OPTIMASI PENANDAAN CA 15.3 DENGAN NA 125 I PRODUKSI PRR SEBAGAI PERUNUT KIT IRMA CA 15.3 ABSTRAK ABSTRACT PENDAHULUAN

(1)

94

Prosiding Pertemuan dan Presentasi Ilmiah Penelitian Dasar Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir 2011 Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan - BATAN

Yogyakarta, 19 Juli 2011

OPTIMASI PENANDAAN CA 15.3 DENGAN NA

125

I PRODUKSI PRR

SEBAGAI PERUNUT KIT IRMA CA 15.3

Gina Mondrida, Puji Widayati, Siti Darwati, Sutari, Agus Ariyanto, V. Yulianti, W. Lestari.

Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka – BATAN, Kawasan PUSPIPTEK Serpong

ABSTRAK

OPTIMASI PENANDAAN CA 15.3 DENGAN Na125I PRODUKSI PRR SEBAGAI PERUNUT KIT IRMA CA 15.3. Perunut CA15.3 (CA15.3-125I) merupakan salah satu pereaksi utama dalam Kit IRMA CA15.3 yang digunakan pada deteksi dini kanker payudara. Kanker payudara merupakan penyebab kematian nomor dua untuk perempuan di Indonesia. Sebenarnya, kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang dapat dideteksi secara dini. Salah satu cara yang dapat digunakan untuk deteksi dini kanker payudara adalah dengan menggunakan kit IRMA (immunoradiometricassay) CA 15.3. Agar dapat memproduksi perunut CA15.3 (CA15.3-125I) yang bermutu baik sebagai salah satu komponen pereaksi Kit IRMA CA15.3, pada penelitian ini telah dilakukan penandaan CA15.3 dengan Na125I produksi PRR (hasil reduksi), menggunakan oksidator Kloramin-T. Terhadap masing-masing hasil penandaan dilakukan penentuan yield (% penandaan), aktivitas jenis, kemurnian radiokimia, dan immunologi (B/T). Perunut CA15.3 (CA15.3-125I) yang didapat dari hasil penandaan monoklonal CA15.3 jenis M37901M dengan Na125_{I PRR (hasil reduksi) mempunyai}

kualitas yang baik dengan yield (% penandaan) sebesar 47,03%, aktivitas jenis 22,57 µCi/µg, kemurnian radiokimia 97,5% dan immunologi (B/T) sebesar 19,86% yang dapat digunakan sebagai perunut kit IRMA CA 15.3.

Kata kunci: immunoradiometricassay, kanker payudara, tumor marker, CA-15.3, perunut.

ABSTRACT

CA 15.3 LABELING OPTIMATION WITH Na125I PRODUCTED BY PRR AS CA 15.3 IRMA KIT TRACER. CA 15.3 tracer (CA 15.3-125I) is one of the main reagents in the CA 15.3 IRMA kit used in early detection of breast cancer. Breast cancer is the second cause of death for women in Indonesia. Actually, breast cancer is one type of cancer that can be detected early. One method that can be used for early detection of breast cancer is by using CA 15.3 IRMA (immunoradiometricassay) Kit. For producing a good quality CA15.3 tracer (CA 15.3-125I) as one component of reagent CA 15.3 IRMA Kit, in this research the CA 15.3 are labeled with Na125I produced by PRR (result of reduction) employing Cloramin-T oxidator. The yield of labeling process (%), specific activity radiochemical purity and immunological (B/T) of CA 15.3-125I tracer were obtained from the results of labelling monoclonal CA15.3 of M37901M with Na125I PRR (the reduction) have good quality, the yield (of labeling) was 47.03%, specific activity was 22.57 µCi/µg, radiochemical purity was 97.5% and immunological (B/T = 19.86%) can be used as a tracer of CA 15.3 IRMA Kit.

Key word: immunoradiometricassay, breast cancer, tumor marker, CA-15.3, tracer .

PENDAHULUAN

erdasarkan data dari Yayasan Kanker Indonesia (YKI), kanker payudara merupakan penyebab kematian nomor dua untuk perempuan di Indonesia, pada hal kanker payudara adalah salah satu jenis kanker yang dapat dideteksi secara dini. Namun tingkat kesadaran masyarakat yang rendah untuk melakukan deteksi dini telah menyebabkan jenis kanker ini lebih sering ditemukan pada stadium lanjut yang sulit untuk ditangani [1].

Senyawa Carbohydrate Antigen 15.3 (CA 15.3) dengan berat molekul antara 300.000-450.000 dalton adalah gabungan glycoprotein heterogeneous. Senyawa ini ditemukan dalam serum individu normal dengan konsentrasi di bawah 35 U/mL, sedangkan pada penderita kanker konsentrasi senyawa ini

meningkat lebih tinggi dibadingkan dengan individu normal. Senyawa ini dapat bereaksi dengan monoklonal antibodi CA 15.3. Oleh sebab itu senyawa CA 15.3 dapat digunakan sebagai tumor

marker yang penentuan kadarnya dapat dilakukan

dengan teknik IRMA (Immunoradiometricassay) [2,3].

Dalam IRMA hasil reaksi yang terjadi antara antigen dan antibodi diukur dari radiasi yang dipancarkan oleh radioisotop penanda antibodi [3]. Secara teoritis molekul yang ditandai akan mempunyai sifat immunoreaktif yang sama dengan molekul aslinya. Sebagai radioisotop penanda pada

umumnya digunakan 125I yang mempunyai beberapa

keuntungan, antara lain: mudah berikatan dengan molekul organik terutama yang mengandung gugus tirosil seperti protein maupun molekul yang lebih

(2)

95

kecil seperti tiroksin pada peptida dan hasil

penandaan yang diperoleh dapat mempunyai

kemurnian serta aktifitas jenis yang tinggi. Selain itu

125

I merupakan pemancar γ berenergi rendah (35keV) yang dapat dideteksi dengan kebanyakan alat cacah dengan efisiensi tinggi, serta waktu paruhnya cukup panjang, yaitu 60 hari [4].

Penandaan CA15.3 dengan 125I dilakukan

secara langsung dengan menggunakan oksidator kloramin-T. Pada iodinasi secara langsung dengan menggunakan oksidator tersebut akan terjadi oksidasi

125

I - menjadi kation 125I+, yang dalam suasana basa

lemah segera bereaksi dengan gugus tirosil pada rantai polipeptida. Atom iodium akan mengisi posisi orto dari gugus fenol pada gugus tirosil.

125I - 125I+ + 2e

Gambar 1. Reaksi radioiodinasi langsung.

Kondisi oksidasi 125I- tidak boleh terlalu

kuat karena beberapa ikatan asam amino akan turun teroksidasi dan rantai peptida terputus, sehingga perunut akan cepat rusak. Penambahan dapar

diperlukan untuk menetralkan larutan Na125I yang

pada umumnya diberikan dalam larutan NaOH. Penggunaan salah satu oksidator pada penandaan mempunyai kelebihan atau kekurangan dari oksidator lain. Sebagai contoh oksidator iodogen mempunyai daya oksidasi lebih lemah dari kloramin-T[5].

Perlu diketahui bahwa iodium jarang terdapat secara alami dalam molekul protein, dan adanya sebuah atom iodium yang sama besar dengan satu cincin benzen dapat mempengaruhi sifat fisiologi dan imunologi dari protein tersebut. Dalam beberapa hal protein yang ditandai dengan iodium

mempunyai kecendrungan kurang stabil bila

dibanding dengan protein aslinya[5].

Kualitas dan stabilitas dari hormon / protein

yang ditandai dengan 125I dapat dipengaruhi oleh

beberapa faktor antara lain kemurnian hormon / protein yang akan ditandai, kondisi pada waktu proses iodinasi, prosedur pemurnian setelah iodinasi dan penyimpanan hasil penandaan.

Tujuan penelitian ini adalah untuk

mendapatkan perunut CA15.3 (CA15.3-125I) sebagai

salah satu komponen kit IRMA CA15.3 dengan mutu yang baik, yang dapat digunakan untuk deteksi dini kanker payudara.

TATA KERJA

Bahan dan peralatan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah monoklonal CA 15.3 (Biodesign International USA), Human CA 15.3 antigen

calibrator grade (Biodesign International USA), kit

IRMA CA 15.3 (CIAE China), NaH2PO4.H2O dan

Na2HPO4 (Merck), kolom kromatografi PD-10

(Pharmacia), Na125I (PRR, BATAN), tabung reaksi

polipropilen (NUNC Swedia) dan Bovin Serum

Albumin, BSA ( Sigma ),

Alat yang digunakan dalam penelitian ini

diantaranya adalah pencacah Gamma (600

Gammatec II The Nucleus dan Mini Assay tipe G 20), berbagai ukuran pipet (Eppendorf) beserta

tipnya, pH meter (Fisher Accumet model 810), pengaduk (Vortex), incubator (Soft Incubator SL

1-6000), timbangan analitik (Mettler AE 160)

Penandaan monoklonal antibodi CA 15.3

dengan Na

125

I menggunakan metode

Kloramin-T.

Optimasi penandaan CA 15.3 dilakukan dengan variasi jenis monoklonal yang digunakan (M37552M dan M37901M). Ke dalam tabung iodinasi yang berisi larutan 3,5 µL larutan monoklonal anti CA 15.3 ditambahkan 20 µL dapar

fosfat 0,5 M pH 7,4 dan 3,3 µL Na125I (aktivitas ~

1000 µCi). Selanjutnya ditambahkan 10 µL Kloramin-T (1 mg dalam 1 mL dapar fosfat 0,25 M pH 7,4). Campuran kemudian dikocok selama dua

menit dengan vortex yang diikuti dengan

penambahan 10 µL larutan Na2S2O5 (1 mg Na2S2O5

dalam 1 mL dapar fosfat 0,25 M pH 7,4). Selanjutnya campuran dikocok dengan vortex selama dua menit. Hasil penandaan kemudian dimurnikan dengan menggunakan kolom PD-10 yang telah dikondisikan dengan dapar fosfat 0,01 M pH 7,4 dan dijenuhkan dengan 1 mL larutan BSA 10%. Produk

monoklonal anti CA 15.3 bertanda 125I (selanjutnya

disebut perunut ) dielusi dari kolom PD-10 dengan larutan dapar fosfat 0,01 M pH 7,4 dan fraksi eluat ditampung per fraksi dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 500 µL per fraksi (25 fraksi). Tiap fraksi kemudian diukur radioaktivitasnya dengan alat pencacah Gamma (Gamma Management System,

GMS).

(3)

96

Penentuan

yield

(rendemen

hasil

penandaan)

Fraksi yang mengandung antibodi bertanda kemudian dikumpulkan dan dihitung rendemen penandaannya dengan rumus sebagai berikut:

(1)

Uji kemurnian radiokimia

Uji kemurnian radiokimia antibodi bertanda ditentukan dengan kromatografi lapisan tipis (KLT) dengan fasa diam kertas whatman 1 dan fasa gerak

campuran Ethanol: Butanol: NH4OH dengan

perbandingan 3:2:1. Rf antibodi bertanda = 0,0. (2)

Penentuan

aktivitas

jenis

hasil

penandaan

Aktivitas jenis hasil penandaan ditentukan dengan cara sebagai berikut:

(3)

Protocol Assay

Tabung coated tube (CT) diberi nomor dan ditambah pengencer standar CA 15.3 sebanyak 150 µL. Sejumlah 50 µL larutan standar 0, 15, 50,125 dan 250 mIU/mL dan sampel ditambahkan ke masing–masing tabung CT yang telah diberi nomor. Vortek hingga homogen dan diinkubasi dua jam pada

temperatur 37 oC. Cairan dibuang dan dicuci dengan

aquademin dua kali 1000 µL. Sejumlah 200 µL larutan perunut dengan aktivitas ± 200.000 cpm ditambahkan ke masing-msing tabung CT, vortek hingga homogen dan diinkubasi 3 jam pada suhu ruangan. Cairan dibuang dan dicuci dengan aquademin dua kali 1000 µL, kemudian didekantasi. Tabung diukur dengan alat pencacah Gamma selama 1menit

HASIL DAN PEMBAHASAN

Gambar 2. Kromatogram hasil penandaan monoklonal antibodi CA 15.3 M37901M dan Ca15.3 M37552M

dengan Na125I PRR (hasil reduksi) menggunakan oksidator kloramin-T dan kolom PD-10 serta

eluen dapar fosfat 0,01M pH 7,4. Dari hasil penandaan monoklonal CA15.3

jenis M37552M dengan Na125I PRR (belum

direduksi) menggunakan oksidator kloramin-T, diperoleh hasil penandaan yang sangat rendah (gagal) dengan kemurnian radiokimia serta aktivitas

jenis yang rendah juga, seperti yang terlihat pada

Tabel 1. Hal ini disebabkan karena Na125I yang

digunakan masih mengandung iodat, periodat dan sangat encer (aktivitas 34,3 µCi/µL). Sebaiknya dalam pembuatan perunut untuk Kit RIA/IRMA,

(4)

97

Na125I yang digunakan untuk penandaan harus

mempunyai kemurnian radiokimia yang tinggi dan tidak terlalu encer. Jadi untuk penandaan selanjutnya

Na125I digunakan, setelah melalui proses reduksi

(peningkatan kemurnian kimia iodida) dan

pemekatan.

Dari hasil penandaan monoklonal CA15.3

jenis M37901M dengan Na125I PRR (hasil reduksi)

dengan menggunakan oksidator kloramin-T,

diperoleh hasil penandaan tertinggi 47,03% dengan kemurnian radiokmia 97,5% serta aktivitas jenis 22,57%, seperti yang terlihat pada Tabel 2. Pada percobaan no.1 dan no.2 diperoleh hasil penandaan yang sangat rendah sebesar 2,2% dan 2,6%. Hal ini

disebabkan karena Na125I yang digunakan pada

percobaan no.1 dan no.2 masih encer (aktivitas 30 µCi/µl dan 34,3 µCi/µL). Dari Tabel 2 terlihat,

semakin pekat Na125I yang digunakan, hasil

penandaan akan semakin tinggi. Jadi dalam pembuatan perunut untuk Kit RIA/IRMA, sebaiknya

volume Na125I yang digunakan untuk penandaan <10

µL dengan aktivitas >100 µCi/µL

Dari hasil penandaan monoklonal anti CA15.3 jenis M37901M dan M37552M dengan

Na125I PRR (hasil reduksi) menggunakan oksidator

kloramin-T seperti yang terlihat pada Tabel 3, diperoleh hasil penandaan tertinggi pada percobaan no.2 sebesar 47,03% dengan kemurnian radiokmia 97,5% dan aktivitas jenis 22,57 µCi/µg serta uji immunologi (%B/T) = 19,86%. Pada percobaan no.4 diperoleh hasil penandaan sebesar 27,48% dengan kemurnian radiokmia 95,8% dan aktivitas jenis 13,19 µCi/µg serta uji immunologi (%B/T) = 6,61%. Hasil penandaan no.4 lebih rendah dibanding dengan no.2, meskipun sudah menggunakan volume Na125I yang sama sebesar 3 µL. Hal ini disebabkan percobaan no.4 menggunakan monoklonal anti CA15.3 jenis M37552M, yang mempunyai paring yang berbeda dengan monoklonal anti CA 15.3 jenis M37901M, dimana monoklonal jenis M37552M khusus untuk

coated tube, sedangkan monoklonal jenis M37901M

khusus untuk labelling, sehingga hasil penandaan tidak optimal.

Tabel 1. Hasil Penandaan monoklonal anti CA 15.3 jenis (M37552M) dengan Na125I PRR (belum direduksi)

menggunakan Oksidator Kloramin-T dengan memvariasikan jumlah monoklonal anti CA 15.3 (M37552M). No CA 15.3 (µg ) Na125I µCi (35µL) Hasil Penandaan (%) Aktivitas Jenis (µCi/µgr) Kemurnian Radiokimia (%) 1 5 1200 2,19 5,26 85,10 2 10 1200 2,79 3,35 86,25 3 15 1200 2,65 2,12 87,13 4 20 1200 2,61 1,56 91,99 5 25 1200 2,39 1,15 90,81 6 30 1200 2,14 0,86 90,44

Tabel 2. Hasil Penandaan monoklonal anti CA 15.3 jenis (M37901M)dengan 1,2 mCi Na125I menggunakan

Oksidator Kloramin-T dengan memvariasikan konsentrasi Na125I yang di gunakan.

No CA 15.3 (µg ) VolumNa125I (µL ) Hasil Penandaan (%) Aktivitas Jenis (µCi/µgr) Kemurnian Radiokimia(%) 1 25 40 2,2 1,06 86,4 2 25 35 2,6 1,25 87,6 3 25 15 16,0 7,68 89,7 4 25 6 39,3 18,86 95.2 5 25 3 47,03 22,57 97,5

(5)

98

Tabel 3. Hasil Penandaan monoklonal anti CA 15.3 M37901M dan CA 15.3 M37552M dengan 1,2 mCi Na125I

PRR (hasil reduksi) menggunakan Oksidator Kloramin-T.

No Jenis CA15.3 Vol Na

125 I (µL) Hasil Penandaan (%) Aktivitas Jenis (µCi/µgr) Kemurnian Radiokimia(%) Immunologi (%B/T) 1 M37901M 35 2,60 1,25 87,6 5,51 2 M37901M 3 47,03 22,57 97,5 19,86 3 M37552M 35 2,39 1,14 85,9 1,09 4 M37552M 3 27,48 13,19 95,8 6,61

KESIMPULAN

Hasil penandaan monoklonal antibodi CA

15.3 jenis M37901M dengan Na125I PRR (hasil

reduksi) memberikan hasil yang baik, dengan rendemen hasil penandaan 47,03%, aktivitas spesifik 22,57 µCi/µg, kemurnian radiokimia 97,5% dan uji immunologi 19,86%. Monoklonal antibodi CA 15.3 jenis M37901M merupakan bahan dasar yang baik untuk pembuatan perunut dibandingkan monoklonal jenis M37552M, yang hanya memberikan rendemen hasil penandaan 27,48%, aktivitas spesifik 13,19 µCi/µg, kemurnian radiokimia 95,8% dan uji immunologi 6,61%.

Perunut CA15.3 (CA15.3-125I) yang didapat

hasil dari penandaan CA 15.3 jenis M37901M

dengan Na125I PRR (hasil reduksi) yang telah

dipekatkan dan dimurnikan mempunyai kualitas yang baik dan dapat digunakan sebagai perunut Kit IRMA CA 15.3.

DAFTAR PUSTAKA

1. ANONIMOUS, Kurang kesadaran dan rendahnya kewaspadaan terhadap kanker payudara, Yayasan Kanker Indonesia (YKI), 2007.

2. G.BANFI, P. PARMA, M. PONTILLO, 1997, Stability of Tumor Marker CA 19.9, CA 125, and CA 15.3 in Serum Obtained from plain Tubes and Tubes containing Thxotropic Gel Separator, Clinical Chemistry, 43: 2430-2431.

3. DE LA LANDE B, HACENE K, FLOIRAS J L, at all, 2002, Prognotic value of CA 15.3 kinetic for metastatic breast cancer, Service de Radiotherapie, Centre Rene Huguenin de Luttle

Contre le Cancer, saint-Cloud, France, Oct-Dec:17(4):231-8.

4. WAYAN RADIATNING S, SUKIYATI

DJ,2000, Immunoradiometricassay (IRMA)

Dalam Deteksi Dan Pemantauan Kanker, Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka, P2RR-BATAN, Serpong, Vol.3, No 1, halaman 55-70.

5. R.S.WAYAN, Dasar - dasar RIA dan IRMA, Pusdiklat BATAN, Jakarta, 1993.

TANYA JAWAB

Maiyesyi - PRR

 Parameter apa saja yang dioptimasi?

 Bagaimana dengan sebelum dioptimasi?

Gina Mondrida

 Parameter yang dioptimasi adalah”

1. Jumlah (µg) monoclonal CA15.3 yang digunakan

2. Volume (µl)Na 125I yang dipakai 3. Jenis monoclonal CA15.3 yang

digunakan

 Kondisi sebelum dioptimasi menghasilkan

yield penandaan yang rendah (±2%) dengan kemurnian radiokimia yang rendah pula, sehingga perunut yang diperoleh tidak bisa digunakan. Setelah dioptimasi menghasilkan yield penandaan yang tinggi (47,03%) dan kemurnian radiokimia sebesar 97,5%. Perunut yang diperoleh setelah dioptimasi, dapat digunakan sebagai perunut Kit IRMA CA15.3