LAPORAN PRAKTIK Pr. An. MAKANAN DAN MINUMAN
ANALISA KUALITATIF PROTEIN DAN ASAM AMINO
SECARA REAKSI WARNA DAN KLT
OLEH :
ENY YUNIARTI (09.009)
RAHADIAN DWI SWAMIN NANDA (09.026)
RINDHA FIOTELA N (09.027)
AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN
PUTRA INDONESIA MALANG
2009/2010
TUJUANMahasiswa dapat melakukan analisa protein dan asam amino tertentu secara kualitatif pada makanan.
DASAR TEORI
Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.
Struktur umum asam amino
Fungsi Protein
1. Sebagai katalis reaksi enzimatis, yaitu reaksi-raksi kimia yang terjadi dalam sistim biologi. Contoh : pepsin, isomerase, β – galaktosidase
2. Sebagai sarana transportasi, sejumlah protein spesifik berperan sebagai proses transport ion dan molekul-molekul kecil. Contoh : hemoglobin
3. Sebagai koordinasi dalam pergerakan, yaitu sebagai pembantu sel dalam berkontraksi. Contoh : aktin dan miosin, tubulin dan protofilamen
4. Sebagai pendukung mekanik / kerangka : sebagai pertahanan kekuatan kulit dan tulang. Contoh : kolagen, keratin, fibroin.
5. Sebagai sistim kekebalan atau perlindungan yaitu pertahanan sel dalam serangan benda asing, contoh : Imuniglobin atau antibodi
6. Penghasil dan penerus rangsangan sistim saraf . Contoh : rhodopsin Sebagai kontrol pertumbuhan dan diferensiasi. Contoh : protein hormone
Keuntungan Protein
1. Sumber energi
2. Pembetukan dan perbaikan sel dan jaringan
3. Sebagai sintesis hormon,enzim, dan antibodi
4. Pengatur keseimbangan kadar asam basa dalam sel
Penggolongan
Penggolongan protein dibedakan menjadi beberapa macam, antara lain:
A. Berdasarkan struktur molekulnya
Struktur protein terdiri dari empat macam:
1. Struktur primer (struktur utama)
Struktur ini terdiri dari asam-asam amino yang dihubungkan satu sama lain secara kovalen melalui ikatan peptida.
2. Struktur sekunder
Protein sudah mengalami interaksi intermolekul, melalui rantai samping asam amino. Ikatan yang membentuk struktur ini, didominasi oleh ikatan hidrogen antar rantai samping yang membentuk pola tertentu bergantung pada orientasi ikatan hidrogennya.
3. Struktur Tersier
Terbentuk karena adanya pelipatan membentuk struktur yang kompleks. Pelipatan distabilkan oleh ikatan hidrogen, ikatan disulfida, interaksi ionik, ikatan hidrofobik, ikatan hidrofilik.
Terbentuk dari beberapa bentuk tersier, dengan kata lain multi sub unit. Interaksi intermolekul antar sub unit protein ini membentuk struktur keempat/kuartener
B. Berdasarkan Bentuk dan Sifat Fisik
1. Protein globular
Terdiri dari polipeptida yang bergabung satu sama lain (berlipat rapat) membentuk bulat padat. Misalnya enzim, albumin, globulin, protamin. Protein ini larut dalam air, asam, basa, dan etanol.
2. Protein serabut (fibrous protein)
Terdiri dari peptida berantai panjang dan berupa serat-serat yang tersusun memanjang, dan memberikan peran struktural atau pelindung. Misalnya fibroin pada sutera dan keratin pada rambut dan bulu domba. Protein ini tidak larut dalam air, asam, basa, maupun etanol.
C. Berdasarkan Fungsi Biologi
Pembagian protein didasarkan pada fungsinya di dalam tubuh, antara lain:
1. Enzim (ribonukease, tripsin)
2. Protein transport (hemoglobin, mioglobin, serum, albumin)
3. Protein nutrien dan penyimpan (gliadin/gandum, ovalbumin/telur, kasein/susu, feritin/jaringan hewan)
4. Protein kontraktil (aktin dan tubulin)
6. Protein Pertahanan (antibodi, fibrinogen dan trombin, bisa ular)
7. Protein Pengatur (hormon insulin dan hormon paratiroid)
D. Berdasarkan Daya Larutnya
1. Albumin
Larut air, mengendap dengan garam konsentrasi tinggi. Misalnya albumin telur dan albumin serum
2. Globulin Glutelin
Tidak larut dalam larutan netral, larut asam dan basa encer. Glutenin (gandum), orizenin (padi).
3. Gliadin (prolamin)
Larut etanol 70-80%, tidak larut air dan etanol 100%. Gliadin/gandum, zein/jagung
4. Histon
Bersifat basa, cenderung berikatan dengan asam nukleat di dalam sel. Globin bereaksi dengan heme (senyawa asam menjadi hemoglobin). Tidak larut air, garam encer dan pekat (jenuh 30-50%). Misalnya globulin serum dan globulin telur.
5. Protamin
Larut dalam air dan bersifat basa, dapat berikatan dengan asam nukleat menjadi nukleoprotamin (sperma ikan). Contohnya salmin
As. Amino merupakan bagian struktur protein dan menentukan banyak sifatnya yang penting .
Macam as amino & sifat
1. Asam Amino dengan gugus R yang tak mengutub (nonpolar). Ex. Alanin, Valin, Leusin dan isoleusin .
2. Asam Amino dengan gugus R yang mengutub tak bermuatan (polar). Ex. Glisin, Serin, Treonin, tyrosin, asparagin, dan glutamin .
3. Asam Amino dengan gugus R bermuatan negatif (asam amino asam) Ex. As. Aspartat, As. Glutamate .
4. Asam Amino dengan gugus R bermuatan positif (asam amino basa) Ex. Lisin, Arginin, Histidin.
5. Tiga Asam amino dengan rantai samping aromatik Ex:
- Fenillalanin mempunyai cirri-ciri fenilteriat dengan gugus mesilen (-CH2-)
- Triptofan mempunyai cirri-ciri indol yang terikat pada gugus metilen - Cincin aromatic tirosin mempunyi gugus hidroksil
6. Asam amino memiliki rantai samping asam belerang.
Ex. Sistein mengandung gugus sulfidril (-SH) dan metion mengandung atom belerang dengan bentuk ikatan tioeter (-S-CH3)
Peptida
Protein kata-kata, polipeptida, dan peptida adalah suatu rancu yang kecil dan kaleng tumpang-tindih di dalam maksud(arti. Protein adalah secara umum digunakan untuk mengacu pada molekul biologi yang lengkap di suatu penyesuaian yang stabil, sedangkan peptida adalah secara umum terpesan untuk suatu oligomer-oligomer asam amino yang pendek sering kali kekurangan suatu yang stabil tiga struktur dimensional.
Sifat-sifat protein yang penting :
1. Ionisasi : apabila larut dalam air akan membentuk ion ( + dan - )
2. Denaturasi : perubahan konformasi serta posisi protein sehingga aktivitasnya berkurang atau kemampuannya menunjang aktivitas organ tertentu dalam tubuh hilang → tubuh mengalami keracunan.
3. Viskositas : tahanan yang timbul adanya gesekan antara molekul didalam zat cair yang mengalir.
4. Kristalisasi : proses yang sering dilakukan dengan jalan penambahan garam amonium sulfat atau NaCl pada larutan dengan pengaturan pH pada titik isolistriknya.
5. Sistim Koloid : sistem yang heterogen terdiri atas dua fase yaitu partikel kecil yang terdispersi dari medium atau pelarutnya ( Poedjiadi ,1994).
Macam-macam uji protein 1. Uji Millon.
a. Uji ini dilakukan untuk mengetahui adanya gugus hidroksifenil (tyrosin). Reaksi yang terjadi merupakan pengikatan Hg pada hidrokifenil menghasilkan kompleks berwarna merah.
b. Prosedur : Sebanyak 5 tetes pereaksi Millon ditambahkan ke dalam 3 mL larutan protein, dipanaskan. Uji dilakukan terhadap larutan gelatin 2%, kasein 2%.
2. Uji Biuret.
a. Uji ini dilakukan untuk mengetahui adanya ikatan pepida. Reaaksi positif bila terjadi warna ungu karena adanya kompleks yang terjadi antara ikatan peptide dengan O dari air. Reaksi ini disebut reaksi biuret karena positif terhadap biuret ( kondensasi 2 molekul urea) .
b. Prosedur : Sebanyak 3 mL larutan protein ditambah 1 mL NaOH 10% dan dikocok. Ditambahkan 1-3 tetes larutan CuSO4 0.1%. Diamati timbulnya
warna.
Reaksi uji Biuret :
CH2 C NH2 HOOC H NaOH CuSO4 CH2 CH2 C C NH2 C H O O H NH2 C O O CU PROTEIN 3. Uji Ninhidrin.
a. Uji ini dilakukan untuk menentukan adanya asam amino. Reaksi pada ninhydrin ini memyebabkan dekarboksilasi oksidatif dari asam amino yng menghasilkan CO2, NH3 dan aldehida yang rantainya lebih pendek 1 C dari
asam amino asalnya. Ninhydrin yang tereduksi akan bereaksi dengan NH3
sehingga membentuk senyawa kompleks berwarna biru dengan absorpsi warna maksimum pada panjang gelombang 570 nm.
b. Prosedur : Sebanyak 0.5 mL larutan ninhidrin 0.1% ditambahkan ke dalam 3 mL larutan protein. Dipanaskan selama 10 menit, diamati perubahan warna yang terjadi. Uji dilakukan terhadap larutan gelatin 0.02%, kasein 0.02%, dan pepton 0.02%.
Reaksi kimia yang terjadi :
O O OH OH NINHIDRIN C H R C N OH O H H
GUGUS AM INO GU GUS KARBONIL
O O O N RCHO CO2 3 H2O H+ VIOLET ANION 4. Uji belerang.
a. Uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi asam amino yang mengandung gugus sulfur yaitu sistein dan methionin. Reaksi yang terjadi dilakukuan oleh
Pb-asetat dengan asam amino membentuk endapan berwarna kelabu yaitu garam PbS. Penambahan NaOH ditujukn untuk mendenaturasi protein sehingga ikatan yang menghubungkan atom sulfur dapat terputus oleh Pb-asetat membentuk PbS.
b. Prosedur : Sebanyak 2 mL larutan protein ditambah 5 mL NaOH 10%, dipanaskan selama 5 menit. Kemudian ditambah 2 tetes larutan Pb-asetat 5%, pemanasan dilanjutkan, diamati warna yang terjadi. Uji dilakukan terhadap larutan gelatin 0.02%, kasein 0.02%.
Reaksinya uji sulfur :
HS C H2 H C COOH H2N Pb2+ Pb2S H C HN2 COOH H3C COKLAT HITAM 5. Uji Xanthoproteat.
a. Uji ini menunjukan adanya inti benzene (cincin fenil), maka digunakan untuk identifikasi tyrosin, tripthopan dan fenilalanin. Hasil yang didapatkan adalah endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning bila dipanaskan. Reaksi yang terjadi adalah nitrasi pada inti benzene yang terdapat pada inti protein.
b. Prosedur : Sebanyak 2 mL larutan protein ditambahkan 1 mL HNO3 pekat, dicampur, kemudian dipanaskan, diamati timbulnya warna kuning tua. Didinginkan, ditambahkan tetes demi tetes larutan NaOH pekat sampai larutan menjadi basa. Diamati perubahan yang terjadi. Uji dilakukan terhadap larutan gelatin 2%, kasein 2%.
Reaksi Xanthoprotein :
a. Uji ini menunjukan adanya inti indol dan triphopan. Reaksi yang terjadi adalah 2 inti indol dan aldehid menyebabkan adanya cincin ungu pada bidang batas. Hasil yang didapatkan adalah cincin ungu pada batas dua lapisan.
b. Prosedur : sampel protein diteteskan dengan formal dehid dan mrkuri sufat yang kemudian dialiri dengan asam sulfat.
7. Uji kromatografi lapis Tipis
a. Uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi protein yang terdiri dari asam amino yang akan dibandingakan dengan pembanding (standart).
b. Prosedur : Mengambil 30 g sampel lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer, tambahkan 10 ml HCl 8 N untuk masing-masing erlenmeyer, tutup erlenmeyer dengan menggunakan kapas dan dibungkus dengan kertas. Di masukkan dalam autoklaf 1 atm didapatkan campuran dari as. Amino yang terhidrolisis. Hidrolisat yang didapat ditambahkan dengan natrium bikarbonat sampai pH-nya netral. Kemudian masing-masing dilarutkan dalam metanol lalu ditotolkan pada plat KLT. Plat dikeringkan di udara terbuka,selanjutnya dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan eluen. Sebagai eluen digunakan etanol 96% : air (70 : 30) dan butanol : as. Asetat : air (80 : 20 : 20). Eluen dibiarkan naik sampai tanda batas, kemudian plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Semprotkan pereaksi ninhidrin lalu panaskan diatas hotplate sampai terlihat warna biru-ungu.
8. Pengendapan dengan logam
• Tempatkan 3 ml larutan protein (gelatin dan albumin) pada tabung reaksi.
• Tambahkan 5 tetes HgCl2 0,02 M.
• Ulangi percobaan dengan menggunakan Pb asetat 0,2 M.
9. Pengendapan dengan garam
• Jenuhkan 5 ml larutan protein (gelatin dan albumin) dengan ammonium sulfat. Untuk pekerjaan ini yang dilakukan : pertama tambahkan sedikit garam
tersebut ke dalam larutan protein (gelatin dan albumin), aduk hingga melarut. Tambahkan lagi sedikit ammonium sulfat aduk lagi, lakukan sehingga sedikit garam tertinggal tidak larut.
• Setelah larutan jenuh, lalu disaring.
• Uji kelarutan endapan di dalam air.
• Uji pula endapan dengan reagen million dan filtrat dengan uji biuret.
10. Uji Koagulasi
• Tempatkan 5 ml larutan protein (gelatin dan albumin) ke dalam tabung reaksi.
• Tambahkan 2 tetes asam asetan 1 M.
• Letakkan tabung dalam air mendidih selama 5 menit.
• Ambil endapan dengan batang pengaduk.
• Uji kelarutan endapan di dalam air.
• Uji pula endapan dengan dengan reagen million.
Hidrolisis Protein
Ikatan peptida yang membangun rantai polipeptida dalam protein dapat diputus (dihidrolisis) menggunakan asam, basa atau enzim pemecahan ikatan peptida dalam kondisi asam atau basa kuat merupakan proses hidrolisis kimia dan pemecahan ikatan peptida menggunakan enzim merupakan proses hidrolisis biokimia reaksi hidrolisis peptida akan menghasilkan produk reaksi yang berupa satu molekul dengan gugus karboksil dan molekul lainnya memiliki gugus amina.
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antar asam amino tersebut. Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi, dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi adalah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, dan kromatografi penukar ion.
ALAT DAN BAHAN Alat :
- tabung reaksi - rak tabung reaksi - gelas pengaduk - chamber - beaker glass - plat tetes - plat KLT - botol semprot Bahan : - kacang merah - albumin - gelatin - pepton - kasein - HNO3 - NaOH - Lart ninhydri 1% - Lart Pb-asetat - CuSO4 - Etanol 96% - HCl - Natrium bikarbonat - Aqudest PROSEDUR a. Reaksi Warna 1. Uji ninhydrin
- Mengambil 3ml sampel ditambahkan 0,5 ml larutan ninhidrin 0,1 %
- Memanaskan selama 10 menit, diamati perubahan warna yang terjadi.
- Uji dilakukan terhadap larutan gelatin 2%, kasein 2%,
2. Uji biuret
- Mengambil 3 mL sampel ditambah 1 mL NaOH 10% dan dikocok.
- Menambahkan 1-3 tetes larutan CuSO4 0.1%.
- Mengamati timbulnya warna. 3. Uji sulfur
- Mengambil 2 mL sampel ditambah 5 mL NaOH 10%, dipanaskan selama 5 menit.
- Menambah 2 tetes larutan Pb-asetat 5%, pemanasan dilanjutkan, diamati warna yang terjadi.
4. Uji xanthoprotein
- Mengambil 2 mL sampel ditambahkan 1 mL HNO3 pekat, dicampur, kemudian dipanaskan, diamati timbulnya warna kuning tua. Didinginkan,
- Menambahkan tetes demi tetes larutan NaOH pekat sampai larutan menjadi basa. Diamati perubahan yang terjadi.
- Uji dilakukan terhadap larutan gelatin 2%, kasein 2%, 5. Uji KLT
Preparasi sampel
- Mengambil 30 g sampel lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer, tambahkan 10 ml HCl 8 N untuk masing-masing erlenmeyer, tutup erlenmeyer dengan menggunakan kapas dan dibungkus dengan kertas.
- Di masukkan dalam autoklaf 1 atm.
- Hidrolisat yang didapat ditambahkan dengan natrium bikarbonat sampai pH-nya netral.
Eluasi
- Kemudian masing-masing dilarutkan dalam metanol lalu ditotolkan pada plat KLT.
- Plat dikeringkan di udara terbuka,selanjutnya dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan eluen.
- Mengeluasi sampel dalam eluen yang telah jenuh.
- Eluen dibiarkan naik sampai tanda batas, kemudian plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan.
- Menyemprotkan pereaksi ninhidrin lalu panaskan diatas hotplate sampai terlihat warna biru-ungu.
HASIL PENGAMATAN
a. Reaksi warna
SAMPEL UJI
NINHIDRIN BIURET SULFUR XANTOPROTEIN
Kacang merah mentah Larutan biru (+) Larutan ungu (+) Putih (-) Kuning (+) Kacang merah matang Larutan biru (+) Larutan ungu (+) Putih (-) Kuning(+)
Casein Larutan biru (+)
Larutan ungu (+)
Putih (-) Larutan kuning (+)
Gelatin (-) Larutan ungu
(+)
b. Hasil KLT 1. Glysin Rf : 2. Tyrosin Rf : 3. Phenilalanin Rf :
4. Kacang merah mentah
Rf :
5. Kacang merah matang
Rf :
2
3 4 5
PEMBAHASAN
Praktikum kali ini dilakukan identifikasi protein dengan menggunakan metode reaksi warna dan KLT. Sampel yang digunakan adalah kacang merah.
Untuk identifikasi protein dengan menggunakan metode reaksi warna, sampel ditambahkan dengan pereaksi – pereaksi tertentu seperti ninhydrin, biuret, xanthoprotein dan sulfur.
Uji ninhidrin bertujuan untuk mengetahui adanya gugus karboksil dan gugus amino bebas. Gugus karboksil dan gugus amiino bebas akan berikatan dengan ninhidrin dan menimbulkan persenyawaan berwarna ungu. Sampel yang digunakan adalah kacang merah matang, kacang merah mentah, casein, dan gelatin
Pertama sampel berupa kacang merah matang, kacang merah mentah, casein, dan gelatin ditambahkan reagen ninhidrin kemudian dipanaskan selama 10 menit. Tujuan dari pemanasan untuk mempercepat reaksi antara sampel dengan reagen ninhidrin.
Hasil yang diperoleh adalah uji positif pada sampel kacang merah mentah, kacang merah matang, dan casein ditandai dengan larutan sampel berubah menjadi larutan berwarna biru, sedangkan pada gelatin tidak terjadi perubahan. Pada sampel kacang merah mentah, kacang merah matang, dan casein mengandung gugus karboksilat dan gugus amino bebas sedangkan pada gelatin tidak terdapat gugus karboksilat dan amino bebas, sehingga tidak terjadi reaksi dengan ninhidrin
Uji biuret bertujuan untuk mengetahui adanya ikatan peptida pada protein. Dalam larutan basa, biuret akan menunjukkan warna violet dengan penambahan CuSO4. Pada
percobaan akan menggunakan sampel larutan kacang merah matang, kacang merah mentah, casein, dan gelatin. Masing – masing larutan dimasukkan dalam tabung reaksi, masing – masing tabung reaksi mula-mula ditambahkan dengan 1 mL NaOH Kemudian ditambahkan 1 mL reagen CuSO4 maka menghasilkan warna violet. Tujuan dari penambahan reagen ini
adalah untuk mengkondisikan agar suasana menjadi basa.
Perubahan warna menjadi ungu ini, menandakan bahwa dalam larutan tersebut telah terbentuk senyawa kompleks. Senyawa ini terbentuk antara Cu2+ dengan gugus C=O dan N-H
dari rantai peptida. Warna ungu pada larutan protein ini menunjukkan bahwa dalam protein mengandung ikatan peptida.
Dari hasil ini dapat disimpulkan bahwa uji positif diberikan pada semua sampel yaitu larutan kacang merah matang, kacang merah mentah, casein, dan gelatin, berarti semua sampel mengandung ikatan peptida
Uji sulfur bertujuan untuk menunjukkan adanya asam amino yang mengandung sulfur ( S ). Sampel yang digunakan adalah larutan kacang merah matang, kacang merah mentah, casein, dan gelatin
Masing – masing larutan dimasukkan dalam tabung reaksi, masing – masing tabung reaksi mula-mula ditambahkan dengan 1 ml NaOH 10 %. Fungsi dari penambahan NaOH adalah untuk membuat larutan menjadi basa dan untuk menguraikan gugus amina unsur S dalam larutan basa yang akan membentuk Na2S. Kemudian dilakukan pemanasan. Tujuan
dari pemanasan ini adalah untuk mempercepat terjadinya proses reaksi. Setelah itu dilakukan penambahan 2 tetes CH3COOPb, menghasilkan larutan coklat dan endapan coklat. Tujuan
dari penambahan CH3COOPb adalah untuk mengendapkan S yang terkandung dalam protein
menjadi PbS. Uji positif dari tes ini adalah dengan munculnya endapan coklat yang merupakan endapan Pb2S. Dari hasil percobaan semua sampel tidak membentuk endapan
Pb2S, artinya semua sampel tidak mengandung gugus sulfur
Uji xanthoprotein bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya cincin benzen (fenil) dalam suatu protein. Gugus fenil merupakan gugus benzen yang berikatan dengan OH-. Pada
percobaan kali ini menggunakan sampel larutan kacang merah matang, kacang merah mentah, casein, dan gelatin
Masing – masing larutan dimasukkan dalam tabung reaksi, masing – masing tabung reaksi mula-mula ditambahkan dengan 0.5 ml reagen HNO3 dan 0.5 ml NaOH maka akan
terbentuk endapan kuning. Tujuan dari penambahan HNO3 adalah untuk mereaksikan sampel
agar terjadi perubahan warna sedangkan tujuan penambahan NaOH adalah untuk membuat suasana menjadi basa, karena tes xanthoprotein hanya bekerja dalam suasana basa. Endapan ini terjadi karena adanya reaksi nitrasi pada inti benzen yang terdapat pada molekul protein. Endapan ini juga menunjukkan bahwa didalam sampel larutan kacang merah mentah dan kacang merah matang yang telah diuji dimungkinkan mengandung antara asam amino tirosin, fenilalanin, dan triptofan yang mengandung gugus benzen.
Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa uji positif diberikan pada larutan kacang merah matang dan kacang merah mentah ditandai dengan terbentuknya endapan kuning. Sedangkan pada casein, dan gelatin juga positif ditandai dengan larutan berwarna kuning.
Untuk identifikasi protein dengan menggunakan KLT, sampel menggunakan kacang merah mentah dan kacang merah matang. Kami menggunakan sampel kacang merah mentah dan matang karena kami ingin mengetahui kandungan proteinnya, apakah dengan perlakuan berupa perebusan selam ± 30 menit dapat mempengaruhi kandungan protein dalam sampel. Awalnya sampel dihidrolisis dengan asam (HCl) kemudian dimasukkan dalam autoklaf 1 atm. Tujuan dihidrolisis yaitu untuk memisahkan ikatan peptidanya. Kemudian hidrolisat yang didapat ditambahkan dengan natrium bikarbonat sampai pH nya netral. Kemudian masing – masing larutan ditotolkan pada plat KLT. Kemudian dimasukkan dalam chamber yang telah berisi eluen yang telah jenuh. Eluen yang digunakan adalah campuran etanol 96% dan air (70:30). Setelah terjadi eluasi pada batas yang telah ditentukan, plat diangkat kemudian dikeringkan. Setelah itu menyemprotkan pereaksi ninhidrin lalu dipanaskan diatas hotplate.
Dalam hasil percobaan KLT sampel dimungkinkan mengandung asam amino tyrosin dan fenilalanin karena dilihat dari nilai Rf setelah sampel dieluasi antara tyrosin, fenilalanin dan sampel hampir mendekati dan warna noda juga sama yaitu warna coklat. Sedangkan nilai Rf antara sampel dan glisin beda jauh tapi warna noda sama yaitu coklat juga. Rf tyrosin didapat 0,83; Rf fenilalanin didapat 0,8; Rf glisin 0,6; dan Rf sampel didapat 0,8 pada kacang merah matang dan 0,79 pada kacang merah mentah. Hasil dari KLT semua totolan dapat terpisah meskipun nodanya mengekor. Hal tersebut dikarenakan hidrolisis sampel yang dilakukan telah berhasil.
Metode KLT yang digunakan dalam percobaan kali ini masih kurang tepat karena standar yang digunakan hanya 3 standar asam amino yang seharusnya memakai 20 standar asam amino.
KESIMPULAN
1. Sampel kacang merah mentah, kacang merah matang, dan casein positif uji ninhidrin, artinya sampel tersebut mengandung gugus karboksilat dan gugus amino bebas.
2. Sampel larutan kacang merah matang, kacang merah mentah, casein, dan gelatin, positif uji biuret, artinya sampel tersebut menunjukkan adanya ikatan peptida
3. Dalam percobaan uji sulfur semua sampel negatif, artinya semua sampel tersebut tidak mengandung gugus sulfur.
4. Sampel larutan kacang merah matang, kacang merah mentah casein, dan gelatin positif uji xantoprotein, artinya sampel tersebut gugus benzen.
5. Dalam hasil percobaan KLT sampel dimungkinkan mengandung asam amino tyrosin dan fenilalanin. Dilihat dari nilai Rf antara tyrosin, fenilalanin dan sampel hampir mendekati. Rf tyrosin didapat 0,83, Rf fenilalanin didapat 0,8, dan Rf sampel didapat 0,8 pada kacang merah matang dan 0,79 pada kacang merah mentah.
