presentasi bilirubin kimia klinik

Minggu, 22 Januari 2012

Pemeriksaan Bilirubin dan Urobilinogen

Pemeriksaan Bilirubin dan Urobilinogen

 Tujuan : Untuk mengetahui ada tidaknya Bilirubin dan Urobilinogen dalam urin dan untuk mengetahui

sumbatan pada empedu.

 Metode :

a. Metode Harrison

b. Metode Rosin

c. Metode Ehrlich ( Urobilinogen )

d. Metode Schlesinger ( Urobilin )

 Prinsip :

A. Metode Harrison

BaCl2 bereaksi dengan sulfat dalam urin membentuk endapan BaSO4 dan bilirubin menempel pada

molekul ini. FeCl3 mengoksidasi bilirubin menjadi biliverdin yang berwarna hijau.

B. Metode Rosin

Iodium akan mengoksidasi bilirubin menjadi biliverdin yang berwarna hijau. C. Metode Ehrlich ( Urobilinogen )

Urobilinogen dengan para dimetilaminobenzaldehid akan membentuk kompleks berwarna merah anggur. D. Metode Schlesinger ( Urobilin )

Urobilin dengan reagen schesinger membentuk suatu kompleks dengan memberikan fluoresensi hijau.

 Dasar teori :

Bilirubin adalah suatu pigmen empedu yang diproduksi oleh sel – sel

hepar bersama dengan garam empedu sebagai cairan empedu. Bilirubin yang terdapat dalam urin berasal dan diproses dari bilirubin yang terkonjugasi secara aktif dan disalurkan bersama – sama dengan komponen empedu lainnya menuju ke usus halus. Bilirubin yang tidak diserap masuk kedalam usus, diproses oleh bakteri dan dieksresikan oleh ginjal dalam urin. Bilirubinuria menetap selama penyakit berlangsung, namun uroblinogen kemih akan menghilang sementara waktu bilamana fase obstruktif yang disebabkan oleh kolestatis dalam perjalanan penyakit selanjutnya dapat timbul peningkatan urobilinogen kemih sekunder. Dari saluran empedu, bilirubin terkonjugasi dialirkan keusus. Didalam usus halus hanya sebagian kecil bilirubin terkonjugasi yang reabsorbsi. Pada bagian terminal usus halus dan usus besar, bilirubin terkonjugasi akan dihidrolisis menjadi bilirubin tak terkonjugasi oleh enzim β glukuronidase yang berasal dari hati, sel – sel epitel usus dan bakteri usus. Bilirubin tak terkonjugasi ini direduksi oleh flora usus menjadi kelompok senyawa tetrapirol tak berwarna yang disebut urobilinogen. Transfor bilirubin terkonjugasi melalui membran sel dan sekresi kedalam kanalikuli dalam hati. Agar dapat diekskresikan dalam empedu, bilirubin harus dikonjugasi. Bilirubin terkonjugasi kemudian diekskresikan melalui saluran empedu kedalam usus halus. Bilirubin tak terkonjugasi tidak diekskresikan kedalam empedu kecuali setelah proses foto oksidasi.

Alat : Bahan : Reagen :

 Rak tabung reaksi Urin segar  pereaksi fouchet

 Tabung reaksi  Larutan BaCl₂

 Pipet ukur  Larutan Iodium 1%

 Pipet tetes  Pereaksi Ehrlich

 Batang pengaduk  Pereaksi Schlesinger

 Cara Kerja :

1. Pemeriksaan Bilirubin

a. Metode Harrison

 Tabung reaksi diisi 5 ml urin

 Ditambah 5 ml BaCl₂ 10%, dicampur kemudian disaring dengan kertas saring

 Kertas saring dibuka, presipitat pada kertas saring dibiarkan kering

 Ditambah 1 tetes reagen fouchet pada presipitat

b. Metode Rosin

 Diisi 2 ml urin kedalam tabung reaksi

 Ditambah 1 ml iodium 1% lewat dinding tabung sehingga terbentuk 2 lapisan larutan

 Amati perbatasan kedua lapisan

2. Pemeriksaan Urobilinogen

a. Metode Ehrlich

 Tabung reaksi diisi 5 ml urin, ditambah 3 tetes reagen ehrlich

 Diamati perubahan warna

b. Metode Schlesinger

 Tabung reaksi diisi 5 ml urin, ditambah 2 tetes pereaksi lugol

 Ditambah 5 ml reagen schlesinger, dicampur

 Disaring sampai dapat filtrat yang jernih

 Filtrat diperiksa dengan latar yang gelap

 Pembacaan hasil :

1. Pemeriksaan Bilirubin

a. Metode Harrison

Tabung reaksi diisi 5 ml urin + 5 ml BaCl2 10%, dicampur  disaring, dibiarkan kering + 1 tetes reagen

b. Metode Rosin

2 ml urin + 1 ml iodium 1% lewat dinding tabung  terdapat 2 lapisan berwarna hijau ( + ) 2. Pemeriksaan Urobilinogen

a. Metode Ehrlich

5ml urin + 3 tetes reagen Ehrlich  timbul warna merah anggur ( + ) b. Metode Schlesinger

5ml urin + 2 tetes lugol + 5 ml reagen schlesinger, campur  disaring  filtrat diperiksa dengan latar gelap  fluoresensi hijau pada filtrat ( + )

 Pembahasan :

Pada bilirubin mengindikasi pada gangguan hati atau saluran empedu, seperti pada hepatitis infeksma toksi hepar kanker hati. Urin yang mengandung bilirubin tinggi tampak berwarna kuning pekat dan jika digoyang – goyang akan timbul busa. Peningkatan ekskresi jika fungsi hepar menurun atau kelebihan urobilinogen. Hasil ( + ) jika setelah olahraga / minum ataupun kelelahan / sembelit. Jika menurun dijumpai pada kanker pankreas, penyakit hati.

 Kesimpulan : Dari praktikum bilirubin dan urobilinogen dalam urin dapat disimpulkan :

1. Pemeriksaan bilirubin

a. Metode Harrison : menunjukkan hasil ( + ) yang ditunjukkan dengan warna hijau.

b. Metode Rosin : menunjukkan hasil ( + ), yang ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau pada

perbatasan kedua lapisan. 2. Pemeriksaan Urobilinogen

a. Metode Ehrlich : hasil ( + ), yang ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah anggur.

b. Metode Schlesinger : hasil ( + ), ditunjukkan dengan terbentuknya fluoresensi hijau.

DAFTAR PUSTAKA

 Mc Pherson, A. R., & Sacher, A. R. (2004). Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Jakarta:

Panerbit Buku Kedokteran EGC.

 Tim Praktikum Kimia Klinik. (2011). Buku Petunjuk Praktikum Kimia Klinik I.Yogyakarta: Akademi Analis

Kesehatan Manggala Yogyakarta.

 Gjandasoebrata R . 1986, Penuntun Laboratorium Klinik . Jakarta . Dian Rakyat

 Mc Pherson, A. R., & Sacher, A. R. (2004). Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Jakarta:

Panerbit Buku Kedokteran EGC.Tim Praktikum Kimia Klinik. (2011). Buku Petunjuk Praktikum Kimia Klinik I. Yogyakarta: Akademi Analis Kesehatan Manggala Yogyakarta

dasar teori bilirubin

Bilirubin total

Bilirubin adalah pigmen kuning yang berasal dari perombakan heme dari hemoglobin dalam proses pemecahan eritrosit oleh sel retikuloendotel. Di samping itu sekitar 20% bilirubin berasal dari perombakan zat-zat lain. Sel retikuloendotel membuat bilirubin tidak larut dalam air, bilirubin yang disekresikan dalam darah harus diikatkan albumin untuk diangkut dalam plasma menuju hati.(3:295) Di dalam hati, hepatosit melepaskan ikatan dan mengkonjugasinya dengan asam glukoronat sehingga bersifat larut air, sehingga disebut bilirubin direk atau glukoroniltransferase, selain dalam bentuk diglukoronida dapat juga dalam bentuk bilirubin terkonjugasi. Proses

konjugasi melibatkan enzim glukoroniltransferase, selain dalam bentuk diglukoronida dapat juga dalam bentuk monoglukoronida atau ikatan dengan glukosa, xylosa dan sulfat.

terkonjugasi dikeluarkan melalui proses energi kedalam sistem bilier. (3:295)

Bilirubin berikatan dengan albumin sehingga zat ini dapat diangkut ke seluruh tubuh. Dalam bentuk ini, spesies molekular disebut bilirubin tak terkonjujgasi. Sewaktu zat ini beredar melalui hati, hepatosit melakukan fungsi sebagai berikut :

1. Penyerapan bilirubin dan sirkulasi

2. Konjugasi enzimatik sebagai bilirubin glukuronida

3. Pengangkutan dan ekskresi bilirubin terkonjugasi ke dalam empedu untuk dikeluarkan dari tubuh Konjugasi intrasel asam glukoronat ke dua tempat di molekul bilirubin menyebabkan bilirubin bermuatan negatif, sehingga bilirubin terkonjugasi ini larut dalam fase air. Apabila terjadi obstruksi atau kegagalan lain untuk mengekskresikan bilirubin terkonjugasi ini zat ini akan masuk kembali ke dan tertimbun dalam sirkulasi (3:295)

Selain bilirubin masuk ke dalam usus, bakteri kolon mengubah bilirubin menjadi urobilinogen yaitu beberapa senyawa tidak berwarna yang kemudian mengalami oksidasi menjadi pigmen coklat

urobilin.Urobilin diekskresikan dalam feses tetapi sebagian urobilinogen direabsorpsi melalui usus,

dan melalui sirkulasi portal diserap oleh hati dan direekskresikan dalam empedu. Karena larut air, urobilinogen juga dapat keluar melalui urin apabila mencapai ginjal.(3:295)

Pembentukan bilirubin

Dalam keadaan fisiologis, masa hidup eritrosit manusia sekitar 120 hari, eritrosit mengalami lisis 1-2×108 setiap jamnya pada seorang dewasa dengan berat badan 70 kg, dimana diperhitungkan hemoglobin yang turut lisis sekitar 6 gr per hari. Sel-sel eritrosit tua dikeluarkan dari sirkulasi dan

dihancurkan oleh limpa. Apoprotein dari hemoglobin dihidrolisis menjadi komponen asam-asam aminonya. Katabolisme heme dari semua hemeprotein terjadi dalam fraksi mikrosom sel

retikuloendotel oleh sistem enzim yang kompleks yaitu heme oksigenase yang merupakan enzim dari keluarga besar sitokrom P450. Langkah awal pemecahan gugus heme ialah pemutusan jembatan α metena membentuk biliverdin, suatu tetrapirol linier. Besi mengalami beberapa kali reaksi reduksi dan oksidasi, reaksi-reaksi ini memerlukan oksigen dan NADPH. Pada akhir reaksi dibebaskan Fe3+ yang dapat digunakan kembali, karbon monoksida yang berasal dari atom karbon jembatan metena dan biliverdin. Biliverdin, suatu pigmen berwarna hijau akan direduksi oleh biliverdin reduktase yang menggunakan NADPH sehingga rantai metenil menjadi rantai metilen antara cincin pirol III – IV dan membentuk pigmen berwarna kuning yaitu bilirubin. Perubahan warna pada memar

merupakan petunjuk reaksi degradasi ini. (4:2)

Bilirubin bersifat lebih sukar larut dalam air dibandingkan dengan biliverdin. Dalam setiap 1 gr hemoglobin yang lisis akan membentuk 35 mg bilirubin dan tiap hari dibentuk sekitar 250–350 mg pada seorang dewasa, berasal dari pemecahan hemoglobin, proses erytropoetik yang tidak efekif dan pemecahan hemprotein lainnya. Bilirubin dari jaringan retikuloendotel adalah bentuk yang sedikit larut dalam plasma dan air. Bilirubin ini akan diikat nonkovalen dan diangkut oleh albumin ke hepar. Dalam 100 ml plasma hanya lebih kurang 25 mg bilirubin yang dapat diikat kuat pada albumin. Bilirubin yang melebihi jumlah ini hanya terikat longgar hingga mudah lepas dan berdifusi ke jaringan. Bilirubin yang sampai dihati akan dilepas dari albumin dan diambil pada permukaan sinusoid hepatosit oleh suatu protein pembawa yaitu ligandin. Sistem transport difasilitasi ini mempunyai kapasitas yang sangat besar tetapi penggambilan bilirubin akan tergantung pada kelancaran proses yang akan dilewati bilirubin berikutnya. Bilirubin nonpolar akan menetap dalam sel jika tidak diubah menjadi bentuk larut. Hepatosit akan mengubah bilirubin menjadi bentuk larut yang dapat diekskresikan dengan mudah kedalam kandung empedu. Proses perubahan tersebut melibatkan asam glukoronat yang dikonjugasikan dengan bilirubin, dikatalisis oleh enzim bilirubin glukoronosiltransferase. Hati mengandung sedikitnya dua isoform enzym glukoronosiltransferase yang terdapat terutama pada retikulum endoplasma. Reaksi konjugasi ini berlangsung dua tahap, memerlukan UDP asam glukoronat sebagai donor glukoronat. Tahap pertama akan membentuk bilirubin monoglukoronida sebagai senyawa antara yang kemudian dikonversi menjadi bilirubin diglukoronida yang larut pada tahap kedua.

Metabolisme Bilirubin

Hati merupakan organ terbesar, terletak di kuadran kanan atas rongga abdomen. Hati melakukan banyak fungsi penting dan berbeda-beda dan trgantung pada sistem darahnya yang unik dan sel-selnya yang sangat khusus. Hati tertutupi kapsul fibroelastik berupa kapsul glisson. Kapsul glisson berisi pembuluh darah, pembuluh limfe, dan saraf. Hati terbagi menjadi lobus kanan dan lobus kiri. Tiap lobus tersusun atas unit-unit kecil yang disebut lobulus. Lobulus terdiri sel-sel hati, disebut hepatosit yang menyatu dalam lempeng. Hepatosit dan jaringan hati mudah mengalami regenerasi. (3:216)

Hati menerima darah dari 2 sumber, yaitu arteri hepatika (banyak mengandung oksigen) yang mengalirkan darah ±500 ml/mnt dan vena porta (kurang kandungan oksigen tapi kaya zat gizi, dan mungkin berisi zat toksik dan bakteri) yang menerima darah dari lambung, usus, pankreas dan limpa; mengalirkan darah ±1000 ml/mnt. Kedua sumber tersebut mengalir ke kapiler hati yang disebut sinusoid lalu diteruskan ke vena sentralis ditiap lobulus. Dan dari semua lobulus ke vena hepatika berlanjut ke vena kava inferior. Tekanan darah di sistem porta hepatika sangat rendah, ±3 mmHg dan di vena kava hampir 0 mmHg. Karena tidak ada resistensi aliran melalui vena porta dan vena kava sehingga darah mudah masuk dan keluar hati. Hati menjalankan berbagai macam fungsi terutama metabolisme, baik anabolisme atau katabolisme molekul-molekul makanan dasar (gula, asam lemak, asam amino) dilakukan oleh sel-sel hati. (3:216)

Bilirubin merupakan suatu senyawa tetrapirol yang dapat larut dalam lemak maupun air yang berasal dari pemecahan enzimatik gugus heme dari berbagai heme protein seluruh tubuh. Sebagian besar ( kira- kira 80 % ) terbentuk dari proses katabolik hemoglobin, dalam proses penghancuran eritrosit oleh RES di limpa, dan sumsum tulang. Disamping itu sekitar 20 % dari bilirubin berasal dari sumber lain yaitu non heme porfirin, prekusor pirol dan lisis eritrosit muda. Dalam keadaan fisiologis pada manusia dewasa, eritrosit dihancurkan setiap jam. Dengan demikian bila hemoglobin dihancurkan dalam tubuh, bagian protein globin dapat dipakai kembali baik sebagai protein globin maupun dalam bentuk asam- asam aminonya.(3:216-217)

Metabolisme bilirubin diawali dengan reaksi proses pemecahan heme oleh enzim hemoksigenase yang mengubah biliverdin menjadi bilirubin oleh enzim bilirubin reduksitase. Sel retikuloendotel membuat bilirubin tak larut air, bilirubin yang sekresikan ke dalam darah diikat albumin untuk diangkut dalam plasma. Hepatosit adalah sel yang dapat melepaskan ikatan, dan

mengkonjugasikannya dengan asam glukoronat menjadi bersifat larut dalam air. Bilirubin yang larut dalam air masuk ke dalam saluran empedu dan diekskresikan ke dalam usus . Didalam usus oleh flora usus bilirubin diubah menjadi urobilinogen yang tak berwarna dan larut air, urobilinogen mudah dioksidasi menjadi urobilirubin yang berwarna. Sebagian terbesar dari urobilinogen keluar tubuh bersama tinja, tetapi sebagian kecil diserap kembali oleh darah vena porta dikembalikan ke hati. Urobilinogen yang demikian mengalami daur ulang, keluar lagi melalui empedu. Ada sebagian kecil yang masuk dalam sirkulasi sistemik, kemudian urobilinogen masuk ke ginjal dan diekskresi bersama urin (3:217)

Metabolisme Bilirubin di Hati

Metabolisme bilirubin dalam hati dibagi menjadi 3 proses: 1. Pengambilan (uptake) bilirubin oleh sel hati

2. Konjugasi bilirubin

BILIRUBIN DIREK

Bilirubin terkonjugasi /direk adalah bilirubin bebas yang bersifat larut dalam air sehingga dalam pemeriksaan mudah bereaksi. Bilirubin terkonjugasi (bilirubin glukoronida atau hepatobilirubin ) masuk ke saluran empedu dan diekskresikan ke usus. Selanjutnya flora usus akan mengubahnya menjadi urobilinogen.(6:1)

Bilirubin terkonjugasi bereaksi cepat dengan asam sulfanilat yang terdiazotasi membentuk azobilirubin. Peningkatan kadar bilirubin direk atau bilirubin terkonjugasi dapat disebabkan oleh gangguan ekskresi bilirubin intrahepatik antara lain Sindroma Dubin Johson dan Rotor, Recurrent (benign) intrahepatic cholestasis, Nekrosis hepatoseluler, Obstruksi saluran empedu. Diagnosis tersebut diperkuat dengan pemeriksaan urobilin dalam tinja dan urin dengan hasil negatif. (6:1) Faktor – Faktor Yang Mempengaruhi Stabilitas Bilirubin Total

Dalam suatu pemeriksaan bilirubin total, sampel akan selalu berbubungan langsung dengan faktor luar. Hal ini erat sekali terhadap kestabilan kadar sampel yang akan diperiksa, sehingga dalam pemeriksaan tersebut harus memperhatikan faktor-faktor yang mempengaruhi stabilitas kadar bilirubin total dalam serum diantaranya yaitu

a. Sinar

Stabilitas bilirubin dalam serum pada suhu kamar tidak stabil dan mudah terjadi kerusakan terutama oleh sinar, baik sinar lampu ataupun sinar matahari. Serum atau plasma heparin boleh digunakan, hindari sampel yang hemolisis dan sinar matahari langsung. Sinar matahari langsung dapat menyebabkan penurunan kadar bilirubin serum sampai 50% dalam satu jam, dan pengukuran bilirubin total hendaknya dikerjakan dalam waktu dua hingga tiga jam setelah pengumpulan darah. Bila dilakukan penyimpanan serum hendaknya disimpan di tempat yang gelap, dan tabung atau botol yang berisi serum di bungkus dengan kertas hitam atau aluminium foil untuk menjaga stabilitas serum dan disimpan pada suhu yang rendah atau lemari pendingin (5:6)

b. Suhu Penyimpanan

Suhu merupakan faktor luar yang selalu berhubungan langsung terhadap sampel, baik saat penyimpanan maupun saat pemeriksaan. Pemeriksaan kadar bilirubin total sebaiknya diperiksa segera, tapi dalam keaadaan tertentu pemeriksaan kadar bilirubin total bisa dilakukan penyimpanan. Dengan penyimpanan yang benar stabilitas serum masih stabil dalam waktu satu hari bila disimpan pada suhu 15 ºC-25ºC, empat hari pada suhu 2ºC-8ºC, dan tiga bulan pada penyimpanan -20ºC . (DialineDiagnostik ). Lamanya sampel kontak dengan faktor-faktor di atas berpengaruh terhadap kadar bilirubin didalam sampel sehingga perlu upaya mengurangi pengaruh tersebut serta

mengoptimalkan kadar bilirubin total di dalam serum agar dapat bereaksi dengan zat pereaksi secara sempurna, sedangkan reagen bilirubin total akan tetap stabil berada pada suhu 2-8ºC dalam keadaan tertutup, terhindar dari kontaminan dan sinar. Dalam hal ini dapat dimungkinkan bahwa penurunan kadar bilirubin dipengaruhi oleh kenaikan suhu dan pengaruh sinar yang berintensitas tinggi .(5:7)