TESIS
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERIHASIL
HIDROLISISENZIMATIS MINYAK KELAPA MURNI
TERHADAPSALMONELLA TYPHI DAN SALMONELLA
TYPHIMURIUM SECARA IN-VITRO DAN IN-VIVO
OLEH:
ELYSA
NIM 117014005
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
2015
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERIHASIL
HIDROLISISENZIMATIS MINYAK KELAPA MURNI
TERHADAPSALMONELLA TYPHI DAN SALMONELLA
TYPHIMURIUM SECARA IN-VITRO DAN IN-VIVO
TESIS
Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Magister dalam Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
ELYSA
NIM 117014005
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU FARMASI
FAKULTAS FARMASI
PERSETUJUAN TESIS
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERIHASIL HIDROLISIS
ENZIMATIS MINYAK KELAPA MURNI
TERHADAPSALMONELLA TYPHI DAN SALMONELLA
TYPHIMURIUM SECARA IN-VITRO DAN IN-VIVO
Oleh:
ELYSA
NIM 117014005
Medan,April2014 Menyetujui:
Komisi Pembimbing, Komisi Penguji,
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt. NIP 195301011983031004 NIP
Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt. Dr. It Jamilah, M.Sc. NIP 195006071979031001 NIP
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. NIP 195301011983031004
Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt.
NIP 195006071979031001
Mengetahui: Disahkan Oleh:
Ketua Program Studi, Dekan,
Prof. Dr. Karsono, Apt. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195409091982011001 NIP 195311281983031002
PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa : Elysa Nomor Induk Mahasiswa : 117014005
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Hidrolisis Enzimatis Minyak Kelapa Murni Terhadap
Salmonella typhi dan Salmonella typhimurium
Secara In-vitro dan In-vivo
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari Rabu tanggal dua belas Februari tahun dua ribu empat belas.
Mengesahkan:
Komisi Penguji Tesis
Ketua Komisi Penguji Tesis : Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
Sekretaris Komisi Penguji Tesis : Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt. Anggota Komisi Penguji Tesis : Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt.
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama Mahasiswa : Elysa No. Induk Mahasiswa : 117014005 Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Hidrolisis Enzimatis Minyak Kelapa Murni Terhadap Salmonella typhi dan Salmonella typhimurium Secara In-vitro dan In-vivo
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah hasil karya saya sendiri, bukan plagiat, dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya ini plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia menerima sanksi yang diberikan oleh Program Studi Magister Farmasi Universitas Sumatera Utara. Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dalam keadaan sehat.
Medan, Februari 2014 Yang membuat pernyataan,
Elysa
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Kuasa yang telah melimpahkan rahmat dan anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan tesisyang berjudul “Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Hidrolisis Enzimatis Minyak Kelapa Murni Terhadap Salmonella typhi dan Salmonella typhimurium Secara In-vitro dan In-vivo”.Tesis ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Pada kesempatan ini dengan kerendahan hati dan hormat, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi yang telah memberikan bantuan dan fasilitas selama masa pendidikan.Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.,dan Bapak Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt.,selaku pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan, dan nasehat kepada penulis dengan penuh kesabaran, tulus dan ikhlas selama penelitian hingga selesainya penulisan tesis ini.Bapak Prof. Dr. Karsono, Apt., dan Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku Ketua dan Sekretaris Program StudiMagister Farmasi yang telah memberikan bimbingan kepada penulis selama masa perkuliahan.Ibu Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt., dan Ibu Dr. It Jamilah selaku dosen pembanding yang telah memberikan saran dan kritikan kepada penulis hingga selesainya penulisan tesis ini.Ibu Dra. Suwarti Aris, M.Si., Apt., selaku Kepala Laboratorium Farmakognosi, Ibu Dra. Erly Sitompul, M.Si., Apt., selaku Kepala Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Ibu
Marianne, S.Si., M.Si., Apt., selaku Kepala Laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak I. Gde Nyoman Swandi Ketua Balai Pengawas Obat dan Makanan Medan, dan Bapak Dr. H.T. Ibnu Alferaly Sp. PA Ketua Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan fasilitas dan bantuan selama penelitian.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tulus tiada terhingga kepada Ayahku Ang Kim Seng dan Ibuku Erlin Kemi, serta Adikku dr.Belliana dan Suhendro Anggara atas doa, dorongan, dan semangat baik moril maupun materil kepada penulis selama masa perkuliahan hingga selesainya penyusunan tesis ini.Sahabat dan teman seperjuangan mahasiswaFakultas Farmasi khususnya kak Floriana dan PT. Halim Sakti Pratama yang telah membantu dalam penulisan tesis ini.Serta kepada semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah memberi doa, dukungan, dan motivasi. Kiranya Tuhan Yang Maha Esa memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah diberikan kepada penulis.
Akhir kata, penulis mengharapkan kritikan dan saran yang membangun demi penyempurnaan tesis ini. Harapan saya semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan kefarmasian.
Medan, Februari 2014 Penulis,
Elysa
ARTIKEL YANG DIPUBLIKASI DARI TESIS INI
Elysa, Silalahi, J., and Harahap, U. (2014). Antibacterial activity of
Enzymatic
Hydrolysis
of
Virgin
Coconut
Oil
AgainSalmonella. International Journal of PharmTech
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI HASIL HIDROLISIS ENZIMATIS MINYAK KELAPA MURNI TERHADAP SALMONELLA TYPHI DAN
SALMONELLA TYPHIMURIUM SECARA IN-VITRO DAN IN-VIVO
Abstrak
Salmonellosis merupakan salah satu penyakit zoonosis yang disebabkan oleh bakteri patogen Salmonella melalui kontaminasi silang makanan (foodborne disease). Pengobatan Salmonellosis menggunakan antibiotik selain mengoreksi dehidrasi dan gangguan elektrolit.Minyak kelapa murni (Virgin Coconut Oil, VCO) mempunyai potensi medis seperti sifat antibakteri, antivirus, dan antijamur dari kandungan asam lemak rantai sedang (Medium Chain Fatty Acid, MCFA), khususnya asam laurat (C12:0) atau dalam bentuk monogliserida (monolaurin atau ML) yang terdapat didalamnya. Tujuan penelitian ini adalah untukmenguji aktivitas antibakteri hasil hidrolisis enzimatis VCO (VCOH) yang menghasilkan
kombinasiasam laurat dan monolaurin terhadap Salmonella secara vitro dan in-vivo yang diharapkan memberikan efek sinergis.
Sampel VCO yang digunakan adalahPalem Mustika VCO-Virgin Coconut Oilyang diproduksi oleh Siti Nurbaya, Sumatera Barat. VCO dihidrolisis dengan enzim lipase (LIPOZYME® TL IM) selama 18 jam dengan interval waktu pengamatan nilai bilangan asam setiap 2 jam. VCOH yang mempunyai nilai
bilangan asam yang optimal, selanjutnya diuji aktivitas antibakterinya terhadap Salmonella secara in-vitrodilakukan dengan metode difusi agar menggunakan pencadang kertas (6 mm, Oxoid) dengan mengamati zona hambat. Zona hambat yang paling baik, selanjutnya digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri VCOH terhadap Salmonella secara in-vivo pada mencit galur mus musculus yang
diinfeksikan dengan S. typhimurium, diamati tanda-tanda klinis dan dihitung jumlah koloni dalam feses mencit serta perubahan histopatologi jaringan hati dan limpa.Aktivitas antibakteri bahan uji dibandingkan dengan kontrol positif, negatif dan pembanding kloramfenikol. Hasil pengujian dianalisis statistik dengan analisis variansi (ANAVA; α0,05) dan dilanjutkan dengan uji Post HocDuncan untuk melihat perbedaan nilai rata-rata signifikan antar kelompok perlakuan.
Nilai bilangan asam yang konstan diperoleh pada masa inkubasi setelah 14 jam. Hasil hidrolisis enzimatis VCO menunjukkan bahwa waktu hidrolisis optimal adalah 14 jam. Hasil pengujian aktivitas antibakteri VCOH terhadap S. typhi
(ATCC 00786) dan S. typhimurium (ATCC 14028) secara in-vitro menunjukkan adanya daya hambat dengan peningkatan konsentrasi. Konsentrasi 1000 μl/ml menunjukkan daya hambat paling baik 13,900±0,3033 mm terhadap S. typhi dan 14,333±0,6623 mm terhadap S. typhimurium. Secara in-vivo, mencit sebelumnya diinfeksi S.typhimurium kemudiandiberi bahan uji.Mencit yang dipajankan dengan bahan uji menunjukkan penurunan jumlah koloni bakteri dalam feses mencit. Tanda klinis dan kerusakan histologis jarang dijumpai pada mencit yang diberi bahan uji, sedangkankelompok yang tidak diobati dan kelompok pembanding menunjukkan adanya tanda-tanda klinis diare, berat badan menurun dan kerusakan histopatologis pada hati dan limpa. Dapat disimpulkan bahwa hasil hidrolisis enzimatis VCO memiliki potensi sebagai anti-Salmonella.
IN-VITRO AND IN-VIVO ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ENZYMATIC HYDROLYSIS OF VIRGIN COCONUT OILAGAINST
SALMONELLA TYPHI AND SALMONELLA TYPHIMURIUM
Abstract
Salmonellosis is a zoonotic disease caused by pathogenic bacteria Salmonellawhich the route of infection is usually through cross-contamination of food (foodborne disease). Treatment of Salmonellosis commonly used antibiotics in addition to correcting dehydration and electrolyte disturbances. Virgin Coconut Oil (VCO) has the medical potential such as antibacterial, antiviral, and antifungal activity of its medium chain fatty acids (MCFAs), particularly lauric acid (C12: 0) in its monoglycerides form (monolaurin or ML). The aim of this study was to examine the in-vitro and in-vivo antibacterial activity of the enzymatic hydrolysis of VCO (VCOH)which generates a combination of lauric acid and monolaurin
against Salmonellawhich are expected to provide a synergistic effect.
The sample of VCOthatin this study wasPalem Mustika VCO-Virgin Coconut Oil, produced by Siti Nurbaya, West Sumatra. VCO was hydrolyzed by enzyme lipase (Lipozyme® TL IM) for 18 hours with interval observation time of free fatty acids value every 2 hours.VCOH which has the optimum free fatty acid
value, then investigated the in-vitro antibacterial activity of VCOH against
Salmonellaby diffusion agar method using the paper discs (6 mm, Oxoid)by observing the zone of inhibition.The best inhibitory zone, then used for investigated in-vivo antibacterial activity of VCOHagainst Salmonella was
examined in a S. typhimurium infection mice mus musculus model, clinical signs were observed and counted the number of colonies S. typhimurium from feces and histopathological changes in liver and spleen tissue.Antibacterial activity of VCOHwas compared with the positive control, negative control and comparison of
chloramphenicol. Data were analyzed statistically with analysis of variance (ANOVA; α 0,05), followed by Duncan's Post Hoc test to see the difference in the average value significantly between treatment groups.
The fatty acids value was obtained constant after incubation for 14 hours. The result of enzymatic hydrolysis VCO show that the optimum hydrolysis time was 14 hours. The in-vitroantibacterial activity of VCOHagainst S.typhi (ATCC
00786) andS.typhimurium (ATCC 14028) was found to have inhibition with increased concentration. The concentration of1000μl/ml showed the best inhibition of the 13.900 ± 0.3033 mm to S.typhi and 14.333 ± 0.6623 mm to S.typhimurium. In in-vivo, mice were initially infected with S. typhimurium and then withVCOH. The feces of miceshowed a decrease in the number of colonies S.
typhimurium in the feces. Clinical signs and histological damage were rarely observed in treated mice, whereas the untreated group and the comparison group showed clinical signs of diarrhea, weight loss and histological damage in the liver and spleen. It can be concluded that the results of this study indicate that the enzymatic hydrolysis of VCO has potential as an anti-Salmonella.
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
PERSETUJUAN TESIS ... ii
PENGESAHAN TESIS ... iii
SURAT PERNYATAAN... iv
KATA PENGANTAR ... v
ABSTRAK ... viii
ABSTRACT ... ix
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
DAFTAR TABEL ... xv
DAFTAR GAMBAR ... xvi
BAB I PENDAHULUAN ... 1 1.1 Latar Belakang ... 1 1.2 Perumusan Masalah ... 5 1.3 Hipotesis Penelitian ... 5 1.4 Tujuan Penelitian ... 6 1.5 Manfaat Penelitian ... 6
1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 10
2.1Salmonella ... 10
2.1.1 Epidemiologi ... 13
2.1.3 Etiologi ... 18
2.1.4 Diagnosis ... 19
2.1.5 Manifestasi Klinis ... 19
2.1.6 Pemeriksaan Laboratorium ... 20
2.1.7 Penatalaksanaan Demam Tifoid ... 21
2.1.8 Komplikasi ... 24
2.1.9 Prognosis ... 24
2.1.10 Pencegahan ... 24
2.2 Trigliserida dan Asam lemak ... 25
2.3 Hidrolisis Trigliserida ... 29
2.4 Penentuan Bilangan Asam ... 31
2.5 Minyak kelapa murni ... 33
2.6 Aktivitas Antibakteri Minyak Kelapa Murni ... 36
2.7 Kemampuan Antibakteri Asam Laurat dan Monolaurin ... 38
2.8 Penentuan Aktivitas Antibakteri Minyak Kelapa Murni ... 41
2.9 Histopatologi ... 47
2.9.1 Anatomi dan Histologi Hati ... 48
2.9.2 Anatomi dan Histologi Limpa ... 50
BAB III METODE PENELITIAN ... 53
3.1 Desain Penelitian ... 53
3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ... 53
3.3 Alat-Alat ... 53
3.4 Bahan ... 54
3.5.1 Hidrolisis Minyak Kelapa Murni secara Enzimatik ... 54
3.5.2 Penentuan Bilangan Asam ... 56
3.5.3 Penentuan Aktivitas Antibakteri secara In-Vitro ... 57
3.5.3.1 Sterilisasi ... 57
3.5.3.2 Pemeliharaan Bakteri ... 58
3.5.3.3 Pembuatan Media ... 58
3.5.3.4 Pembuatan Agar Miring ... 60
3.5.3.5 Peremajaan Bakteri ... 61
3.5.3.6 Pembuatan Inokulum ... 61
3.5.3.7 Pembuatan Larutan Uji ... 61
3.5.3.8 Pembuatan Larutan PembandingKloramfenikol ... 62
3.5.3.9 Pengujian Aktivitas Antibakteri secarain-vitro ... 62
3.5.4 Penentuan Aktivitas Antibakteri secara in-vivo ... 63
3.5.4.1 Penyiapan Hewan Percobaan ... 63
3.5.4.2 Pengujian Aktivitas Antibakteri secarain-vivo menggunakan Mencit ... 63
3.5.4.3 Penyiapan Organ Histopatologi ... 65
3.6Analisis Data ... 66
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 67
4.1 Masa Inkubasi Hidrolisis Enzimatis Minyak Kelapa Murni .. 67
4.2 Aktivitas Antibakteri dariHasil Hidrolisis EnzimatisMinyak Kelapa Murni terhadap Salmonellasecara in-vitro ... 71
4.3 Aktivitas Antibakteri dari Hasil Hidrolisis EnzimatisMinyak Kelapa Murni terhadap Salmonellasecara in-vivo ... 76
4.4 Perubahan pada Organ Histopatologi ... 82
5.1 Kesimpulan ... 90
5.2 Saran ... 91
DAFTAR PUSTAKA ... 92
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Bagan alur penelitian ... 98
Lampiran 2 Bahan dan alat yang digunakan ... 101
Lampiran 3 Ethical Clearance ... 107
Lampiran 4 Prosedur kerja histopatologis jaringan ... 108
Lampiran 5 Data hasil perhitungan pembakuan NaOH ... 109
Lampiran 6 Data hasil orientasi perhitungan bilangan asam ... 111
Lampiran 7 Data perhitungan bilangan asam ... 112
Lampiran 8 Analisis statistik bilangan asam dari VCO dan hasil hidrolisis enzimatis VCO ... 114
Lampiran 9 Data hasil pengujian aktivitas antibakteri secara in-vitro .... 115
Lampiran 10 Analisis statistic zona hambat VCO, hasil hidrolisis enzimatis VCOKloramfenikol danEtanol terhadap bakteriSalmonella typhidanSalmonella typhimurium ... 117
Lampiran 11 Hewan percobaan ... 118
Lampiran 12 Volume maksimum larutan sediaan uji yang dapat Diberikan pada hewan uji ... 119
Lampiran 13 Data berat badan mencit harian. ... 120
Lampiran 14 Konsistensi feses ... 121
Lampiran 15 Data jumlah koloni bakteri (CFU g-1)dalam feses mencit tiap kelompok ... 122
Lampiran 16 Data mentah jumlah koloni bakteri dalam feses mencit ... 123
Lampiran 17 Jumlah koloni bakteri dalam feses mencit pada cawan petri secara in-vivo ... 142
Lampiran 18 Sertifikat pengujian kloramfenikol BPFI ... 144
Lampiran 19 Orientasi dosis kloramfenikol untuk mencit... 145
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Standar interpretasi diameter zona hambatan antibiotika ... 23
Tabel 2.2 Klasifikasi enzim lipase berdasarkan spesifikasinya ... 31
Tabel 2.3 Standar mutu minyak kelapa murni ... 36
Tabel 2.4 Mikroorganisme yang dihambat oleh asam laurat ... 40
Tabel 2.5 Hasil penelitianmengenai sifat antimicrobial asam laurat, monolaurin dan minyak kelapa murni ... 45
Tabel 4.1 Masa inkubasi hidrolisis enzimatis VCO ... 68
Tabel 4.2 Daya hambatVCO, hasil hidrolisis Enzimatis VCO, Kloramfenikol, dan etanolterhadap Salmonella typhi dan Salmonella typhimurium ... 73
Tabel 4.3 Data berat badan rata-rata mencit harian ... 76
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.1 Kerangka Pikir Penelitian ... 8
Gambar 2.1 Struktur dinding sel bakteri Bakteri Gram-negatif dan Bakteri Gram-positif ... 10
Gambar 2.2 Struktur Kimia Lemak (Triasilgliserol) ... 26
Gambar 2.3 Persamaan Reaksi Hidrolisis ... 29
Gambar 2.4 Rumus Struktur Asam Laurat dan Monolaurin ... 39
Gambar 2.5 Gambaran histologi hati mencit normal ... 49
Gambar 2.6 Gambaran histologi hati mencit yang diberi perlakuan .... 49
Gambar 2.7 Gambaran Histologi Limpa ... 52
Gambar 3.1 Ilustrasi percobaan ... 64
Gambar 4.1 Grafik hubungan masa inkubasi dengan bilangan asam hasil hidrolisis enzimatis VCO ... 69
Gambar 4.2 Hasil uji antibakteri dari hasil hidrolisis enzimatis VCO terhadap Salmonella typhimurium secara in-vitro ... 71
Gambar 4.3 Hasil uji antibakteri dari hasil hidrolisis enzimatis VCO terhadap Salmonella typhi secara in-vitro... 72
Gambar 4.4 Mencit ... 77
Gambar 4.5 Grafik hubunganjumlahkoloni S.typhimuriumdalam feses per hari ... 80
Gambar 4.6 Gambaran histopatologihati normal mencitkelompok kontrol (KN) ... 83
Gambar 4.7 Gambaranhistopatologi hati mencitkelompok Salmonella typhimurium Infected (SI ) ... 84
Gambar 4.8 Gambaranhistopatologi hati mencitkelompok Salmonella typhimurium Infected diberi antibiotik Kloramfenikol (SI-Klor) ... 84
Gambar 4.9 Gambaranhistopatologi hati mencit pada kelompok Salmonella typhimurium Infecteddiberi minyak kelapa
murni (SI-VCO) ... 85 Gambar 4.10 Gambaran histopatologi hatimencitpada kelompok
Salmonella typhimuriumInfected diberi hasil hidrolisis
enzimatis minyak kelapa murni (SI-VCOH) ... 85
Gambar 4.11 Gambaran histopatologi limpa normal mencit kelompok
kontrol (KN) ... 86 Gambar 4.12 Gambaranhistopatologi limpamencitkelompok
Salmonella typhimurium Infected (SI) ... 87 Gambar 4.13 Gambaranhistopatologi limpamencitkelompok
Salmonella typhimurium Infected diberi antibiotik
Kloramfenikol (SI-Klor) ... 87 Gambar 4.14 Gambaran histopatologilimpamencit pada kelompok
Salmonella typhimuriumInfected diberi minyak kelapa
murni (SI-VCO) ... 88 Gambar 4.15 Gambaran histopatologilimpamencit pada kelompok
Salmonella typhimuriumInfecteddiberi hasil hidrolisis
