LAPORAN PRAKTIKUM
KIMIA FISIKA FARMASI INSTRUMENTAL DAN BIOKIMIA (FA 3113)
PERCOBAAN VII ANALISIS KARBOHIDRAT
Tanggal Percobaan : 7 Oktober 2014 Tanggal Pengumpulan : 14 Oktober 2014
Oleh :
Cahyani Kesuma Suryaloka (10712045) Kelompok F
Asisten : Sofia F. (20713015)
LABORATORIUM FARMAKOKIMIA
PROGRAM STUDI SAINS DAN TEKNOLOGI FARMASI SEKOLAH FARMASI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2014
PERCOBAAN VII ANALISIS KARBOHIDRAT
I. Tujuan
1. Menentukan keberadaan karbohidrat dalam sampel dengan uji kualitatif yaitu uji Molisch, uji Seliwanoff, uji Fehling, uji Iodin, dan hidrolisis asam
2. Menentukan kadar glukosa dalam sampel dengan metode reaksi enzimatik
II. Teori Dasar
Karbohidrat merupakan senyawa yang memiliki struktur dasar polihidroksi aldehida dan keton atau senyawa-senyawa yang bisa di hidrolisis menjadi senyawa-senyawa tersebut (Smith, 2010). Rumus molekular dari senyawa karbohidrat ditulis dengan Cn(H2O)n. Karbohidrat
diklasifikasikan menjadi tiga jenis, yaitu : 1. Monosakarida
Monosakarida merupakan karbohidrat paling sederhana yang memiliki tiga sampai tujuh atom karbon dengan gugus karbonil pada bagian ujung rantai atau di sebelah bagian ujung rantai karbon.
2. Disakarida
Disakarida mengandung dua monosakarida yang dihubungkan dengan ikatan glikosida. Senyawa ini mengandung dua gugus alkoksi (gugus –OR) berikatan dengan karbon yang sama. Ikatan glikosida yang menghubungkan kedua monosakarida dapat diorientasikan ke dua arah (α-sheet dan β-sheet).
3. Polisakarida
Polisakarida mengandung tiga atau lebih monosakiarida yang digabungkan. Tiga jenis polisakarida yang ada di alam adalah selulosa, pati, dan glikogen, masing-masing terdiri dari glukosa yang berulang dan dihubungkan dengan ikatan glikosida.
Uji kualitatif karbohidrat bertujuan untuk menentukan keberadaan suatu senyawa dalam larutan sampel, sedangkan uji kuantitatif bertujuan untuk menentukan kadar sampel. Terdapat banyak jenis uji kualitatif
karbohidrat, diantaranya adalah uji Iodin, uji Molisch, uji Fehling, uji Seliwanoff, hidrolisis asam, dan lain-lain. Uji ini memanfaatan reaksi pembentukan kompleks, reduksi, oksidasi, hidrolisis, dan lain-lain untuk menentukan keberadaaan suatu senyawa karbohidrat. Sedangkan salah satu uji kuantitatif karbohidrat dapat dilakukan dengan metode reaksi enzimatik yang memanfaatkan pengubahan glukosa menjadi suatu kromofor sehingga dapat menyerap cahaya dan dapat dibaca nilai absorbansinya pada alat spektrofotometer.
III. Alat dan Bahan Alat : 1. Gelas kimia 2. Pipet 3. Penangas 4. Tabung reaksi 5. Kertas litmus 6. Spektrofotometri visibel 7. Gelas ukur Bahan : 1. KI 2. Iodin 3. Akuades 4. CuSO4.5H2O
5. Sodium potasium tartrat 6. NaOH 7. Reagen Fehling 8. α-naftol 9. Etanol 10. Reagen Molisch 11. H2SO4 12. Reagen Selwanoff 13. Resorcinol 14. HCl 15. Sukrosa 16. Glukosa 17. Reagen GOD-PAP 18. Amilum
IV. Cara Kerja
A. Uji Kualitatif Karbohidrat 1. Uji Iodin
T ab u n g re a k si A d iisi la ru ta n a m ilu m 2 0 te te s d a n ta b u n g re a k si B
d iisi d e n g a n la ru ta n g lu k o sa 2 0 te te s
K e m u d ia n m a sin g -m a sin g ta b u n g d ita m b a h k a n
d e n g a n 3 -4 te te s re a g e n Io d in
Reagen Fehling A yang
mengandung CuSO
Pada tabung reaksi A dicampurkan 1 ml reagen Fehling A dan 1 ml Fehling B serta
ditambahkan dengan 2 ml larutan sukrosa
Pada tabung reaksi B dicampurkan 1 ml reagen Fehling A dan 1 ml Fehling B serta
ditambahkan dengan 2 ml larutan glukosa
Kedua tabung reaksi dipanaskan hingga
titik didihnya 100
T abung reaksi A ditam bahkan 10 tetes larutan sukrosa
dan ditam bahkan 2 tetes reagen M olisch
T abung reaksi B ditam bahkan 10 tetes larutan glukosa
dan ditam bahkan 2 tetes reagen M olisch
K edua tabung reaksi dipanaskan
pada air m endidih hingga 45
Pada kedua tabung reaksi ditambahkan H
2. Uji Fehling
3. Uji Molisch
T a b u n g r e a k s i A d i t a m b a h k a n d e n g a n
2 m l r e a g e n S e l i w a n o f f d a n 2 t e t e s
s u k r o s a
T a b u n g r e a k s i B d i t a m b a h k a n d e n g a n
2 m l r e a g e n S e l i w a n o f f d a n 2 t e t e s
g l u k o s a
K e d u a t a b u n g r e a k s i d i p a n a s k a n
p a d a a i r m e n d i d i h s e l a m a 6 - 8
m e n i t
Tabung reaksi A ditambahkan 1 ml HCl encer
3 M dan 5 ml larutan amilum
Tabung reaksi B ditambahkan 1 ml HCl encer 3
M dan 5 ml larutan sukrosa
Kedua tabung reaksi dipanaskan pada air
mendidih selama 10 menit
Tabung reaksi A ditambahkan dengan 20 tetes NaOH dan tabung
reaksi B ditambahkan dengan 37 tetes NaOH
Dilakukan penambahan reagen Fehling
pada setiap tabung reaksi
D ibuat larutan standar dengan m elarutkan 100 m g glukosa dalam 100
m l reagen G O D -PA P dalam labu volum etrik
D ibuat larutan sam pel dengan m enim bang 500,1 m g sam pel dalam 100
m l reagen G O D -PA P dalam labu volum etrik
D isiapkan larutan blanko
m enggunakan air akuades
5. Hidrolisis Asam
Larutan blanko dimasukkan ke dalam kuvet kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm (500-520nm)
pada alat spektrofotometer
Larutan standar dimasukkan ke dalam kuvet kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm (500-520nm)
pada alat spektrofotometer
Larutan sampel dimasukkan ke dalam kuvet kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm (500-520nm)
pada alat spektrofotometer
V. Perhitungan dan Pengolahan Data A. Uji Kualitatif Karbohidrat
No . Uji Hasil Pengamatan 1. Uji Iodin Reagen Iodin ditambahkan ke dalam larutan glukosa menghasilkan warna
coklat muda agak oranye.
Reagen Iodin ditambahkan ke dalam
larutan amilum menghasilkan warna
2. Uji Fehling
Reagen Fehling ditambahkan ke dalam
larutan glukosa tidak membentuk endapan setelah dipanaskan pada
suhu 100oC
Reagen Fehling ditambahkan ke dalam
larutan sukrosa tidak membentuk endapan setelah dipanaskan pada suhu 100oC 3. Uji Molisch Reagen Molisch ditambahkan ke dalam
larutan glukosa dan dipanaskan kemudian
ditambahkan H2SO4
terbentuk cincin warna ungu kecoklatan.
Reagen Molisch ditambahkan ke dalam
larutan sukrosa dan dipanaskan kemudian
ditambahkan H2SO4
terbentuk cincin warna ungu kecoklatan.
4. Uji
Seliwano ff
Reagen Seliwanoff ditambahkan ke dalam
larutan sukrosa dan dipanaskan muncul
warna merah
Reagen Seliwanoff ditambahkan ke dalam
larutan glukosa dan dipanaskan muncul warna bening 5. Hidrolisis Asam Larutan amilum ditambahkan asam HCl encer kemudian di panaskan dan ditambahkan NaOH. Ditambahkan pereaksi Fehling dan tidak muncul
endapan merah selama reaksi Larutan sukrosa ditambahkan asam HCl encer kemudian di panaskan dan ditambahkan NaOH. Ditambahkan pereaksi
Fehling dan tidak muncul endapan merah
selama reaksi B. Uji Kuantitatif
Menggunakan metode reaksi enzimatik, pelarut yang digunakan adalah reagen GOD-PAP
Penimbangan glukosa larutan sampel = 0,5 gram Larutan glukosa sampel = 500,01 mg/dL
Larutan glukosa standar = 100 gram/dL
Dilakukan pengukuran menggunakan alat spektrofotometer : Absorbansi larutan blanko = tidak diperoleh karena larutan berubah warna pink yang menandakan adanya pengotor
Absorbansi larutan sampel = 0,647 Absorbansi larutan standar = 0,146 Perhitungan :
Kadar glukosa dalam sampel bisa dihitung melalui perbandingan one-point method
A sampel A standar = kadar sampel kadar standar 0,647 0,146 = kadar sampel 100 mg/dL Kadar sampel = 443,1507 mg/dL
Kadar glukosa sampel dari hasil percobaan adalah 443,1507 mg/dL. Galat =
|
443,1507−500,01500,01|
×100 =11,4VI. Diskusi
Karbohidrat terdapat pada semua tumbuhan dan hewan dan penting bagi kehidupan. Molekul senyawa ini memiliki rumus umum Cn(H2O)n. Karbohidrat dari segi struktur organik dapat didefinisikan sebagai polihidroksialdehida, polihidroksiketon, atau zat yang memberikan senyawa tersebut jika dihidrolisis. Berdasarkan strukturnya karbohidrat digolongkan menjadi monosakarida, oligosakarida, atau polisakarida. Ketiga golongan karbohidrat ini berkaitan satu dengan lainnya lewat hidrolisis. Monosakarida (kadang disebut gula sederhana) ialah karbohidrat yang tidak dapat dihidrolisis menjadi senyawa yang lebih sederhana lagi. Polisakarida mengandung banyak unit monosakarida, ratusan bahkan ribuan. Disakarida mengandung dua unit monosakarida yang bertautan (Harold, Hard et al., 2003). Karbohidrat dibagi menjadi beberapa jenis yaitu monosakarida, disakarida, dan polisakarida.
Monosakarida juga diklasifikasikan berdasarkan jumlah atom karbon. Suatu monosakarida enam karbon dikenal sebagai heksosa, suatu monosakarida lima karbon dikenal sebagai pentosa dan sebagainya. Suatu monosakarida yang mengandung enam atom karbon dan kelompok fungsional aldehida dikenal sebagai suatu aldohexose. Glukosa adalah suatu aldoheksosa, fruktosa adalah suatu ketoheksosa.
Sebagian besar monosakarida dikenal sebagai heksosa, karena terdiri atas 6-rantai atau cincin karbon. Atom-atom hidrogen dan oksigen terikat pada rantai atau cincin ini secara terpisah atau sebagai gugus hidroksil (-OH). Tiga jenis heksosa penting adalah glukosa, galaktosa, dan fruktosa. Ketiga macam monosakarida ini mengandung jenis dan jumlah atom yang sama, yaitu 6 atom karbon, 12 atom hidrogen, dan 6 atom oksigen. Perbedaannya hanya terletak pada cara penyusunan atom-atom hidrogen dan oksigen di sekitar atom-atom karbon. Perbedaan dalam susunan atom inilah yang menyebabkan perbedaan dalam tingkat kemanisan, daya larut, dan sifat lain ketiga monosakarida tersebut. Monosakarida yang terdapat di alam pada umumnya terdapat dalam bentuk isomer dekstro (D). Gugus hidroksil ada karbon nomor 2 terletak di sebelah kanan. Struktur kimianya dapat berupa struktur terbuka atau struktur cincin. Jenis heksosa lain yang kurang penting dalam ilmu gizi adalah manosa. Monosakarida yang mempunyai lima atom karbon disebut pentosa, seperti ribosa dan arabinosa.
Sumber :
http://rcastly.files.wordpress.com/2014/03/monosakarida.png 2. Disakarida
Senyawanya terbentuk dari 2 molekul monosakarida yg sejenis atau tidak. Disakarida dapat dihidrolisis oleh larutan asam dalam air sehingga terurai menjadi 2 molekul monosakarida. Contoh dari senyawa disakarida antara lain sukrosa, maltosa, trehalosa, dan laktosa. Sukrosa mengandung monosakarida glukosa dan fruktosa, maltosa mengandung monosakarida glukosa dan glukosa, dan laktosa mengandung monosakarida glukosa dan galaktosa.
Gambar 2. Karbohidrat Disakarida
Sumber :
http://4.bp.blogspot.com/-77itRYh7uZw/U-G1kGWuUEI/AAAAAAAABDY/XM1h_EOCfZQ/s1600/disakarida.gif 3. Polisakarida
Polisakarida mengandung banyak unit monosakarida terkait bersama-sama. Senyawa ini terdiri dari gabungan molekul- molekul monosakarida yang banyak jumlahnya, senyawa ini bisa dihidrolisis menjadi banyak molekul monosakarida. Polisakarida merupakan jenis karbohidrat yang terdiri dari lebih 6 monosakarida dengan rantai lurus/cabang.
Pati ditemukan dalam biji-bijian, glikogen ditemukan dalam otot dan selulosa ditemukan dalam tanaman, kapas dan kertas. Semua terbuat dari molekul glukosa terhubung dalam susunan yang berbeda.
Gambar 3. Karbohidrat Polisakarida Sumber :
http://2.bp.blogspot.com/-P6acRDPmoiY/UIzhipe9rtI/AAAAAAAAA-c/Cn6ynAyxydg/s1600/fig-6.png Fungsi utama karbohidrat adalah sebagai sumber biokalori dalam bahan makanan, disamping itu juga sebagai bahan pengental atau GMC pada teknologi makanan sebagai bahan penstabil, bahan pemanis (sukrosa, glukosa, fruktosa) dan bahan bakar, misalnya pada glukosa dan pati dan sebagai penyusun struktur sel, misalnya selulosa dan khitin. (Sudarmadji, 1996)
Dalam percobaan di atas, dilakukan uji kualitatif dan uji kuantitatif pada larutan amilum, sukrosa, dan glukosa. Uji kualitatif yang dilakukan meliputi uji Iodin, uji Fehling, uji Seliwanoff, uji Molisch, dan hidrolisis asam. Uji kualitatif ini bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan suatu senyawa. Sedangkan uji kuantitatif yang dilakukan menggunakan metode reaksi enzimatik glukosa bertujuan untuk menentukan kadar sampel glukosa. Berikut ini adalah beberapa pembahasan pada uji yang dilakukan selama percobaan.
A. Uji Kualitatif 1. Uji Iodin
Uji Iodin digunakan untuk mendeteksi kerberadaan amilum pada suatu larutan. Warna biru kehitaman yang muncul di sebabkan karena terjadinya molekul amilum-Iodin kompleks. Amilum mengantung polimer α-amilosa dan amilopektin yang
membentuk kompleks dengan Iodin untuk memberikan warna biru kehitaman (Zulfikar, A. 2010). Berikut ini adalah gambar suatu kompleks antara amilum dengan iodin :
Gambar 4. Kompleks Amilum dengan Iodin Sumber : http://chemwiki.ucdavis.edu/
Pada percobaan di atas dilakukan pengujian dua larutan sampel yaitu larutan yang berisi amilum dan larutan yang berisi glukosa. Reagen Iodin dibuat dengan melarutkan 2 gram KI dalam 50 ml air, kemudian ditambahkan dengan 1 gram Iodin, setelah itu diencerkan dengan air hingga 100 ml dan dikocok hingga larut. Namun pada percobaan tidak dilakukan pembuatan reagen karena reagen sudah tersedia dalam laboratorium. Pada tabung reaksi A dimasukkan 20 tetes larutan amilum kemudian ditetesi dengan reagen Iodin. Diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat. Warna yang muncul adalah warna biru tua. Pada tabung reaksi B dimasukkan 20 tetes larutan glukosa kemudian ditetesi dengan reagen Iodin. Diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat. Warna yang muncul adalah warna coklat muda agak oranye. Hal itu membuktikan bahwa uji Iodin pada larutan amilum mendeteksi adanya senyawa amilum pada larutan karena reaksi pembentukan kompleks antara iodin dengan amilum dan tidak mendeteksi senyawa amilum pada larutan glukosa karena tidak terdapat kompleks yang terbentuk.
Uji Fehling adalah uji untuk membuktikan adanya gula pereduksi. Gula pereduksi adalah gula yang mempunyai kemampuan untuk mereduksi senyawa-senyawa penerima elektron. Hal ini disebabkan karena adanya gugus aldehida (aldosa) atau gugus keton (ketosa) bebas. Aldosa mudah teroksidasi menjadi asam aldonat, sedangkan ketosa hanya dapat bereaksi dalam suasana basa. Ciri utama dari gula pereduksi adalah umumnya memiliki struktur hemiasetal dan memiliki gugus aldehid dalam strukturnya. Contoh dari gula pereduksi adalah semua glukosa, fruktosa, galaktosa, laktosa, maltosa, dan lain-lain. Sedangkan yang bukan gula pereduksi adalah sukrosa dan pati. Dengan prinsip berdasarkan reduksi Cu2+ menjadi Cu+
yang mengendap sebagai Cu2O berwarna merah bata (Zulfikar, A.
2010). Reaksi yang terjadi adalah :
Gambar 5. Proses Reaksi Uji Fehling
Sumber : http://www.cfs.purdue.edu/FN/fn453/ld_carbo.html Percobaan di atas dilakukan dengan pengujian dua sampel yaitu menggunakan sampel larutan glukosa dan larutan sukrosa. Terdapat dua reagen Fehling, reagen Fehling A dibuat dengan melarutkan 34,64 gram CuSO4.5H2O dalam 500 ml air. Reagen
Fehling B dibuat dengan melarutkan 173 gram sodium potassium tartrat dan 65 gram NaOH dalam 500 ml air. Namun pada percobaan tidak dilakukan pembuatan reagen karena reagen sudah tersedia dalam laboratorium. Pada kedua tabung reaksi dimasukkan 1 ml reagen Fehling A dan 1 ml reagen Fehling B.
Kemudian pada tabung reaksi A dimasukkan 2 ml larutan glukosa dan pada tabung reaksi B dimasukkan 2 ml larutan sukrosa. Kedua tabung tersebut dipanaskan hingga titik didih (100oC) dan
ditunggu hingga membentuk suatu deposit atau endapan merah Cu2O. Hasil yang diperoleh adalah tidak terbentuk endapan merah
pada reaksi larutan sampel glukosa dan larutan sampel sukrosa. Glukosa merupakan suatu gula pereduksi yang mengandung gugus aldosa sehingga dapat mereduksi senyawa Cu2+. Pada
percobaan. Dalam larutan uji glukosa tidak terbentuk suatu endapan merah dapat disebabkan karena suhu pemanasan yang tidak tepat sehingga tidak terjadi reaksi secara sempurna, kemudian pembuatan reagen yang kurang tepat ketika proses penimbangannya juga dapat mengakibatkan reaksi tidak dapat terjadi.
Sukrosa dan pati tidak menunjukkan warna merah bata alias tidak bereaksi dikarenakan sukrosa dan pati bukanlah gula pereduksi dan sukrosa sendiri tidak mempunyai gugus OH bebas yang reaktif, karena keduanya sudah saling terikat (Winarno, 1984)
Pada larutan sukrosa tidak dapat terbentuk endapan berwarna merah bata. Hal ini dapat disebabkan karena gugus aldosa pada struktur sukrosa tidak dalam keadaan bebas, tetapi terkunci pada ikatan glikosida dengan struktur fruktosanya.
3. Uji Molisch
Uji Molisch merupakan uji spesifik untuk karbohidrat (monosakarida, disakarida, polisakarida), asam nukleat dan glikoprotein. Uji ini efektif untuk berbagai senyawa yang dapat di dehidrasi menjadi furfural atau substitusi furfural oleh asam sulfat pekat. Senyawa furfural akan membentuk kompleks dengan α-naftol yang dikandung pereaksi Molisch dengan memberikan warna ungu pada larutan.
Gambar 6. Proses Reaksi Uji Molisch
Sumber : http://en.wikipedia.org/wiki/Molisch's_test
Percobaan di atas dilakukan dengan pengujian dua sampel yaitu menggunakan sampel larutan glukosa dan larutan sukrosa. Reagen Molisch dibuat dengan melarutkan 50 mg α-naftol dalam 50 ml etanol. Namun pada percobaan tidak dilakukan pembuatan reagen karena reagen sudah tersedia dalam laboratorium. Pada tabung reaksi A ditambahkan larutan glukosa 10 tetes kemudian ditambahkan 2 tetes reagen Molisch. Pada tabung reaksi B ditambahkan larutan sukrosa 10 tetes kemudian ditambahkan 2 tetes reagen Molisch. Kedua tabung reaksi dipanaskan hingga 45oC, setelah itu diteteskan 20 tetes H
2SO4 di sisi tabung reaksi
pada lemari asam. Pada tabung reaksi A terbentuk cincin berwarna ungu dan pada tabung reaksi B terbentuk cincin berwarna ungu. Hal tersebut membuktikan bahwa larutan glukosa dan sukrosa dapat didehidrasi oleh H2SO4 pekat. Hal ini
disebabkan oleh reaksi hidrolisis oleh asam sulfat pekat yang memecah ikatan glikosida pada karbohidrat, kemudian kabohidrat tersebut membentuk senyawa monosakarida yang nantinya akan terdehidrasi membentuk senyawa furfural dan turunannya (pentosa akan berubah menjadi furfural, sedangkan heksosa akan menjadi 5-hidroksimetilfurfural). Senyawa-senyawa furfural inilah yang kemudian akan bereaksi dengan α-naftol membentuk suatu kompleks yang menyebabkan warna ungu pada larutan uji.
Cincin kemerahan itu terbentuk dari reaksi dehidrasi karbohidrat oleh asam sulfat (asam organik pekat). H2SO4 pekat berfungsi untuk menghidrolisis ikatan pada sakarida untuk menghasilkan furfural. Furfural ini kemudian bereaksidengan reagent Molisch, α-naphthol membentuk cincin yang berwarna ungu kemerah-merahan (Rahayu Anny et al., 2005). Maka dapat disimpulkan bahwa dari kedua larutan uji mengandung senyawa karbohidrat.
4. Uji Seliwanoff
Uji ini memiliki prinsip berdasarkan konversi fruktosa menjadi asam levulinat dan hidroksimetil furfural oleh asam hidroklorida panas dan terjadi kondensasi hidroksimetilfurfural dengan resorsinol yang menghasilkan senyawa berwarna merah, reaksi ini spesifik untuk ketosa. Sukrosa yang mudah dihidrolisis menjadi glukosa dan fruktosa akan memberikan reaksi positif dengan uji seliwanoff yang akan memberikan warna jingga pada larutan.
Dehidrasi fruktosa oleh HCl pekat menghasilkan hidroksi metil furfural dengan penambahan resorsinol akan megalami kondensasi membentuk senyawa kompleks berwarna merah jingga menjadi dasar dari uji Seliwanoff (Sumardjo, 2006).
Gambar 7. Proses Reaksi Uji Molisch Sumber :
Percobaan di atas dilakukan dengan pengujian dua sampel yaitu menggunakan sampel larutan glukosa dan larutan sukrosa. Reagen Seliwanoff dibuat dengan melarutkan 0,5 gram resorcinol dalam 1000 ml HCl 3 M. Namun pada percobaan tidak dilakukan pembuatan reagen karena reagen sudah tersedia dalam laboratorium. Pada tabung reaksi A dimasukkan 2 ml reagen Seliwanoff kemudian ditambahkan dengan 2 ml larutan glukosa. Pada tabung reaksi B dimasukkan 2 ml reagen Seliwanoff kemudian ditambahkan 2 ml larutan sukrosa. Kedua tabung reaksi didihkan selama 6-8 menit. Warna yang muncul pada tabung reaksi A yang berisi larutan glukosa adalah warna bening dan pada tabung reaksi B yang berisi larutan sukrosa adalah warna merah. Hal ini membuktikan bahwa glukosa tidak mengandung struktur ketosa karena tidak terbentuk warna merah.
Sedangkan sukrosa menghasilkan warna merah karena bentuk disakarida sukrosa dapat terhidrolisis menjadi glukosa dan fruktosa. Fruktosa memiliki struktur ketosa yang dapat bereaksi dengan reagen Seliwanoff sehingga dapat memunculkan warna merah ketika percobaan dilakukan.
5. Hidrolisis Asam
Metode kimiawi dilakukan dengan cara hidrolisis pati menggunakan asam-asam organik, yang sering digunakan adalah H2SO4, HCl, dan HNO3. Pemotongan rantai pati oleh
asam lebih tidak teratur dibandingkan dengan hasil pemotongan rantai pati oleh enzim. Hasil pemotongan oleh asam adalah campuran dekstrin, maltosa dan glukosa, sementara enzim bekerja secara spesifik sehingga hasil hidrolisis dapat dikendalikan (Assegaf, 2009).
Percobaan di atas dilakukan dengan pengujian dua sampel yaitu menggunakan sampel larutan glukosa dan larutan amilum.
Pada tabung reaksi A dimasukkan 1 ml HCl encer 3 M dan ditambahkan dengan 5 ml larutan sukrosa. Pada tabung reaksi B dimasukkan 1 ml HCl encer 3 M dan ditambahkan dengan 5 ml larutan amilum. Kedua tabung reaksi dipanaskan pada air mendidih selama 10 menit, kemudian kedua larutan asam dinetralisasi dengan larutan NaOH encer 3 M dan diuji dengan kertas litmus untuk memastikan bahwa larutan sudah bersifat netral atau cenderung basa. Pada tabung reaksi A ditambahkan 20 tetes NaOH dan pada tabung reaksi B ditambahkan 37 tetes NaOH. Penambahan senyawa basa pada reaksi ini bertujuan untuk memperoleh suasana netral cenderung basa dimana pereaksi Fehling dapat bekerja secara maksimal. Setelah itu dari kedua tabung reaksi, diambil 2 ml untuk dilakukan uji Fehling. Pada tabung reaksi yang berisi larutan amilum dan larutan sukrosa tidak terbentuk endapan merah. Seharusnya terdapat endapan merah yang terbentuk karena setelah proses hidrolisis amilum akan menghasilkan suatu senyawa aldosa yang bereaksi dengan reagen Fehling. Proses hidrolisis yang terjadi pada sukrosa atau disakarida lebih mudah dibandingkan dengan amilum karena strukturnya yang sederhana dan hanya memiliki satu ikatan glikosida dan ikatan hidrogen, sedangkan amilum merupakan senyawa polisakarida sehingga memiliki struktur yang lebih kompleks dibandingkan dengan monosakarida seharusnya dapat dihidrolisis menjadi suatu monosakarida-monosakarida namun membutuhkan waktu yang lama karena polisakarida amilum mengandung kurang lebih ratusan ikatan glikosida.
Pada uji Fehling larutan sukrosa dan amilum tidak menunjukkan adanya endapan merah dapat disebabkan karena suhu pemanasan yang kurang tepat sehingga rekasi tidak dapat berjalan dengan baik dan tidak dapat menghasilkan suatu endapan warna merah.
B. Uji Kuantitatif
Dalam percobaan di atas dilakukan pengukuran kuantitatif karbohidrat menggunakan metode reaksi enzimatik. Prinsip dari percobaan ini adalah mengukur absorbansi larutan standar yang sudah diketahui kadarnya kemudian dibandingkan dengan larutan sampel maka akan diperoleh kadar dari larutan sampel. Untuk mengukur absorbansi dari larutan glukosa standar maupun larutan glukosa dibutuhkan kromofor untuk menyerap cahaya sehingga dapat diukur menggunakan alat spektrofotometer. Maka glukosa tersebut akan diubah menjadi suatu kromofor yang dapat menyerap cahaya.
Reaksi perubahan glukosa tersebut adalah dengan mengoksidasi D-glukosa pada larutan sampel dan larutan standar oleh enzim
glucose oxidase sehingga menjadi D-glukonat dan H2O2.
Gambar 8. Proses Reaksi Oksidasi Glukosa Sumber : http://www.worthington-biochem.com/gop/
Hidrogen peroksida yang terbentuk akan bereaksi dengan 4-aminoantipirin dan p-hidroksibenzoat membentuk quinoneimin, reaksi ini dikatalis oleh peroksidase.
Gambar 9. Proses Pembentukan Quinoneimin
Quinoneimin dalam larutan akan memberikan warna pink hingga merah. Secara organoleptik, warna larutan sampel memberikan warna yang lebih pekat dari larutan standar sementara blanko tidak mengalami perubahan warna. Quinoneimin ini merupakan suatu kromofor atau suatu molekul yang dapat menyerap cahaya sehingga tingkat absorbansinya dapat dilihat pada alat spektrofotometer.
Pada percobaan di atas dilakukan uji kuantitatif karbohidrat larutan sampel. Pertama glukosa standar dilarutkan di dalam 100 ml reagen untuk mengoksidasi glukosa menjadi kromofor, kemudian glukosa sampel ditimbang dan dilarutkan dalam 100 ml reagen untuk mengoksidasi glukosa menjadi kromofor, serta disiapkan larutan blanko yang berisi air akuades biasa. Sampel yang dibuat pada percobaan memiliki kadar 0,5001%. Ketiga tabung reaksi diinkubasi selama beberapa waktu pada suhu 37oC. Proses inkubasi dilakukan
karena reaksi enzimatis membutuhkan waktu hingga terbentuk suatu produk yang lebih sempurna serta pada suhu 37oC proses reaksi
enzimatik berlangsung secara maksimal.
Kemudian satu per satu diukur absorbansinya pada alat spektrofotometer dengan dimasukkan ke dalam kuvet. Absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 500nm. Namun karena blanko yang digunakan muncul warna pink yang menandakan adanya pengotor di dinding tabung reaksi sehingga larutan blanko tidak digunakan.
Hasil yang diperoleh dari percobaan adalah untuk larutan standar absorbansi yang diperoleh adalah 0,146 sedangkan absorbansi larutan sampel adalah 0,647. Sehingga diperoleh nilai kadar sampel yang sudah diukur dengan spektrofotometer adalah 443,15 mg/dL, galat yang diperoleh adalah 11,4 %. Galat yang diperoleh dapat disebabkan karena penimbangan sampel yang kurang teliti atau alat penimbang yang kurang peka, dapat juga disebabkan ketika pengukuran absorbansi, alat spektrofotometri yang digunakan kurang akurat dan terdapat pengotor sehingga nilai yang diperoleh kurang tepat.
VII. Kesimpulan
1. Berdasarkan percobaan, pada uji Iodin, larutan uji amilum mengandung senyawa amilum dan larutan uji glukosa tidak mengandung senyawa amilum. Pada uji Fehling, larutan uji glukosa dan sukrosa tidak mengandung senyawa glukosa. Pada uji Molisch, larutan sukrosa dan glukosa mengandung senyawa karbohidrat. Pada uji Seliwanoff, larutan uji sukrosa mengandung senyawa ketosa dan larutan uji glukosa tidak mengandung senyawa ketosa. Sedangkan pada hidrolisis asam, larutan uji amilum dan sukrosa tidak mengandung glukosa hasil hidrolisis. 2. Penentuan kadar glukosa dalam sampel menggunakan metode
reaksi enzimatik adalah 443,1507 mg/dL dan galat yang diperoleh adalah 11,4 %.
VIII. Daftar Pustaka
Assegaf F. 2009. Prospek Produksi Bioetanol Bonggol Pisang (Musa
paradisiaca L.) Menggunakan Metode Hidrolisis Asam dan
Enzimatis. Ilmu Pengetahuan Teknologi dan Seni. Purwokerto. Fessenden. 1986. Kimia Organik Jilid 2. Jakarta: Erlangga.
Harold, Hard et al. 2003. Organic Chemistry: A Short Course. Belmon: Brooks/Cole.
Rahayu Anny et al. 2005. Analisis Karbohidrat, Protein, dan Lemak pada Pembuatan Kecap Lamtoro Gung (Leucaena leucocephala) terfermentasi Asepergillus oryzae. Bioteknologi. 2 (1): 14-20 Sudarmadji, Slamet et al. 1996. Prosedur Analisis Bahan Makanan
dan Pertanian. Yogyakarta: Penerbit Liberty.
Sumardjo, Damin. 2006. Pengantar Kimia: Buku Panduan Kuliah
Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata 1 Fakultas Bioeksakta. Jakarta: EGC.
Winarno, F.G. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta. Gramedia Pustaka Utama.
Zulfikar. 2008. Kimia Kesehatan. Jakarta : Direktorat Pembinaan Sekolah Menengah Kejuruan.
