UJI KARBOHIDRAT SECARA KUANTITATIF

UJI KARBOHIDRAT



_{Uji Kualitatif}

o

_{Uji Molisch}

o

_{Uji Seliwanoff}

o

_{Uji Anthrone}

o

_{Uji Benedict}

o

_{Uji Barfoed}

o

_{Uji Iodin}

o

_{Uji Pembentukan Osason}

o

_{Uji Fehling}

Analisa Karbohidrat



_{Uji Kuantitatif}

o

_{Cara Kimiawi}

o

_{Cara Enzimatis}

o

_{Cara kromatografi}

o

_{Cara Optic (fisis)}

II. Uji Karbohidrat secara Kuantitatif

Hidrolisa

Oligo / polisakarida → monosakarida (Pati) Asam atau enzim (glukosa)

Penentuan karbohidrat dari kelompok polisarida dan oligisakarida, perlu perlakuan pendahuluan , yaitu hidrolisa sehingga diperoleh monosakarida.

Penentuan monosakarida:  _kimiawi  _fisik

 _enzimatik  _kromatografi

Cara kimiawi

1. Metoda oksidasi dengan kupri

Dasar : reduksi kuprioksida menjadi kuprooksida karena adanya gula reduksi

Reagen :

- Reagen Luff (campuran CuSO₄, Na₂CO₃, dan asam sitrat) - Reagen soxhlet (campuran CuSO₄ dengan K – Na –tartrat)

kuprioksida  - sebagai oksidator

- direduksi oleh gula reduksi membentuk

kuprooksida (endapan merah bata)

Penentuan kuprooksida yang terbentuk:



_{Menimbang setelah dikeringkan}



_{Melarutkan kembali, kemudian dititrasi}



_{Menentukan selisih kuprioksida sebelum dan}

sesudah direaksikan dengan gula reduksi

Penentuan gula reduksi dalam larutan:  _{Cara luff Schoorl}

 _{Cara Munson Walker}  Cara Lane-Eynon

Cara Luff Schoorl

Yang ditentukan adalah CuO sebelum dan sesudah

direaksikan dengan gula reduksi

= (titrasi blanko – titrasi sampel)

Reaksi :

R – COH + CuO  Cu

₂

O + R – COOH

H

₂

SO

₄

+ CuO  CuSO

₄

+ H

₂

O

CuSO

₄

+ 2KI  CuI

₂

+ K

₂

SO

₄

2CuI

₂

 Cu

₂

I

₂

+ I

₂

I

₂

+ Na

₂

S

₂

O

₃

 Na

₂

S

₄

O

₆

+ NaI

I

₂

+ amilum : biru

Metode oksidasi dengan larutan Ferrisianida alkalis

Dasar : reduksi ferisianida  ferrosianida oleh gula reduksi. 2K₃Fe(CN)₆ + 2KI  2K₄Fe(CN)₆ + I₂

2K₄Fe(CN)₆ + 3 ZnSO₄  K₂Zn₂[Fe(CN)₆]₂↓ + 3 K₂SO₄ gula reduksi ditentukan :

 berdasar ∑ I₂

 berdasar ∑ NaS₂O₃ untuk titrasi

Indikator : amilum (warna biru hilang)

K₄Fe(CN)₆ yang terbentuk dihitung dari selisih antara K₃Fe(CN)₆ sebelum dan sesudah reaksi reduksi.

Metoda Iodometri



Kelebihan I

2

dititrasi dengan Na

2

S

2

O

3



_{Reaksi : Sampel Spesifik untuk}

aldosa, ketosa hanya sedikit yang

teroksidasi



_{Harus dihilangkan zat yang dapat}

bereaksi dengan Iodin : etanol,

aseton, mannitol, gliserin, Na laktat,

Na format dan Urea

Laktosa secara kimiawi

 _{25 ml susu + reagen  filtrat}

 5 ml filtrat + reagen  titrasi dengan Na₂S₂O₃ 100 A = (Tb – Ts) x N x 0,171 x  5 A = Kadar Laktosa (g/100 ml) Tb = titrasi blanko Ts = titrasi sampel

 _{Susu dengan kadar protein = 3,2%, lemak = 3,5%} dari 100 ml susu  48,4 ml filtrat

48,4 100

Kadar laktosa/100 ml susu = A x  x  100 25

Penentuan Sukrosa



_{Langsung dengan Polirimeter/refraktometer}



_{Kimia : hidrolisa (tentukan jumlah gula reduksi)}

C

₆

H

₁₂

O

₁₁

+ H

₂

O  C

₆

H

₁₂

O

₆

+ C

₆

H

₁₂

O

₆

Sukrosa fruktosa

glukosa

(342)

(180)

(180)

∑

Sukrosa = 0,95 x

∑

gula reduksi

↓

BM Sukrosa 342

FK =



=



2 BM gula reduksi 360

Penting : Cek dulu kemungkinan adanya gula reduksi

dalam sampel sebelum hidrolisa.

Penentuan pati

Prinsip : pati dihidrolisa dengan asam/enzim 

gula reduksi  ditera jumlahnya

[C

₆

H

₁₀

O

₂₅

] m + mH

₂

O  m C

₆

H

₁₂

O

₆

pati

glukosa

BM = m.162

BM = 180 m

BM pati

FK =



m . BM gula reduksi

m x 162

=



= 0,9

m x 180

Cara Enzimatis



_{Terutama untuk penentuan gula dalam}

campuran

 karena enzim bersifat spesifik

Misal: penentuan glukosa dan fruktosa



_{Dasar :}

glukosa dan fruktosa difosforilasi menjadi

glu–6-fosfat (G6P) dan fruktosa-6-fosfat (F6P)

dengan bantuan enzim heksokinase dan Adenosin–

5-trifosfat (ATP)

G-6-P-DH

G-6-P + NADP → glukonat 6P + NADPH + H+

NADPH yang terbentuk setara dengan glukosa yang bereaksi  diukur dengan spektrofotometer (λ = 334, 340, 365 nm)

PGI

F-6-P → G-6-P

G-6P-DH

G-6-P + NADP → glukonat-6-P + NADPH + H+

↓ Ditera

Glu + ATP  G-6-P + ADP Fruk + ATP  F-6-P + ADP

Penentuan Laktosa dan Galaktosa

Dasar :

β galaktosidase

Laktosa + H₂O Glukosa + β galaktosa

Gal DH

β galaktosa + NAD → asam galatonat + NADH + H+

↓

C. Cara Khromatografi

Khromatografi kertas/TLC : diukur besarnya Rf tiap komponoen karbohidrat

Jarak perpindahan molekul zat Rf = 

Jarak perpindahan pelarut

Harga Rf

tiap jenis gula tertentu untuk perlakuan yang sama dipengaruhi :

- Macam zat pelarut - Ukuran bejana

- Suhu

- Macam fase tetap/stasioner - Sifat zat yang dianalisa



_{Zat penyangga : kertas yang tersusun}

oleh selulosa murni (misal: kertas

whatman no.1 kecepatan merambat zat

sedang), dipotong sesuai kebutuhan.



_{Teteskan sampel (sekecil mungkin),}

penetesan 3-4 x (tetesan besar  terjadi

tailing/pemisah tidak sempurna)



_{Masukkan kertas ke dalam wadah berisi}

pelarut  pelarut merambat pada kertas

sampai tanda (Solvent front)

- Larutan khloroglusional dan HCl dapat digunakan untuk:

 _{Aldosa pentosa (violet)}

 _{Ketosa pentosa (hijau tua)}  _{Ketoheksosa (kuning coklat)}  _{Metil pentosa (hijau )}

 _{Identifikasi :}

_{Cara fisis : menyinari kertas dengan sinar UV} pada λ: 254 – 370 nm

_{Kimiawi : semprot dengan larutan kimia} misal:

-gula reduksi: anilinpthalat, AgNO3



_{Zat pelarut: zat murni atau campuran}



_{Untuk penentuan gula sederhana:}

Campuran butanol : asetat : air atau

asam asetat : pyridin : air (4:1:5)

Uap Iodin



_{Semprotkan pada kertas diruang asam}



_{Setelah kering akan timbul noda berwarna}



_{Hitung Rf, bandingkan dengan standar}

Cara fisis (Cara optic)



_{Penentuan index bias dengan refraktometer}



tiap jenis gula punya index bias tertentu

.



_Keuntungan:

• interval skala index bias cukup besar 1,30 – 1,75

• sampel sangat sedikit (beberapa tetes)

• ketelitian :

_±

0,0002



_{dinyatakan dengan}

=

pengukuran pada t = 20oC dengan sinar Natrium

sebagai sumber sinar monokromatis.

20

D



_{Pengaruh konsentrasi terhadap (}

α

_{) sangat}

kecil  diabaikan



_{Suhu berpengaruh  perlu koreksi :}

Penentuan karbohidrat dengan polarimeter

Dasar: Karbohidrat bersifat optis aktif (mampu memutar

bidang sinar terpolarisasi), karena mempunyai C asimetri

Keuntungan

 _{Sampel tidak mengalami kerusakan}

 _{Dapat dilakukan cepat}

Agar hasil teliti, maka:

 _{Larutan harus jernih dan tidak berwarna}

_{Larutan tidak mengandung bahan asing yang}

bersifat optis aktif

_{Konsentrasi sampel yang optimum: tidak}

Penentuan dengan polarimeter

Hukum biot: kapasitas rotasi tiap individu gula

sebanding dengan konsentrasi larutan dan panjang

cairan dalam tabung

[α] : putaran/ritasi spesifik t : suhu pengukuran (oC) D : sinar Na (589 nm)

α : sdf putar yang diamati

C : konsentrasi (g sampel/100 ml pelarut) I : panjang tabung (dm)

[ ]

lC

D t

α

α

=

100

Penentuan Serat Kasar



_{Serat kasar :}

Senyawa yang tidak dapat dicerna dalam

organ pencernaan manusia maupun

binatang.



_{Dalam analisa : diperhitungkan}

banyaknya zat yang tidak larut dalam

asam/basa encer pada kondisi tertentu.

 _{Protein menyulitkan penyaringan  perlu digesti} pendahuluan dengan enzim proteolitik

 _{Residu = serat kasar yang mengandung 97%} selulosa dan lignin  sisanya adalah senyawa yang belum dapat diidentifikasi

1. Defatting : menghilangkan lemak dalam

sampel dengan pelarut lemak

2. Digestion :

- pelarutan dengan asam

- pelarutan dengan basa



dalam keadaan tertutup pada temperatur terkontrol (mendidih)



segera dilakukan penyaringan untuk mencegah kerusakan lebih lanjut