TESIS
EFEK KOMBINASI EKSTRAK AKTIF BUAH
ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DAN
DOXORUBICIN TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
Oleh:
CUT MASYITHAH THAIB
NIM 117014003
EFEK KOMBINASI EKSTRAK AKTIF BUAH
ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DAN
DOXORUBICIN TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh
Gelar Magister dalam Ilmu Farmasi Pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
Oleh:
CUT MASYITHAH THAIB
NIM 117014003
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
LEMBAR PENGESAHAN TESIS
EFEK KOMBINASI EKSTRAK AKTIF BUAH
ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DAN
DOXORUBICIN TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA
Oleh:
CUT MASYITHAH THAIB
NIM 117014003
Medan, 23 Agustus 2013 Menyetujui:
Komisi Pembimbing, Komisi Penguji,
Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt. NIP 195311281983031002 NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Syafrudin Ilyas, M.Biomed. DR. MPS. Pandapotan Nasution, Apt NIP 196602091992031003 NIP 194908111976031001
Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195311281983031002
Prof. Dr. Syafrudin Ilyas, M.Biomed NIP 196602091992031003
Mengetahui: Disahkan Oleh:
PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa : Cut Masyithah Nomor Induk Mahasiswa : 117014003
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Efek Kombinasi Ekstrak Aktif Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) dan Doxorubicin Terhadap Sel Kanker Payudara
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari
Jumat tanggal dua puluh tiga bulan Agustus tahun dua ribu tiga belas.
Mengesahkan:
Tim Penguji Tesis
Ketua Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt.
Anggota Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Syafrudin Ilyas, M.Biomed.
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
DR. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama : Cut Masyithah Thaib
NIM : 117014003
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Efek Kombinasi Ekstrak Aktif Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.) dan Doxorubicin
Terhadap Sel Kanker Payudara
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah asli
karya saya sendiri, bukan plagiat, dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya
tersebut plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia diberi sanksi
apapun oleh Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi Universitas
Sumatera Utara. Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas perbuatan saya
tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dan
dalam keadaan sehat.
Medan, 23 Agustus 2013 Yang membuat Pernyataan
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena limpahan
rahmat, kasih dan karunianNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan karakterisasi simplisia dan skrining
fitokimia serta uji aktivitas sitotoksik, apoptosis, uji kombinasi ekstrak aktif buah
andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) dengan doxorubicin dan uji
selektivitas ekstrak buah andaliman. Tesis ini diajukan sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar magister farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas
Sumatera Utara.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tulus
dan ikhlas kepada Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan
Fakultas Farmasi USU Medan dan pembimbing penulis yang telah memberikan
fasilitas sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan, serta Bapak Prof. Dr.
Syafrudin Ilyas, M.Biomed., selaku pembimbing yang telah memberikan waktu,
bimbingan dan nasehat selama penelitian hingga selesainya penyusunan tesis ini.
Bapak Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt., dan Ibu Prof. Dr. Rosidah, MSi.,
Apt., selaku dosen pembanding yang telah memberikan kritik, saran dan arahan
kepada penulis dalam menyelesaikan tesis ini. Bapak dan Ibu staf pengajar
Fakultas Farmasi USU Medan yang telah mendidik selama perkuliahan. Ibu
kepala Laboratorium Farmakognosi, Dra. Suwarti Aris, M.Si., Apt., dan Bapak
kepala Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM, Prof. Supargiono
serta staf yang telah memberikan bantuan dan fasilitas selama penulis melakukan
Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang
tiada terhingga kepada Ayahanda (Alm) Tgk. H.M. Thaib dan Ibunda (Almh) Hj.
Asiah tercinta, yang tiada hentinya berkorban dengan tulus ikhlas bagi kesuksesan
penulis, juga kepada abang, dan kakak yang selalu setia memberi doa, dorongan,
dan motivasi selama penulis melakukan penelitian. Serta ucapan terimakasih
kepada Dedy Armiadi, M. Kom dan Denny Satria, S.Farm., Apt., dan Puji
Lestari, S.Farm., Apt., atas bantuan dan motivasinya selama penulis melakukan
penelitian.
Penulis menyadari bahwa penulisan tesis ini masih belum
sempurna, sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun
untuk penyempurnaannya. Harapan saya semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi
ilmu pengetahuan kefarmasian.
Medan, 23 Agustus 2013 Penulis
Efek Kombinasi Ekstrak Aktif Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodiumDC.) dan Doxorubicin Terhadap Sel Kanker Payudara
ABSTRAK
Buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) merupakan salah satu jenis rempah-rempah dari tumbuhan liar yang dikenal oleh masyarakat Batak, Sumatera Utara dan sering digunakan sebagai bumbu masak dalam berbagai masakan. Buah andaliman banyak dipakai sebagai rempah pada masakan daging, dan ikan sehingga masakan menjadi tahan beberapa hari tanpa menimbulkan bau. Akhir-akhir ini buah andaliman juga disebut-sebut memiliki khasiat sebagai antikanker. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efek sitotoksik dari ektrak buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.), efek kombinasinya dengan doxorubicin, apoptosis dan selectivity index.
Karakterisasi dan skrining fitokimia dilakukan terhadap serbuk simplisia menunjukkan adanya alkaloid, flavonoid, steroid/triterpenoid, glikosida dan tanin, selanjutnya serbuk simplisia diekstraksi secara maserasi bertingkat dengan menggunakan pelarut n-heksan, etilasetat dan etanol 96%. Masing-masing ekstrak dipekatkan dengan bantuan rotary evaporator dan dikeringkan menggunakan
freeze dryer sehingga diperoleh ekstrak kental. Terhadap masing-masing ekstrak diuji aktivitas sitotoksik terhadap sel MCF-7 dan T47D dengan menggunakan metode MTT.
Hasil pengujian sitotoksik ekstrak buah andaliman terhadap sel MCF-7 memberikan nilai IC50 pada ekstrak n-heksan buah andaliman (ENHBA), ekstrak
etilasetat buah andaliman (EEABA), dan ekstrak etanol buah andaliman (EEBA) bertutut-turut sebesar 159,747 µg/ml, 136,490 µg/ml, 957,449 µg/ml dan doksorubicin sebagai pembanding dengan konsentrasi 200 nm. Sedangkan nilai IC50 terhadap sel T47D pada ENHBA 57,013 µg/ml, EEABA 52,031 µg/ml,
EEBA 463,231 µg/ml dan doxorubicin 200 nm sebagai pembanding.
Selanjutnya EEABA dilakukan pemeriksaan KLT dengan hasil menunjukkan mengandung alkaloid, flavonoid dan saponin. EEBA dikombinasikan dengan doxorubicin terhadap sel MCF-7 memberikan hasil yang sinergis yaitu menunjukkan nilai CI < 1. Kombinasi EEABA dan doxorubicin dilakukan uji apoptosis dengan metode flowcytometri, hasilnya tidak menunjukkan mekanisme apoptosis. Pengujian terhadap sel vero menunjukkan EEABA tidak selektif (0,7) terhadap sel MCF-7 dan SI 1,8 terhadap sel T47D.
Combination effects of Fruit Extract Active Andaliman (Zanthoxylum acanthopodiumDC.) And Doxorubicin Against Breast Cancer Cells (MCF-7)
ABSTRACT
Andaliman fruit (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Is one of the wild plant spices whose known by Batak people in North Sumatra, and is often used as a food seasoning. Andaliman fruit is widely used as a spice in cooking of meat and fish dishes to be resistant for several days without causing odor. Lately, andaliman fruit is also said having anticancer properties. The purpose of this study was to determine the cytotoxic effects of the extracts from the fruit andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.), and the combination effect of it with Doxorubicin, apoptosis and selectivity index.
Characterization and phytochemical screening carried out on powdered crude drugs, botanicals powders subsequently extracted by maceration using solvents n-hexane, ethyl acetate and ethanol 96%. Each extract was concentrated with the rotary evaporator and dried using freeze dryer to obtain a viscous extract. Each extract were tested cytotoxic activity against MCF-7 and T47D by using MTT method.
Cytotoxic test results of test solution against MCF-7 cells gave IC
50 ENHBA, EEABA, and EENBA continously contributed 159.747 ug/ml,
136.490 ug/ml, and 957.449 mg/ml. Whereas the IC50 value in the treatment of T47D cells, respectively for 57.013 ug/ml, 52.031 ug/ml and 463.231 mg/ml.
Furthermore EEABA combined with Doxorubicin against MCF-7 cells provide synergistic results that demonstrate the value of CI <1. EEABA and doxorubicin combination do not indicate the mechanism of apoptosis are showed using flowcytometri apoptosis method. Tests on vero cells showed no selective EEABA (0.7) against MCF-7 and SI 1.8 for T47D cells.
Keywords: MCF-7, T47D, anticancer, andaliman (Zanthoxylum
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
PENGESAHAN TESIS ……….… ... iii
KATA PENGANTAR ……….… ... vi
ABSTRAK ……….… ... viii
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR TABEL ... xv
DAFTAR GAMBAR ... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ... xvii
DAFTAR SINGKATAN ... xx
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang …...1
1.2 Perumusan Masalah .. ... 6
1.3 Hipotesis ... .. …… 7
1.4 Tujuan Penelitian ... 7
1.5 Manfaat Penelitian ... 8
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 10
2.1 Uraian Tumbuhan ... 10
2.1.1 Daerah tumbuhan (habitat) ... 10
2.1.2 Morfologi tumbuhan ... 10
2.1.4 Nama asing ... 11
2.1.5 Kandungan kimia ... 12
2.1.6 Kegunaan . ... 12
2.2 Ekstraksi ... 12
2.3 Kanker ……… 14
2.3.1 Siklus Sel ... 17
2.3.2 Karsinogen ... 20
2.3.3 Kanker Payudara ... 22
2.3.4 Sel MCF-7 ... 25
2.3.5 Sel T47D ... 25
2.3.6 P-glycoprotein ... 26
2.3.7 Doxorubicin dan resistensinya pada kanker payudara ... 28
2.3.8 Terapi Kombinasi ... 30
2.4. Uji sitotoksik menggunakan metode MTT ... 32
2.5 Apoptosis ... 33
2.6 Sel Vero ... 36
BAB III METODE PENELITIAN ... 37
3.1 Alat-alat dan Bahan ... 37
3.1.1 Alat-alat ... 37
3.1.2 Pengumpulan Tumbuhan ... 38
3.2 Identifikasi tumbuhan ... 38
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan ... 39
3.4.1 Besi (III) Klorida 1 % b/v ... 39
3.4.10 Pereaksi Liebermann-Burchard ... 41
3.6.5 Pemeririksaan Tanin ... 46
3.6.6 Pemeriksaan Steroid /Triterpenoida ... 46
3.7 Pembuatan Ekstrak Buah Andaliman ... 46
3.8 Sterilisasi Alat dan Bahan ... 47
3.9 Pembuatan Media ... 47
3.9.1 Pembuatan Media DMEM ... 47
3.9.2 Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK-DMEM) ... 48
3.9.3 Pembuatan Media M199 ... 48
3.9.4 Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK-M199) ... 49
3.10 Penumbuhan Sel ... 49
3.10.1 Penumbuhan Sel MCF-7 ... 49
3.10.2 Pertumbuhan Sel T4D7 ... 50
3.10.3 Penumbuhan Sel Vero ... 50
3.10.4 Subkultur Sel ... 51
3.10.5 Panen Sel ... 51
3.10.6 Penghitungan Sel MCF-7, Sel T47D dan Sel Vero ... 51
3.11 Pembuatan Larutan Uji ... 52
3.12 Pengujian Sitotoksik ... 53
3.13 Analisis Hasil ... 53
3.14 Uji Kombinasi ... 54
3.15 Uji Apoptosis ... 56
3.16 Pengujian Sel Vero ... 57
4.2.1 Pemeriksaan makroskopik ... 58
4.2.2 Pemeriksaan mikroskopik ... 59
4.2.3 Hasil pemeriksaan karakterisasi serbuk simplisia ... 59
4.2.4 Pemeriksaan Aprofil KLL ... 61
4.3 Hasil Skrining fitokimia simplisia dan ekstrak ... 62
4.4 Ektraksi ... 64
4.5 Uji sitotoksik ektrak n-heksan, etilasetan dan etanol terhadap sel MCF-7 danT47D ... 64
4.6 Uji kombinasi EEABA-Doxorubicin terhadap MCF-7 ... 66
4.7 Uji Apoptosis ... 68
4.8 Selectivity Index ... 73
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 75
5.1 Kesimpulan……….. ... 75
5.2 Saran .. ... 76
DAFTAR PUSTAKA ... 77
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 3.1 Interpretasi nilai CI (Combination Index) ... 54
Tabel 4.1 Hasil karakterisasi simplisia dan ekstrak buah andaliman ... 59
Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia simplisia dan ekstrak buah andaliman.. 63
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ... 9
Gambar 2.1 Mekanisme Pemompaan oleh Pgp ... 27
Gambar 2.2 Reduksi MTT menjadi Formazan ... 32
Gambar 4.1 Kromatogram ekstrak EEABA dengan fase gerak
Etilasetat : n-heksan (8:2……… 62
Gambar 4.2 Grafik hubungan antara nilai IC50 sel MCF-7 dan T47D
dengan ekstrak ... 66
Gambar 4.3 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 kontrol ... 69
Gambar 4.4 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 yang diberi
Doxorubicin ... 70
Gambar 4.5 Gambaran persentase kondisi sel MCF-7 yang diberi
EEABA.. ... ….. 70
Gambar 4.6 Gambar persentase kondisi sel MCF-7 yang diberi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Surat hasil idetifikasi tumbuhan andaliman ... 85
Lampiran 2 Gambar tumbuhan andaliman ... 86
Lampiran 3 Gambar buah andaliman ... 87
Lampiran 4 Gambar serbuk simplisia buah andaliman ... 88
Lampiran 5 Gambar mikroskopik serbuk simplisia buah andaiman ... 89
Lampiran 6 Bagan pembuatan serbuk simplisia dan skrining fitokimia, karakterisasi simplisia buah andaliman ... 90
Lampiran 7 Bagan pembuatan ekstrak serbuk simplisia buah andaliman... 91
Lampiran 8 Perhitungan kadar air serbuk simplisia ... 92
Lampiran 9 Perhitungan kadar sari larut air serbuk simplisia ... 93
Lampiran 10 Perhitungan kadar larut larut etanol simplisia ... 94
Lampiran 11 Perhitungan kadar abu total simplisia ... 95
Lampiran 12 Perhitungan kadar abu tidak larut asam simplisia ... 96
Lampiran 13 Perhitungan kadar air ekstrak n-heksan ... 97
Lampiran 14 Perhitungan kadar sari larut air ekstrak n-heksan ... 98
Lampiran 15 Perhitungan kadar larut larut etanol ekstrak n-heksan ... 99
Lampiran 16 Perhitungan kadar abu total ekstrak n-heksan ... 100
Lampiran 17 Perhitungan kadar abu tidak larut asam ekstrak n-heksan 101
Lampiran 18 Perhitungan kadar air ekstrak etilasetat ... 102
Lampiran 22 Perhitungan kadar abu tidak larut asam ektrak etilasetat . 106
Lampiran 23 Perhitungan kadar air ekstrak etanol ... 107
Lampiran 24 Perhitungan kadar sari larut air ekstrak etanol ... 108
Lampiran 25 Perhitungan kadar larut larut ekstrak etanol ... 109
Lampiran 26 Perhitungan kadar abu ekstrak etanol ... 110
Lampiran 27 Perhitungan kadar abu tidak larut asam ekstrak etilasetat.. 111
Lampiran 28 Perhitungan persen sel hidup pada sel MCF-7 ... 112
Lampiran 29 Hasil penetuan IC50 sel MCF-7 dengan analisis SPSS 17 .. 114
Lampiran 30 Perhitungan persen sel hidup pada sel T47D... 118
Lampiran 31 Hasil penetuan IC50 sel T47D dengan analisis SPSS 17 .... 120
Lampiran 32 Pembuatan Media DMEM ... 123
Lampiran 33 Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK-DMEM) ... 124
Lampiran 34 Bagan pembuatan media MI99 ... 125
Lampiran 35 Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK-M199) ... 126
Lampiran 47 Bagan Pengujian apoptosis ... 138
Lampiran 48 Bagan Pengujian Sel Vero ... 139
Lampiran 49 Sel Vero di bawah mikroskop ... 140
Lampiran 50 Perhitungan persen sel hidup sel Vero ... 141
Lampiran 51 Hasil penentuan IC50 sel Vero dengan analisa probit SPSS 17 ... ... 142
DAFTAR SINGKATAN
ABC : ATP Binding Cassette protein
ACS : American Cancer Society
ATP : Adenosine Tri Phosphate
Bad : Bcl-2-associated death promoter
Bak : Bcl-2 homologous antagonist/killer
Bax : Bcl-2-associated X
Bcl-2 : B cell lymphoma 2
Bcl-XL : B cell lymphoma-extra large
BCRP : Breast Cancer Resistance Protein
BRCA : Breast cancer
caspase : Cysteine aspartyl specific protease
CCRC : Cancer Chemoprevention Research Center
cdc : Cell division control protein
CDK : Cyclin Dependent Kinase
COX-2 : Cyclooxygenase 2
DAB : 3,3’-diaminobenzidin
dATP : Deoxy Adenosine Tri Phosphate
DME : Dulbecco’s Modified Eagle Media
DMO : Dimetil sulfoksida
DA : Deoxyribosenucleic Acid
EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ER : Estrogen Receptor
FADD : Fas Associating Protein with Death Domain
FasL : Fas Ligan
FBS : Fetal Bovine Serum
HER-2 : Human Epidermal growth factor Receptor-2
IC50 : Inhibitory Concentration 50%
I-κB : Inhibitor κB
LAF : Laminar Air Flow
MDR1 : Multi Drug Resistance 1
MRP : Multidrug Resistance-Associated Protein
MTT : 3-(4,5-dimetil thiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida
NF-κB : Nuclear Factor κB
PARP : Poly(ADP-ribose) Polymerase
PBS : Posphate Buffer Saline
PDB : Protein Data Bank
Pgp, : P-glycoprotein
PI : Propidium Iodida
PUMA : p53 Upregulated Modulator of Apoptosis
RNA : Ribosenucleic Acid
ROS : Reactive Oxygen Species
rpm : Rotation perminute
Smac/DIABLO : Second mitochondria activator of caspases/ Direct Inhibitor of Apoptosis Binding protein with Low PI
TNF : Tumor Necrosis Factor
TNFR-1 : Tumor Necrosis Factor Receptor-1
TRADD : TNF–R1 Associating protein with Death Domain
TRAIL : Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Inducing Ligand
Thr : Treonin
