Skrining Pseudomonas sp. AZM-1 mikroba pelarut fosfat
Mikroba yang membawa gen pelarut fosfat adalah Pseudomonas sp. AZM-1. Peremajaan kembali mikroba hasil isolasi dilakukan dengan menyebarkan ke dalam plate agar pikovskaya pada inkubasi suhu ruang selama 24 jam (Gambar 6a), kemudian digoreskan pada media pikovskaya di tabung reaksi selama 4-5 jam untuk mendapatkan fase logaritmatiknya (Gambar 6b). Selanjutnya digoreskan pada media Pikovskaya + Chl 100 µg/mL dan yang menunjukkan zona bening dipilih dan dipindahsemaikan dalam cawan agar dan didapatkan koloni-koloni yang menunjukkan zona bening (Gambar 6c). Hanya Pseudomonas sp. AZM-1 yang dapat melarutkan fosfat dan resisten terhadap chloramfenikol yang digunakan untuk bahan penelitian.
a b c
Gambar 6. Penampilan koloni Pseudomonas sp. AZM-1 pembawa gen pelarut fosfat pada media phykovskaya: a. Peremajaan dari sel tunggal
Pseudomonas sp. AZM-1 hasil isolasi, b. Pertumbuhan fase
logaritmatik, c. Penampilan pertumbuhan murni pada media pykovskaya menunjukkan zona bening.
Mutagenesis dengan Transposon dan Seleksi Mutan
Mutagenesis dengan transposon mini Tn5Km1 pada Pseudomonas sp. AZM-1 didapatkan dari hasil inkubasi selama 24 jam. Hasil suspensi sel transkonjugan yang disebarkan di atas media pykovskaya agar + Chl 50 µg/mL + Km 50 µg/mL dan
diinkubasi selama 24 jam menghasilkan kepadatan sel pada kisaran 106 - 108.
Frekuensi transkonjugasi yang terjadi tampak tinggi yaitu 1.4 x 10-4 dimana mutan
Pseudomonas sp. AZM-1 mampu hidup pada media pykovskaya agar yang telah
ditambahkan antibiotik. Namun, mutan non pelarut fosfat dari pertumbuhan hasil sebaran tersebut masih belum menampakkan perbedaan antara koloni mutan transkonjugan pelarut fosfat dengan mutan non pelarut fosfat karena koloni yang terbentuk masih berhimpit antara Pseudomonas sp. AZM-1 mutan non pelarut fosfat dengan dan mutan pelarut fosfat. Frekuensi transkonjugasi mutan negatif pelarut fosfat yaitu 3 x 10-9 yang didapatkan dari pengenceran 10-9 yaitu diperoleh tiga buah sel tunggal mutan non pelarut fosfat.
Gambar 7. Mutan Pseudomonas sp. AZM-1 pada pikovskaya agar + Chl 50 µg/mL + Km 50 µg/mL yang diinkubasi selama 24 jam.
Koloni mutan transkonjugan hasil konjugasi ditapis ulang untuk mendapatkan mutan negatif pelarutan fosfat yang diharapkan. Penapisan terhadap mutan menunjukkan bahwa frekuensi mutan negatif pelarut fosfat adalah kecil. Bila mutan ini tumbuh berhimpitan dengan tipe liar pelarut fosfat maka penampilan dalam media pykovskaya lebih dominan membentuk zona bening. Untuk mendapatkan koloni dari sel tunggal mutan negatif pelarut fosfat maka koloni mutan negatif pelarut fosfat yang tidak menampakkan membentuk zona bening diencerkan dengan
faktor x 10-9. Dari penapisan ulang ini beberapa mutan negatif pelarutan fosfat
a b
Gambar 8. Penapisan terhadap mutan untuk mendapatkan mutan negatif pelarut fosfat: a. koloni Pseudomonas sp. AZM-1 tipe liar pelarut fosfat, b. mutan Pseudomonas sp. AZM-1negatif pelarut fosfat.
Isolasi dan pemotongan DNA genom total mutan negatif pelarut fosfat Pseudomonas sp. AZM-1
DNA genom dari mutan bukan pelarut fosfat Pseudomonas sp. AZM-1 berhasil diisolasi dengan menggunakan metode CTAB. DNA genom total berhasil dipotong dengan enzim restriksi EcoRV (Gambar 9.) Fragmen EcoRV ini kemudian direligasi sehingga membentuk molekul sirkuler.
Gambar 9. Elektroforesis gel agarose DNA genom mutan Pseudomonas sp. AZM-1 yang bukan pelarut fosfat.
Amplifikasi fragmen DNA pengapit miniTn5 menggunakan Inverse PCR
Amplifikasi DNA yang diapit oleh mini Tn5 (fragmen EcoRV) dengan PCR menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 1000 pasang basa (pb) (Gambar 10) yang kemudian disebut dengan fragmen EcoRV.
Pita genom
Gambar 10. DNA hasil PCR yang diapit oleh mini TN5 (1=sampel; 2=penanda ukuran 1 kb plus).
Pengklonan dan hasil amplifikasi fragmen DNA pengapit miniTn5
Amplikon fragment yang diapit miniTn5 disisipkan pada pGEM®-T Easy dan
kemudian diintroduksikan pada E. coli DH5α. Keberhasilan penyisipan (ligasi) dan transformasi diketahui melalui seleksi biru putih dan resistensi bakteri terhadap antibiotika ampisilin pada media tumbuh bakteri. E. coli yang dapat bertahan hidup di media seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin, X-gal dan IPTG berarti mengandung plasmid, dan koloni E. coli yang berwarna putih di media seleksi adalah E. coli yang mengandung plasmid rekombinan, sedangkan yang berwarna biru adalah E. coli yang mengandung plasmid non-rekombinan (Gambar 11).
Gambar 11. Koloni-koloni E. coli DH5α berwarna biru (diduga tidak membawa plasmid rekombinan dan putih diduga membawa palsmid rekombinan) pada media LA yang mengandung 100 μg/ml ampisilin, 10 μl 100 mM isopropiltio-β-galaktosida (IPTG) (Promega) dan 50 μl
2%(b/v) X-gal (5-bromo-4-choloro-3-indolyl-β-D-galactoside)
(Promega) hasil inkubasi pada suhu 37°C semalam.
1 2 3000 pb 2000 pb 1500 pb 1000 pb 700 pb 500 pb Koloni biru Koloni putih
1 2 3 4 5
1000 pb
Gen lacZ menyandi β-galactosidase (β-gal) yang mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru bila ada IPTG yang berfungsi menginduksi promotor lac Z. Bila amplikon DNA yang diapit mini Tn5 menyisip pada gen lacZ, maka gen lacZ tidak dapat diekspresikan sehingga koloni E. coli berwarna putih. Bila tidak ada penyisipan pada lacZ, maka koloni yang terbentuk akan berwarna biru.
Verifikasi koloni putih dilakukan menggunakan PCR koloni. Verifikasi
dilakukan untuk memastikan fragmen yang menyisip pada pGEM®-T Easy adalah
fragmen yang diharapkan yaitu ukurannya sesuai dengan ukuran hasil amplifikasi fragmen DNA pengapit miniTn5. Hasil verifikasi menunjukkan bahwa 4 koloni yang berwarna putih yang diPCR menghasilkan pita yang ukurannya sesuai dengan DNA sisipan (Gambar 12). Hasil ini menunjukkan adanya konsistensi hasil. Selain itu terdapat satu koloni putih yang tidak membawa sisipan sebagai koloni putih palsu. Adanya koloni putih palsu ini disebabkan oleh kemungkinan X-gal tidak tersebar secara merata di media.
Gambar 12. Hasil PCR dengan koloni putih sebagai cetakan. 1=. penanda 1 kb plus; 2= koloni 1; 3= koloni 2; 4= koloni 3; 5= koloni 4
PCR koloni yang menghasilkan fragmen DNA yang sesuai dengan ukuran yang diharapkan belum tentu hasil dari amplifikasi fragmen yang menyisip pada plasmid rekombinan, tetapi hasil amplifikasi genom bakteri atau fragmen DNA lain
650pb 350pb 3000pb 1 2 3 2000pb 1500 pb 1000pb 700 pb
yang memiliki kesamaan dengan DNA yang disisipkan. Oleh karena itu plasmid dari koloni putih ini telah diisolasi, dan dipotong dengan EcoRI yang mengapit DNA
sisipan di situs pengklonan pGEM®-T Easy. Pemotongan dengan EcoRI
menghasilkan 3 fragmen DNA yang berukuran sekitar 3000 pb, 650 pb dan 350 pb.
Fragmen berukuran 3000 pb merupakan fragmen vektor pGEM®-T Easy, sedangkan
gabungan fragmen 650 pb dan 350 pb merupakan fragmen sisipan (Gambar 13).
Gambar 13. Verifikasi palsmid rekombinan dengan pemotongan enzim restriksi
EcoRI (1= penanda 1 kb plus; 2= plasmid tidak dipotong; 3= plasmid
dipotong dengan EcoRI).
Terpotongnya sisipan menjadi dua fragmen menunjukkan adanya tempat pemotongan EcoR I pada sisipan tersebut. Jumlah ukuran fragmen sisipan sesuai dengan amplikon fragmen DNA pengapit miniTn5 yaitu sekitar 1000 pb.
Pengurutan fragmen DNA pengapit miniTn5
Pengurutan DNA dengan primer T7 dan SP6 (Lampiran 1.) menghasilkan urutan yang didalamnya terdapat primer Km O, Km I, EcoRI dan EcoRV. Primer Km O terdapat pada urutan ke 47 sampai dengan ke 67 dan komplemen dari Km I pada urutan ke 1032 sampai dengan urutan ke 1052 dengan pengurutan basa primer terbalik, EcoRI pada urutan nukleotida ke 39, 707 dan ke 1065 serta tempat pemotongan EcoRV pada urutan ukleotida ke 957.
DNA sisipan dimulai dari awal primer Km O sampai dengan akhir komplemen dari primer Km I, sehingga DNA sisipan berukuran 1006 pb (Gambar 14). Adanya tiga situs EcoRI menunjang hasil pemotongan plasmid rekombinan dengan EcoRI
yang menghasilkan tiga fragmen, fragmen 3000 pb yang merupakan vektor pGEM®
-T Easy dan dua fragmen sisipan yang masing-masing berukuran 668 pb dan 358 pb.
Analisis Kesamaan Gen Sisipan Dengan Data Gen di Genbank
Urutan gen yang diinaktifkan oleh penyisipan transposon pada mutan
Pseudomonas sp. AZM-1 adalah nukleotida setelah primer Km O dan sebelum
primer komplemen Km I dan Eco RV terletak di kedua sisi mini Tn5. Adanya ligasi pada situs Eco RV dan amplifikasi dengan Km O dan Km I menyebabkan situs Eco RV terletak diantara Km O dan Km I (Gambar 17). Olah sebab itu urutan yang sesungguhnya di dalam Pseudomonas sp. AZM-1 EcoRV terletak di kedua ujung Km O dan Km I diapit oleh Eco RV. Karena EcoRV memotong GATATC diantara T dan A dan primer Km O dan Km I adalah bagian mini Tn5 , maka urutan nukleotida yang diinaktifasi oleh Tn5 adalah ATC - sebelum Km I – setelah Km O – GAT yang berukuran 964 pb (Gambar 15).
Gambar 15. Urutan gen sesungguhnya yang diinaktivasi oleh mini-Tn5
Analisis kesejajaran lokal (Lampiran 3, 4, 6 dan 7.) menunjukkan bahwa fragmen EcoRV ini memiliki tingkat kesamaan lokal yang sangat tinggi yaitu 100 % dengan nukleotida pada genom Pseudomonas fluorescens Pf-5 (UNIPROT:
1 atcaccctggacagcgcgatcagcccagtgttctgggtaaaggcgttgta 51 gggaaagctgttgaacaggccgccttttgccctgctgttgctgtttctcg 101 cctgttccgcccaagccgatgcgccccgcaccttcagcgaagccaagaaa 151 gtcgcctggaagctctacgccccccaatccaccgagttctattgcggctg 201 caaatacaacggcaaccgggtgaacctggcggcctgcggctatgttccgc 251 gcaagaacgccaagcgcgccgaacgcattgaatgggagcatatagtgccg 301 gcctggcagatcggccatcagcgccagtgctggcaacaaggcggtcgcaa 351 gaactgcacacgcaccgattcggtctatcagcgcgccgaggccgacctgc 401 acaatctggtaccgagcattggcgaagtgaatggtgaccgcagcaatttc 451 agcttcggctggctgccggaacaatcgggccagtacggttcgtgcctgac 501 ccaggtcgacttcaaggccaagaaggtcatgcctcgcccttcgattcgcg 551 ggatgatcgcccgcacctacttctacatgagcaagcagtacggactgcgc 601 ctttccaaacaggatcggcagctcttcgaagcctggaacaagacctatcc 651 agtacaggcctgggagcgccagcgcaatcagagcgtggcttgcgtgatgg 701 ggcgcggcaatgaattcgtcggcgcagtcaacctcaaggcttgtggctga 751 acgcagatcgcccgcgggcggcgggcgatcattgagcctatggaaacggg 801 cttactgcgcggcttgatgctcgatgaccgtgacttcgatgtcacgcttc 851 ttggccttgaccagcttttcggtcacttcattcttcttcgcctcggcctc 901 ggcctgggaagcaaacggaccgaccacgaccagacgcttgccgtccacgg 951 tcaccacattggat
Q4KEX8 PSEPF), 87 % dengan Pseudomonas entomophila (UNIPROT: Q1IC29 PSEE4) dan 86% dengan Pseudomonas fluorescens PfO-1 (UNIPROT: Q3KEZ8 PSEF5). Pf-5 adalah gen endA (penyandi enzim endonuklease) sejenis gen endX, gen yang menyandikan enzim endonuklease ekstraseluler (DNAse1) (Gambar 16) .
Gambar 16. Kesejajaran endonuklease 1 yang disandikan oleh gen endA dari
Pseudomonas Fluorescen Pf-5.
Tingkat kekerabatan antar spesies individu dapat dilihat dari pohon filogenetik (Lampiran 5 dan 8). Kekerabatan dalam filogenetik dapat menggambarkan kedekatan antara individu dalam taksonomi, selain itu juga dapat menunjukkan kesamaan peran dan spesifitas gen atau urutan nukleotida. Berdasarkan kesamaan urutan nukleotida gen endA dari Pseudomonas sp. AZM-1 sama dengan endonuclease I dari P. fluorescens Pf-5. Kesamaan antara gen endA Pseudomonas
sp. AZM-1 dengan endonuclease I P. fluorescens Pf-5 mengindikasikan kesamaan
memiliki peran yang sama dengan DNAseI yang berperan dalam ekspresi gen promotor PhyC. DNAse1 berada pada sekuen – 80 dari lokasi PhyC bekerja menguraikan ikatan PhoP~P menjadi regulator PhoP yang berada pada sekuen -35 dan -30 sebelum promotor PhyC, kemudian berinteraksi dengan promotor PhyC sehingga menjadi aktif melakukan transkripsi (Makarewicz et al. 2006). Gambaran filogenetik berdasarkan pada urutan nukleotida gen endA Pseudomonas sp. AZM-1. dari berbagai spesies ditunjukkan pada Gambar 17.
Gambar 17. Dendogram filogenetik berdasarkan urutan nukleotida menunjukkan kesejajaran endonuklease Pseudomonas sp. AZM-1 dengan
Peta Enzim Restriksi Endonuklease Fragmen
Analisis situs pemotongan untuk enzim restriksi pada suatu fragmen DNA penting untuk rekayasa genetika. Analisis situs restriksi terhadap fragmen EcoRV menunjukkan bahwa fragmen tersebut tidak mengandung situs yang terdapat pada situs pengklonan (MCS= multi cloning sites) dari pGEM-T Easy kecuali EcoR1 (Gambar 18). Situs EcoRI terdapat di dalam fragmen DNA pengapit Tn5 sehingga tidak dapat digunakan untuk mengeluarkan sisipan fragmen tersebut dari pGEM-T Easy.
Gambar 18. Peta restriksi endonuklease1 (DNAse1) dari Pseudomonas sp. AZM-1
Urutan asam amino yang dideduksi dari DNA yang disisipi miniTn5
Deduksi urut-urutan asam amino dari DNA yang disipi oleh Tn5 yang merupakan penterjemahan kodon-kodon pada daerah ORF (Open Reading Frame) dengan jumlah urutan sebanyak 228 asam amino (Gambar 19).
1 atcaccctggacagcgcgatcagcccagtgttctgggtaaaggcgttgta 51 gggaaagctgttgaacaggccgccgttttgccctgctgttgctgtttctc 101 gcctgttccgcccaagccgatgcgccccgcaccttcagcgaagccaagaa S A Q A D A P R T F S E A K K 151 agtcgcctggaagctctacgccccccaatccaccgagttctattgcggct V A W K L Y A P Q S T E F Y C G C 201 gcaaatacaacggcaaccgggtgaacctggcggcctgcggctatgttccg K Y N G N R V N L A A C G Y V P 251 cgcaagaacgccaagcgcgccgaacgcattgaatgggagcatatagtgcc R K N A K R A E R I E W E H I V 301 ggcctggcagatcggccatcagcgccagtgctggcaacaaggcggtcgca P A W Q I G H Q R Q C W Q Q G G R 351 agaactgcacacgcaccgattcggtctatcagcgcgccgaggccgacctg K N C T R T D S V Y Q R A E A D L 401 cacaatctggtaccgagcattggcgaagtgaatggtgaccgcagcaattt H N L V P S I G E V N G D R S N 451 cagcttcggctggctgccggaacaatcgggccagtacggttcgtgcctga F S F G W L P E Q S G Q Y G S C L 501 cccaggtcgacttcaaggccaagaaggtcatgcctcgcccttcgattcgc T Q V D F K A K K V M P R P S I R 551 gggatgatcgcccgcacctacttctacatgagcaagcagtacggactgcg G M I A R T Y F Y M S K Q Y G L 601 cctttccaaacaggatcggcagctcttcgaagcctggaacaagacctatc R L S K K Q D R Q L F E A W N K A 651 cagtacaggcctgggagcgccagcgcaatcagagcgtggcttgcgtgatg R T Y F Y M S K Q Y G L R L S K Q 701 gggcgcggcaatgaattcgtcggcgcagtcaacctcaaggcttgtggctg D R Q L F E A W N K T Y P V Q A W 751 aacgcagatcgcccgcgggcggcgggcgatcattgagcctatggaaacgg E R Q R N Q S V A C V M G R G N 801 gcttactgcgcggcttgatgctcgatgaccgtgacttcgatgtcacgctt E F V G A V N L K A C G - - - - - - 851 cttggccttgaccagcttttcggtcacttcattcttcttcgcctcggcct 901 cggcctgggaagcaaacggaccgaccacgaccagacgcttgccgtccacg 951 gtcaccacattggat
Gambar 19. Deduksi asam amino penyusun enzim DNAse1 berdasarkan kodon-kodon pada daerah ORF fragmen gen pada
Pseudomonas sp. AZM-1.
Asam amino yang menyusun endonuklease1 Pseudomonas sp. AZM-1 adalah :
Ala (A) 20 9.3% Arg (R) 18 8.4% Asn (N) 12 5.6% Asp (D) 6 2.8% Cys (C) 9 4.2% Gln (Q) 17 7.9% Leu (L) 10 4.7% Lys (K) 14 6.5% Met (M) 4 1.9% Phe (F) 8 3.7% Pro (P) 9 4.2% Ser (S) 13 6.0%
Glu (E) 11 5.1% Gly (G) 17 7.9% His (H) 3 1.4% Ile (I) 6 2.8% Thr (T) 7 3.3% Trp (W) 7 3.3% Tyr (Y) 10 4.7% Val (V) 14 6.5%
Analisis Domain Fragmen DNA Pengapit Tn5
Analisis kesejajaran lokal asam amino dari fragmem EcoRV dari
Pseudomonas sp. AZM-1 dengan Endonuclease I dari P. fluorescens Pf-5
menunjukkan adanya kesamaan 100 % dimana sebanyak 215 urutan susunan asam amino yang terdapat pada fragmen EcoRV Pseudomonas sp. AZM-1 memiliki kesamaan urutan asam amino dari P. fluorescens Pf-5 yang diketahui bahwa urutan asam amino 1 - 229 adalah endonuclease I (P. fluorescens Pf-5 (YP_259205)) (Gambar 20).
Gambar 20. Kesejajaran asam amino lokal fragmen EcoRV dari Pseudomonas sp.
Daerah konservatif yang memiliki nilai kesamaan tinggi tersebut terbentang dari asam amino ke 35 (104:3) sampai 245 (748:3) sedangkan daerah terjaga yang menunjukkan domain endonuclease 1 pada P. fluorescens Pf-5 ada pada asam amino ke 15 – 229 (Gambar 21).
Gambar 21. Daerah terjaga yang menunjukkan domain endonuclease 1 pada P.
