Aktivitas Ekstrak Etanol Umbi Uwi Ungu (Dioscorea alata L.) terhadap Sel B220+IgE+ pada Mencit BALB/c Model Alergi Pencernaan
Yuyun Ika Christina1)*, Muhaimin Rifa’I 2) 1,2
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya nnyun91@gmail.com
ABSTRAK
Uwi ungu (Dioscorea alata L.) merupakan famili Dioscoreaceae yang mengandung diosgenin yang diketahui bermanfaat sebagai agen imunomodulator. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya perubahan kuantitas sel B220+IgE+ pada organ lymph node mencit BALB/c model alergi pencernaan pasca pemberian ekstrak etanol umbi uwi ungu dan dosis optimum ekstrak etanol umbi uwi ungu. Pemberian ekstrak etanol umbi uwi ungu dilakukan pada hari ke 1-28. Hari ke-15 dilakukan injeksi ovalbumin (OVA) secara intraperitoneal. Kemudian 3 hari setelah injeksi OVA mencit dibedah. Hari ke-22 dilakukan challenge OVA secara intraperitoneal. Hari ke-23 sampai 28 mencit dilakukan injeksi OVA kembali secara oral. Kemudian dilakukan pembedahan pada hari ke-29. Limfosit diisolasi pada organ lymph node dan dilihat profil sel B220+ dan B220+IgE+ melalui analisis flow cytometry. Data dianalisis menggunakan One-way ANOVA (p<0,05) dan uji Tukey menggunakan SPSS 16 for Windows. Jumlah sel B220+IgE+ menurun signifikan pada dosis 0,167 g/kg BB dibandingkan pada dosis 2,008 g/kg BB dan 10,039 g/kg BB. Variasi dosis ekstrak etanol umbi uwi ungu berbeda secara signifikan. Ekstrak etanol umbi uwi ungu (Dioscorea alata L.) mampu menurunkan jumlah relatif sel B220+IgE+ pada dosis 0,167 g/kg BB. Dosis optimum untuk menurunkan level B220+IgE+ adalah pada dosis rendah yaitu 0,167 g/kg BB.
Kata kunci : Alergi pencernaan, B220+IgE+, Dioscorea alata L., immunomodulator
ABSTRACT
Purple yam tuber (Dioscorea alata L.) is a family Dioscoreaceae that contain diosgenin which is known as an immunomodulatory agent. The purpose of this study is to understand about the quantitative changes of B220+ and B220+IgE+ cells in lymphnode BALB/c mice digestive allergy model after ethanol extract in purple yam tuber oral treatment and the optimum dose of purple yam tuber ethanol extract. The ethanol extract of purple yam tuber treatment conducted on 1st until 28th days. Then, on 15th day is conducted OVA injection intraperitoneally. After 3 days injection of OVA, 3 mice for each treatment were sectioned. OVA challenge injection intraperitoneally conducted on 22th days. OVA is injected orally on 23th until 28th days. Then, the mice were sectioned on 29th day. Lymphocytes was isolated from lymphnode organs and the profiles of T B220+ and B220+IgE+ cells were observed through flowcytometry analysis. The hepar was isolated to make the histopathology analysis. Data were analyzed using One-way ANOVA (p <0.05) and Tukey test using SPSS 16 for Windows. Ethanol extract of purple yam tuber can reduced B220+IgE+. The result indicated an decreasing number of B220+IgE+ in dose 0.167 g/kg BW significantly compared with dose 2.008 g/kg BW and 10,039 g/kg BW. Dose variations in extract ethanol of purple yam tuber are significant and the optimum dose of purple yam ethanol extract to reduce the level of B220+IgE+ is 0.167 g/kg BW.
Keywords : B220+IgE+, Digestive allergy, Dioscorea alata L., , immunomodulatory PENDAHULUAN
Indonesia memiliki kekayaaan tumbuh-tumbuhan yang berpotensi dijadikan sebagai tanaman herbal. Tanaman herbal pada saat ini telah menjadi alternatif untuk mengobati berbagai penyakit. Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai tanaman herbal dan belum dimanfaatkan
secara optimal adalah uwi ungu (Dioscorea alata L.). Uwi ungu merupakan sumber hayati umbi-umbian yang mengandung karbohidrat, senyawa fenol, dan antosianin [1]. D. alata juga mengandung diosgenin yang merupakan jenis saponin yang mirip dengan kolesterol, progesteron dan DHEA (dehidroepiandrosteron) [2].
Berdasarkan beberapa penelitian, saponin ini bermanfaat bagi kesehatan antara lain aktivitas hipokolesterolemia, imunostimulatori, antitumoro-genik, antimutaantitumoro-genik, imunomodulatori dan antiinflamasi [3]. Hasil analisis menunjukkan kandungan dalam umbi uwi ungu terdiri dari air 89,73 %, abu 0,62 %, abu tak larut asam 0,55 %, kadar serat 0,67 %, pati 10,93 %, lemak 0,82 %, dan protein 1,36 % [4].
Salah satu peran dari umbi uwi ungu yang belum diketahui adalah aktivitasnya sebagai agen antialergi. Reaksi alergi terjadi jika seseorang terpapar alergen sehingga memproduksi antibodi IgE (Immunoglobulin E) kemudian terpapar kembali oleh antigen yang sama. Alergen memicu terjadinya aktivasi sel mast yang mengikat IgE pada jaringan. IgE merupakan antibodi yang sering terlihat pada reaksi melawan parasit, terutama untuk melawan cacing parasit yang umumnya mewabah pada negara yang masih terbelakang [5]. Alergi atau hipersensitivitas merupakan sensitivitas yang terlalu tinggi terhadap antigen sehingga paparan antigen yang selanjutnya akan menimbulkan respon imun yang berlebihan. Dalam keadaan normal terjadi keseimbangan antara Th1 dan Th2, tetapi dalam keadaan alergi akan terjadi peningkatan Th2 dan penurunan Th. Reaksi alergi melibatkan antibodi spesifik IgE yang bertindak sebagai mediator respon alergi seperti alergi makanan, asma, rhinitis, dan lain-lain [6].
Berdasarkan penelitian sebelumnya diketahui bahwa kandungan diosgenin D. alata ini memiliki fungsi menangkap reaktif oksigen spesies (ROS), antioksidan, antidiabetik, antiklastogenik, antiosteoporotik. Pemberian diosgenin ini dapat mengurangi ekspresi IL-4 dan GATA-3 intestinal pada mencit Balb/C yang disensitisasi ovalbumin [2]. Penelitian tentang sifat antialergi Dioscorea alata sampai sejauh ini belum dilakukan. Oleh karena itu, penelitian ini penting untuk dilakukan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol dalam umbi uwi ungu (Dioscorea alata) ini pada mencit BALB/c model alergi pencernaan berdasarkan perubahan kuantitas sel B220+ dan B220+IgE+.
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat. Penelitian ini
dilakukan pada Mei 2013 sampai Januari 2014 di laboratorium Fisiologi Hewan, Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya , Malang.
Pembuatan Ekstrak Etanol Umbi Uwi Ungu. Umbi Dioscorea alata disiapkan sebanyak 20,7 kg, dikuliti, dicuci bersih, dipotong tipis, kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari dan ditutup dengan kain hitam hingga kering. Umbi yang kering dihaluskan dengan blender. Simplisia ditimbang kemudian dimaserasi berkali-kali dalam toples kaca dengan pelarut etanol 70 % dengan perbandingan simplisia : etanol 70 % = 1:10 pada suhu ruangan selama 5x24 jam dengan volume etanol 70 % adalah 75 % dari volume totalnya, sambil diaduk 3 kali sehari sampai semua komponen terekstrasi. Setelah 5x24 jam, ekstrak etanol disaring dengan kain saring dan ditampung pada toples kaca. Sisa bahan penyaringan direndam lagi dengan etanol 70 % (remaserasi) selama 2x24 jam dengan sisa 25 % volume etanol 70 %. Setelah remaserasi, bahan disaring lagi dan hasilnya digabung dengan bahan yang sebelumnya sudah disaring. Bahan yang sudah disaring kemudian diuapkan untuk menghilangkan kandungan etanol dalam bahan ekstrak pada suhu 50oC dalam water bath menggunakan vacuum pump evaporator. Hasil penguapan berupa ekstrak kental yang ditimbang dan dicatat berapa gram hasilnya.
Rancangan Penelitian. Penelitian ini menggunakan mencit BALB/c jantan sebanyak 30 ekor yang berumur 3 bulan dengan berat 25-27 g. Mencit dibagi dalam 5 kelompok perlakuan dengan masing-masing kelompok sebanyak 6 mencit. Perlakuan dibagi menjadi 5 yaitu kontrol negatif (K(-)), kontrol positif (OVA), uwi dosis 0,167 g/kg BB (U1), uwi dosis 2,008 g/kg BB (U1) dan uwi dosis 10,039 g/kg BB (U1).Mencit disensitisasi dan dichallenge secara intraperitoneal dengan ovalbumin (OVA) kecuali pada kelompok kontrol (K(-)). Mencit diimunisasi dengan cara injeksi intraperitoneal pada hari ke-15 dengan 0,15 ml OVA dalam Al(OH)3. Pada hari ke-22 injeksi intraperitoneal dengan 0,15 ml OVA dalam akuades. Pada hari ke-23 sampai dengan hari ke-28 mencit dibooster dengan OVA secara oral dengan 0,15 ml OVA dalam akuades.
Isolasi Sel Limfosit. Mencit dikorbankan setelah 24 jam dari pemaparan OVA yang terakhir. Pembedahan dilakukan dengan cara dislokasi leher. Kemudian organ lymph node diisolasi dan dicuci dengan PBS 2 kali. Setelah itu organ dipencet searah jarum jam dengan menggunakan
pangkal spuit. Setelah itu disaring dengan wire. Homogenat yang bercampur PBS dimasukkan dalam tabung propilen 15 ml dan ditambahkan PBS sampai volumenya mencapai 10 ml. Kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 2500 rpm, 4oC selama 5 menit. Supernatan dibuang sedangkan pellet diambil dan diresuspensi dengan PBS 1 ml lalu dihomogenasi.
Perhitungan Sel Limfosit Menggunakan
Haemocytometer. Suspensi pellet dari hasil isolasi
limfosit pada lymphnode diambil sebanyak 5 µl untuk perhitungan sel limfosit. Suspensi pellet ditambahkan 95 µl Evans Blue kemudian dihomogenkan. Perhitungan sel hidup dilakukan dengan menggunakan kamar hitung dalam haemocytometer dan hasil perhitungan digunakan untuk analisis flow cytometry.
Analisis Flow Cytometry. Suspensi pelet sebanyak 50 µl ditambahkan 500 µl PBS. Suspensi selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm, 4oC selama 5 menit. Pelet kemudian ditambah 500 µl PBS dan diambil masing-masing 50 µl ke dalam tabung eppendorf. 50 µl homogenate dimasukkan dalam tabung eppendorf dan ditambahkan 20 µl cytofix-cytoferm lalu dipipeting dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 4oC. Lalu ditambahkan washsperm sebanyak 500 µl. Setelah itu, disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm, suhu 4oC selama 5 menit dan dilanjutkan dengan prosedur pewarnaan dengan antibodi PE-conjugated anti-B220. Sampel tersebut kemudian ditambah 1 ml PBS dan ditempatkan pada kuvet flow cytometer. Flow cytometer akan menghitung jumlah sel total serta jumlah sel yang terdeteksi oleh label antibody, kemudian hasil yang diperoleh diolah dengan program BD cellquest Pro TM.
Analisis Statistika. Data dianalisis dengan menggunakan SPSS 16.0 for Windows. One Way ANOVA digunakan untuk mengetahui perbedaan pada antar perlakuan (p<0,05 secara statistik berbeda nyata). Apabila diperoleh hasil yang signifikan maka dilakukan uji Tukey.
HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis Jumlah Relatif Sel B220+IgE+ pada organ Lymph Node.
Hasil analisis jumlah relatif sel B220+IgE+ menunjukkan perbedaan yang signifikan dari
masing-masing perlakuan. Kelompok mencit yang terkena alergi pencernaan (OVA) menunjukkan jumlah relatif sel B220+IgE+ terbesar sebesar 41,33 % dibandingkan dengan mencit normal sebesar 11,33 %. Peningkatan jumlah sel B220+IgE+ pada mencit alergi pencernaan dikarenakan meningkatnya jumlah subset sel T CD4+ yang menghasilkan sitokin IL-4. Akibat meningkatnya jumlah IL-4 maka akan mengaktifkan sel B220 untuk membentuk immunoglobulin E. IgE kemudian akan berikatan dengan sel mast dan akhirnya terbentuk respon imun terhadap alergi pencernaan.
Gambar 1. Jumlah relatif B220+IgE+ setelah injeksi peroral 0,15 ml OVA dalam akuades pada hari ke 23-28 (p<0,05) (U1= dosis 0,167 g/kg BB, U2= dosis 2,008 g/kg BB, U3= dosis 10,039 g/kg BB, K(-) = kontrol tanpa perlakuan, OVA= kontrol positif.
Pemberian ekstrak etanol umbi uwi ungu dosis 0,167 g/kg BB mampu menurunkan jumlah sel B yang mengekspresikan IgE secara signifikan (p>0,05) sebesar 1,97 % dibandingkan mencit yang diberi ekstrak etanol dosis 2,008 g/kg bb sebesar 33,75 %. Dosis 10,039 g/kg bb menurunkan level B220+IgE+ sebesar 13,06 %. Hal ini menandakan bahwa pada dosis rendah, ekstrak etanol umbi uwi ungu dapat menurunkan jumlah sel B yang mengekspresikan IgE. Menurut Huang dkk. (2009), pemberian diosgenin pada mencit yang terkena alergi pencernaan dapat menurunkan jumlah total IgE yang terbentuk. Sebaliknya, level IgG2a mengalami kenaikan akibat pemberian diosgenin pada mencit yang disensitisasi OVA [2]. Hasil penelitian tersebut menujukkan bahwa secara in vivo, diosgenin pada umbi uwi ungu memiliki efek anti-alergi yang dibuktikan dengan adanya supresi produksi IgE.
Gambar 2. Persentase jumlah relatif sel B220+IgE+ pada masing
perlakuan setelah injeksi per oral OVA hari ke 23-28
IgE diproduksi oleh sel plasma yang terletak pada lymph node dan daerah yang mengalami reaksi alergi, yaitu
senter pada jaringan yang mengalami inflamasi. IgE berbeda dengan antibodi yang lain dalam hal lokasinya. IgE sebagian besar menempati jaringan dan berikatan dengan permukaan sel
reseptornya yang disebut FcεRI. Ikatan antigen dengan IgE menyebabkan terjadinya penggabungan silang antar reseptor yang berakibat tersekresinya mediator kimia dari sel Mekanisme ini menyebabkan terjadinya hipersensitif tipe I. Basofil dan eosinofil yang teraktivasi juga mengekspresikan Fc sehinggadua macam sel tersebut juga dapat mengikat IgE dan berkontribusi pada munculnya reaksi hipersensitif tipe I. Antigen yang secara khusus dapat mempengaruhi Th
membelokkan sintesis antibodi menjadi IgE disebut alergen. Produksi ant
memerlukan bantuan Th2 yang mensekresi IL dan IL-13. Peran Th2 dapat dihambat oleh Th
Persentase jumlah relatif sel pada masing-masing perlakuan setelah injeksi per oral
IgE diproduksi oleh sel plasma yang dan daerah yang mengalami reaksi alergi, yaitu pada germinal senter pada jaringan yang mengalami inflamasi. IgE berbeda dengan antibodi yang lain dalam hal lokasinya. IgE sebagian besar menempati jaringan dan berikatan dengan permukaan sel mast dengan
εRI. Ikatan antigen gan IgE menyebabkan terjadinya penggabungan silang antar reseptor yang berakibat tersekresinya mediator kimia dari sel mast. Mekanisme ini menyebabkan terjadinya hipersensitif tipe I. Basofil dan eosinofil yang teraktivasi juga mengekspresikan FcεR adua macam sel tersebut juga dapat mengikat IgE dan berkontribusi pada munculnya reaksi hipersensitif tipe I. Antigen yang secara mempengaruhi Th2 untuk membelokkan sintesis antibodi menjadi IgE Produksi antibodi IgE 2 yang mensekresi IL-4 Peran Th2 dapat dihambat oleh Th1
yang memproduksi interferon antigen pada dosis yang sangat memungkinkan terjadinya aktivasi Th menyebabkan aktivasi TH1 [5]
Gambar 3. Perbedaan berat badan mencit tiap perlakuan selama 28 hari
Berdasarkan grafik perbedaan berat badan pada gambar 3 menunjukkan bahwa mencit sehat memiliki berat badan paling tinggi dibandingkan dengan mencit yang diberi perlakuan. Perlak mencit alergi pencernaan
berat badan karena adanya reaksi pertahanan tubuh terhadap masuknya antigen ke tubuh. Sedangkan pada perlakuan ekstrak umbi uwi ungu jugan mengalami penurunan berat badan seiring dengan bertambahnya hari dalam injeksi OVA. Secara umum pada hari terakhir injeksi, mencit alergi pencernaan yang diberi ekstrak etanol umbi uwi ungu relative stabil dan tidak mengalami kenaikan dan penurunan. Diosgenin juga dapat menaikkan berat badan, berat limpa, dan berat kelenja
pada tikus betina putih dewasa yang diovariektomi selama 45 hari [7].
Reaksi alergi terjadi melal
aktivasi sel-sel imunokompeten, aktivasi s struktural, aktivasi sel-sel mast, eosinofil dan basofil, reaksi mediator dengan targ
tahap timbulnya gejala. Alergen yang berhasil masuk tubuh akan diproses oleh APC. Peptida alergen yang dipresentasikan oleh APC menginduksi aktivasi Limfosit T. Aktivasi Limfosit T oleh APC yang memproses alerg akan mengaktivasi limfosit Th
memproduksi
sitokin-specialized pattern recognition receptors yaitu Toll-like receptors
dendritik (DCs) atas respons imun
menentukan respons imun adaptif Th1, Treg atau si interferon-γ (IFN-γ). Presentasi antigen pada dosis yang sangat rendah akan ungkinkan terjadinya aktivasi Th2 dan tidak
1 [5].
. Perbedaan berat badan mencit tiap selama 28 hari
Berdasarkan grafik perbedaan berat badan pada gambar 3 menunjukkan bahwa mencit sehat memiliki berat badan paling tinggi dibandingkan dengan mencit yang diberi perlakuan. Perlakuan mencit alergi pencernaan mengalami penurunan berat badan karena adanya reaksi pertahanan tubuh terhadap masuknya antigen ke tubuh. Sedangkan pada perlakuan ekstrak umbi uwi ungu jugan mengalami penurunan berat badan seiring dengan am injeksi OVA. Secara umum pada hari terakhir injeksi, mencit alergi pencernaan yang diberi ekstrak etanol umbi uwi ungu relative stabil dan tidak mengalami kenaikan Diosgenin juga dapat menaikkan berat badan, berat limpa, dan berat kelenjar adrenal pada tikus betina putih dewasa yang diovariektomi Reaksi alergi terjadi melalui tahap-tahap imunokompeten, aktivasi sel-sel sel mast, eosinofil dan basofil, reaksi mediator dengan target organ dan tahap timbulnya gejala. Alergen yang berhasil masuk tubuh akan diproses oleh APC. Peptida alergen yang dipresentasikan oleh APC menginduksi aktivasi Limfosit T. Aktivasi Limfosit T oleh APC yang memproses alergen akan mengaktivasi limfosit Th2 untuk -sitokinnya. Kontrol pattern recognition receptors (PRRs) like receptors (TLR) dari sel-sel dendritik (DCs) atas respons imun innate n adaptif Th1, Treg atau
Th2. Limfosit Th1 memproduksi IL-2, IFN-γ dan TNF-α, sedangkan Limfosit Th2 memproduksi IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, dan GM-CSF [8].
Limfosit Th yang baru diaktifkan alergen akan berfenotip Th2. Produksi sitokin Th2 terutama IL-4 akan mensupresi perkembangan Th1 dan produksi sitokin Th1 terutama TNF akan mensupresi perkembangan Th2. Bila sitokin yang dihasilkan Limfosit Th2 berinteraksi dengan Limfosit B, maka Limfosit B akan berdiferensiasi menjadi sel plasma yang memproduksi IgE. Sitokin yang dihasilkan Th2 menstimulasi produksi sel mast, basofil dan eosinofil. Interaksi antara alergen, sel mast dan IgE menghasilkan degranulasi sel mast [9].
Degranulasi sel mast melepaskan mediator histamin. Histamin yang dilepaskan sel mast ditangkap reseptor histamin di target organ. Bila terjadi interaksi histamin dengan reseptornya pada target organ, maka reaksi alergi akan terjadi. Reseptor H1-histamin mempunyai peran yang lebih luas dalam proses radang daripada sekedar mediator yang menyebabkan alergi. Reseptor H2-histamin mempunyai peran dalam terjadinya rasa gatal dan nyeri pada kulit serta peningkatan permeabilitas dan vasodilatasi perifer. Sedangkan reseptor H3-histamin meningkatan pelepasan neurotransmitter seperti histamine, norepinephrine, asetilkolin, peptide dan 5-hidroksitriptamin [10].
KESIMPULAN
Ekstrak etanol umbi uwi ungu (Dioscorea alata L.) mampu menurunkan jumlah relatif sel B220+IgE+ pada dosis 0,167 g/kg BB. Dosis optimum untuk menurunkan level B220+IgE+ adalah pada dosis rendah yaitu 0,167 g/kg BB.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Muhaimin Rifa'i S.Si, Ph.D.Med.Sc. sebagai pembimbing penelitian ini dan Ibu Sri Nabawiyati Nurul Makkiyah yang mendanai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
[1] Peter, K.V. 2007. Underutilized and Underexploited Holticultural Crops. Jai Bharat Printing Press. New Delhi.
[2] Huang, C,H., Ku, C.Y. dan Jan, T.R. 2009. Diosgenin attenuates allergen-induced intestinal inflammation and IgE production
in a murine model of food allergy. Planta Med. 75 (2):1300-1305.
[3] Huang, C,H., Ku, C.Y. dan Jan, T.R. 2010. Diosgenin, a plant-derived sapogenin, enhances regulatory T-cell immunity in the intestine of mice with food allergy. J. Nat Prod. 73 : 1033-1037.
[4] Lubag, A. 2008. Antioxidants of purple and greater yam (Dioscorea alata L.) varieties from the Philippinesmore. Philippine J of Sci. 137(1):61-67.
[5] Rifa’i, M. 2011. Alergi dan Hipersensitif. Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam. Universitas Brawijaya. Malang.
[6] Roitt, I.M. 2003. Essential Immunology. Blackwell Science Limited. Oxford.
[7] Benghuzzi, H., Tucci, M., Eckie, R., dan Hughes, J. 2003. The effects of sustained delivery of diosgenin on the adrenal gland of female rats. J Biomed Sci Instrum. 39 : 335-340.
[8] Sampson, H.A. 2004. Update on food allergy. J Allergy Clin Immunol. 113 (5) : 805-819. [9] Palomares, O., Yaman, G., Azkur, A.K.,
Akkoc, T., Akdis, M., dan Akdis, C.A. 2010. Role of Treg in immune regulation of allergic disease. J Immunol. 40:1232-1240. [10] Taylor, A., Verhagen, J., Akdis, C.A., dan
Akdis, M. 2004. T regulatory cells in allergy and health : a question of allergen specificity and balance. Int Arch Allergy and Immunol. 135 : 73-82.
