilan sekresi cauda epididimis. Untuk mendapatkan sperma di dalam sekresi cauda epididimis dilakukan menurut Soehadi dan Arsyad (1983) sebagai
berikut: hewan percobaan dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan selanjutnya dibedah. Kemudian organ testis beserta epididimis sebelah kanan diambil dan diletakkan ke dalam cawan petri yang berisi NaCl 0,9 %. Di bawah mikroskop
bedah dengan pembesaran 400 kali, cauda epididimis dipisahkan dengan cara memotong bagian proximal corpus epididimis dan bagian distal vas deferens.
Selanjutnya cauda epididimis dimasukkan ke dalam gelas arloji yang berisi 1 ml NaCl 0,9 %, kemudian bagian proximal cauda dipotong sedikit dengan gunting lalu cauda ditekan dengan perlahan hingga sekresi cairan epididimis keluar dan tersuspensi
Pengamatan motilitas sperma. Suspensi spermatozoa yang diperoleh biarkan
terlebih dahulu selama 5 menit pada suhu kamar selanjutnya teteskan suspensi ini pada kamar hitung Improved Neubauer dan diamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran lensa objektif 40 kali. Periksa 4 – 6 lapangan pandang untuk
mendapat 100 spermatozoa secara berurutan yang kemudian diklasifikasi sehingga menghasilkan persentase setiap kategori motilitas.
Pengamatan jumlah sperma. Suspensi sperma yang telah diperoleh terlebih dahulu dihomogenkan. Selanjutnya diambil sebanyak 10 µl sampel dan dimasukkan ke dalam kotak-kotak hemositometer Improved Neubauer serta ditutup dengan kaca
penutup. Di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali, hemositometer diletakkan dan dihitung jumlah sperma pada kotak/bidang A,B,C,D, dan E. Hasil
perhitungan jumlah sperma kemudian dimasukkan ke dalam rumus penentuan jumlah sperma/ml suspensi sekresi cauda epididimis sebagai berikut:
Jumlah sperma = N / 2 x 105 sperma/ ml suspensi
dimana, N = jumlah sperma yang dihitung pada kotak A,B,C,D,dan E.
Pemeriksaan kadar MDA. Pemeriksaan kadar MDA testis mencit dilakukan pada hari ke-16 setelah perlakuan pada semua kelompok. Testis dihomogenkan dalam 5 ml larutan buffer phosphate (pH 7,2). Metode pemeriksaan MDA yang telah dimodifikasi sebagai berikut (Hsieh et all., 2006) :
a) Reagensia :
1) 2-Thiobarbituric acid (Merck; Cat. No. 1.08180.0025)
2) 1,1,3,3-Tetramethoxypropane 99% (Sigma; Cat. No. 108383) 500 µM 3) Acetic acid glacial
4) Sodium hydroxide (NaOH)
5) Aquadest
b) Persiapan reagensia :
1. TBA/Buffer Reagent
TBA/Buffer Reagent terdiri dari : 0,67 g 2-thiobarbituric acid dilarutkan dalam 100 mL aquadest, selanjutnya 0,5 g sodium hydroxide dan 100 mL asam
asetat glacial.
2. Standard MDA
Sebanyak 250 µL 1,1,3,3-tetramethoxypropane (Malondialdehyde bis) 500
µM dilarutkan dalam 750 µL aquadest untuk memperoleh larutan stok MDA 125 µM. Selanjutnya dari larutan stok MDA 125 µM dilarutkan dalam aquadest dan
Tabel 3. Persiapan Standar MDA Spektrofotometer
1)Sebanyak 500 µl sampel atau standar MDA dimasukkan dalam tabung
ependorf yang masing-masing telah diberi label.
2)Ditambahkan 0,5 ml aquadest pada masing-masing tabung. 3)Kemudian ditambahkan 0,5 ml TBA / Buffer Reagent.
4)Selanjutnya masing-masing tabung diinkubasi di dalam waterbath dengan suhu 950C selama 60 menit.
5)Setelah diinkubasi, masing-masing tabung dikeluarkan dari waterbath dan setelah dingin masing-masing tabung disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 10 menit.
6)Supernatan diambil untuk selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 534 nm.
3.7. Analisa Data dan Pengujian Hipotesis
normal dan homogen diuji dengan ANOVA. Bila terdapat perbedaan nyata
dilanjutkan dengan Post Hoc analisis Bonferroni taraf 5% untuk melihat perbedaan antar kelompok kontrol dan masing-masing perlakuan.
Semua analisis data dilakukan dengan menggunakan SPSS software. Dalam
penelitian ini, hanya perbedaan rata-rata pada taraf 5% yang dianggap berbeda nyata (signifikan).
3.8. Jadwal Penelitian
Keseluruhan kegiatan penelitian dari persiapan sampai pada penulisan hasil
penelitian adalah lebih kurang 7 minggu. Urutan kegiatan dan jadwal pelaksanaan secara lengkap dapat dilihat pada tabel berikut ini:
Tabel 4. Jadwal Penelitian
Minggu
No. Kegiatan 1 2 3 4 5 6 7
1 Persiapan √ √
2 Pelaksanaan √ √ √
3 Analisa Data √
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
4.1.1. Motilitas sperma mencit
Setelah dilakukan penilaian terhadap motilitas sperma mencit pada tiap
kelompok maka didapatkan hasil seperti yang terlihat pada tabel 5 di bawah ini : Tabel 5. Rata-Rata Persentase Motilitas Sperma
Motilitas sperma Kelompok
perlakuan Kategori a (%)
Nilai dalam X ±SD (X, rata-rata; SD, standar deviasi); tabel pada kolom kategori a+b untuk perlakuan yang berbeda diikuti oleh huruf kecil yang sama berbeda tidak nyata pada taraf uji 5 %; P0, kontrol (tidak diberi perlakuan); P1, paparan asap rokok elektrik A selama 15 hari; P2, paparan asap rokok elektrik B selama 15 hari; kategori a, jika sperma bergerak cepat dan lurus ke depan (gerak maju sangat baik); kategori b, jika geraknya lambat atau sulit maju lurus atau bergerak tidak lurus (gerak lemah); kategori c, jika tidak bergerak maju; kategori d, jika sperma tidak bergerak.
Dari tabel 5 di atas terlihat bahwa persentase motilitas sperma mencit kelompok P2 yang mendapat paparan asap rokok elektrik B (4,88±1,50%) lebih sedikit dibandingkan motilitas sperma mencit kelompok P1 yang mendapat
paparan asap rokok elektrik A (5,88±0,79%) dan kelompok P0 yang merupakan kelompok kontrol (43,01±0,88%). Hasil uji statistik menunjukkan bahwa motilitas
dengan motilitas sperma mencit kelompok P1. Hasil yang berbeda nyata juga
terlihat dari motilitas sperma mencit kelompok P1 dibandingkan dengan kelompok P0.
4.1.2. Jumlah sperma mencit
Penilaian hasil jumlah sperma tiap kelompok mencit ditampilkan pada tabel 6 seperti terlihat di bawah ini :
Tabel 6. Rata-Rata Jumlah Sperma
Kelompok
perlakuan Jumlah sperma (juta/mL)
P0 86,45±23,50 a
P1 63,62±12,78 a b
P2 57,28±17,03b
Nilai dalam X±SD (X , rata-rata; SD, standar deviasi); tabel untuk perlakuan yang berbeda diikuti oleh huruf kecil yang sama berbeda tidak nyata pada taraf uji 5 %; P0, kontrol (tidak diberi perlakuan); P1, paparan asap rokok elektrik A selama 15 hari; P2, paparan asap rokok elektrik B selama 15 hari
Dari tabel 6 di atas terlihat jumlah sperma mencit kelompok P2 (57,28±17,03 juta/mL) lebih sedikit dibandingkan dengan jumlah sperma mencit kelompok P1 (63,62±12,78 juta/mL) dan kelompok P0 (86,45±23,50 juta/mL). Hasil uji statistik menunjukkan bahwa jumlah sperma mencit kelompok P2 berbeda nyata dengan jumlah sperma mencit kelompok P0 dan berbeda tidak nyata dengan jumlah
4.1.3. Kadar MDA testis mencit
Penilaian hasil konsentrasi MDA testis tiap kelompok mencit ditampilkan pada tabel 7 berikut ini :
Tabel 7. Rata-Rata Kadar MDA Testis
Kelompok
perlakuan MDA testis (µM/mL)
P0 0,400±0,119 a
P1 0,475±0,268 a
P2 0,618±0,164 a
Nilai dalam X±SD (X , rata-rata; SD, standar deviasi); tabel untuk perlakuan yang berbeda diikuti oleh huruf kecil yang sama berbeda tidak nyata pada taraf uji 5 %; P0, kontrol (tidak diberi perlakuan); P1, paparan asap rokok elektrik A selama 15 hari; P2, paparan asap rokok elektrik B selama 15 hari
Dari tabel 7 di atas terlihat konsentrasi MDA testis mencit yang lebih tinggi
didapatkan pada kelompok P2 (0,618±0,164 μM/mL) dibandingkan dengan kelompok P1 (0,475±0,268 μM/mL) dan kelompok P0 (0,400±0,119 μM/mL). Hasil uji statistik menunjukkan bahwa konsentrasi MDA testis mencit kelompok P2 berbeda tidak nyata dengan konsentrasi MDA testis mencit kelompok P0 dan kelompok P1. Konsentrasi MDA testis mencit kelompok P1 juga menunjukkan
4.2. Pembahasan
4.2.1.Motilitas sperma mencit
Pada penelitian ini ditemukan hasil yang menunjukkan bahwa motilitas sperma kelompok mencit yang dipapari dengan asap rokok elektrik lebih sedikit
dibandingkan dengan motilitas sperma kelompok mencit kontrol. Hal ini diduga terjadi karena terdapatnya bahan-bahan kimiawi dalam asap rokok elektrik yang
berpotensi untuk mencetuskan timbulnya radikal bebas (ROS) dan berakibat negatif terhadap motilitas sperma mencit. Efek bahan kimiawi rokok terhadap sistem reproduksi menunjukkan adanya gangguan spermatogenesis pada mencit
(Bizzaro et al., 2003) dan pada berbagai penelitian yang dilakukan dengan menggunakan rokok konvensional ditemukan fakta bahwa ROS yang berasal dari
asap rokok akan meningkatkan jumlah lipid peroksidasi dan menimbulkan kerusakan serta penurunan integritas membran spermatozoa sehingga mengurangi motilitas dan kualitas sperma (Cocuzza et al., 2007). Motilitas sperma juga
tergantung kepada besarnya volume mitokondria di dalam leher sperma (Ruiz-Pesini et al., 1998) sehingga diduga bahan-bahan kimiawi yang terdapat pada asap rokok elektrik memberikan pengaruh terhadap volume mitokondria di dalam leher
sperma, akan tetapi hal ini perlu dibuktikan lebih lanjut. Motilitas sperma juga dapat berkurang karena sesuatu sebab yang tidak diketahui dengan pasti yang
4.2.2. Jumlah sperma mencit
Pada penelitian ini ditemukan hasil bahwa kelompok mencit yang dipapari dengan asap rokok elektrik jumlah spermanya lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok mencit kontrol. Kemungkinan penyebab terjadinya hal ini diarahkan
pada kandungan bahan-bahan kimiawi cartridge rokok elektrik yang diduga berpotensi menimbulkan radikal bebas (ROS) dan memberikan pengaruh negatif
terhadap jumlah sperma sehingga jumlah sperma menjadi lebih rendah. ROS akan merusak membran sel-sel spermatogenik, mengganggu transport ion-ion penting bagi proliferasi dan pertumbuhan sel-sel spermatogenik, menekan
steroidogenesis sel Leydig (Pasqualotto et al., 2000) merusak DNA spermatozoa dan meningkatkan terjadinya apoptosis sperma (Agarwal dan Prabakaran, 2005)
sehingga akhirnya jumlah sperma yang dihasilkan sedikit (Pasqualotto et al., 2000; Agarwal dan Prabakaran, 2005). Hasil yang berbeda tidak nyata antara kelompok P1 dengan kelompok P0 diduga akibat adanya peran antioksidan yang
dimiliki oleh sel sperma sendiri (Kim dan Parthasarathy, 1998) akan tetapi hal ini perlu pembuktian lebih lanjut.
4.2.3. Kadar MDA testis mencit
Pada penelitian ini ditemukan konsentrasi MDA testis yang lebih tinggi pada kelompok mencit P2 dibandingkan dengan kelompok mencit P0 yang tidak
terpapar dengan asap rokok elektrik. Konsentrasi MDA testis yang lebih tinggi pada kelompok mencit P2 mengindikasikan terjadinya peningkatan stres oksidatif dan timbulnya ROS akibat akumulasi radikal bebas pada kelompok mencit
yang berbeda tidak nyata pada penelitian ini kemungkinan berhubungan dengan
terdapatnya kemampuan sperma sendiri untuk mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh stres oksidatif. Penelitian pemaparan asap rokok konvensional secara kronik pada tikus yang dilakukan oleh Nanik (1998) menemukan hasil
bahwa terdapat peningkatan kadar MDA serum sebesar (0,332±0,92 µg/dl) walaupun berbeda tidak nyata (p>0,05). Kim dan Parthasarathy (1998)
menyatakan bahwa spermatozoa dilindungi oleh berbagai jenis antioksidan dan enzim-enzim antioksidan yang dimilikinya. Enzim antioksidan atau disebut juga antioksidan alami yang dimiliki oleh spermatozoa bekerja dengan cara
menetralisir efek yang ditimbulkan oleh ROS dan mencegah kerusakan yang ditimbulkan oleh ROS pada struktur seluler (Agarwal dan Sharma, 2005).
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan di atas, dapat disimpulkan sebagai berikut : 5.1.1. Paparan asap rokok elektrik rasa konvensional/”y” dan rasa tambahan/”x”
menekan motilitas sel sperma mencit secara nyata.
5.1.2. Paparan asap rokok elektrik rasa konvensional/”y” mengurangi jumlah sel sperma mencit secara nyata dan paparan asap rokok elektrik rasa
tambahan/”x” mengurangi jumlah sel sperma mencit tetapi tidak nyata.
5.1.3. Paparan asap rokok elektrik rasa konvensional/”y” dan rasa tambahan/”x”
meningkatkan kadar MDA testis mencit tetapi tidak nyata.
5.2. Saran
5.2.1 Diharapkan dapat dilakukan penelitian lanjutan tentang berbagai jenis
rokok elektrik berdasarkan rasa atau flavour.
5.2.2 Perlu dilakukan pengamatan lain dilihat dari aspek fisiologi, klinis dan histologi berbagai organ mencit, misalnya hati, ginjal serta paru yang
DAFTAR PUSTAKA
Action on Smoking & Health Scotland. (2009) Electronic cigarettes (online). Diakses.tanggal18-10-2010,
http://www.ash.org.uk/files/document/ASH_715
Aditama, T.Y. (2000) Pengetahuan, sikap dan perilaku mahasiswa akademi perawat serta mahasiswa fakultas kedokteran dalam masalah merokok. Jurnal Respirology Indonesia, 2, 60-3.
Agarwal, A., Saleh, R.A, Bedaiwy, M.A. (2003) Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction, Fertility and Sterility, 79, 829-843.
Agarwal, A. & Prabakaran, SA. (2005) Oxidative stress and antioxidan in male infertility. Iranian Journal of Reproductive Medicine, 3(1): 1-8
Agarwal, A. & Said, T.M. (2005) Oxidative stress, DNA damage and apoptosis in male infertility; a clinical approach. International Brazilian Journal of Urology, 95, 503-507.
Agarwal, A. & Sharma, R.K. (2005) Role of oxidative stress in female reproduction. Reproductive Biology and Endocrinology, Vol.3, Article 28 Alliance Technologies, LLC (2009) Study: chemical composition of “instead”
electronic cigarette smoke juice and vapor. Diakses tanggal 19-10-2010, http://www.alliancetechgroup.com.
American Legacy Foundation, (2009) Electronic cigarette (“e-cigarette”) Fact
Sheet..Diakses.tanggal.19-10-2010, :
http://www.americanlegacy.org/PDFPublications/ElectronicCigarette_Fact Sheet.pdf
Bizzaro, P., Acevedo, G., Nino-Cabrera, P., Mussali-Galante, F., Pasos, M.R., Avilacosta, T.I., Fortoul. (2003) Ultrastructural modification in the mitochondrion of mouse sertoli cells after inhalation of lead, cadmium or lead-cadmium mixture. Reproductive Toxicology, 17, 561-566.
Burns, E. (2007) The smoke of the gods: a social history of tobacco. Temple University Press, Philadelphia.
Chia, S.E., Ong, C.N., Tsakok, F.M. (1994) Effects of cigarette smoking on human semen quality, a singapore study.Archives of Andrology, 33, 163-8. Clarkson, P. M. & Thompson, H. S. (2000) Antioxidants: what role do they play
in physical activity and health?. The American Journal of Clinical Nutrition, 72, 637S-46S.
Cocuzza, M., Suresh C., Sikka,, Kelly S., Athayde., Ashok Agarwal. (2007) Clinical relevance of oxidative stress and sperm chromatin damage in male infertility: an evidence based analysis. International Brazilian Journal of Urology. Vol. 33 (5): 603-621
