OPTIMASI DAN VALIDASI IDENTIFIKASI SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNPs) GEN PRKAA2 rs857148 MENGGUNAKAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION RESTRICTION-FRAGMENT
LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Advenia Larassati NIM : 188114152
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2022
OPTIMASI DAN VALIDASI IDENTIFIKASI SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNPs) GEN PRKAA2 rs857148 MENGGUNAKAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION RESTRICTION-FRAGMENT
LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Advenia Larassati NIM : 188114152
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2022
ii
Persetujuan Pembimbing
OPTIMASI DAN VALIDASI IDENTIFIKASI SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNPs) GEN PRKAA2 rs857148 MENGGUNAKAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT
LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP)
Skripsi yang diajukan oleh:
Advenia Larassati NIM : 188114152
telah disetujui oleh
Pembimbing
Dr. apt. Christine Patramurti Tanggal 27 April 2022
iii
Pengesahan Skripsi Berjudul
OPTIMASI DAN VALIDASI IDENTIFIKASI SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNPS) GEN PRKAA2 rs857148 MENGGUNAKAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT
LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP)
Oleh:
Advenia Larassati NIM : 188114152
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma pada tanggal: 25 Mei 2022
Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Dekan
Dr. apt. Yustina Sri Hartini
Panitia Penguji : Tanda tangan 1. Dr. apt. Christine Patramurti ..………
2. Dr. apt. Dita Maria Virginia, M.Sc. ..………
3. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. ..………
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 27 April 2022 Penulis,
Advenia Larassati
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Advenia Larassati
Nomor Mahasiswa : 188114152
Dengan pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
Optimasi dan Validasi Identifikasi Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Gen PRKAA2 rs857148 Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction-
Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.
Atas kemajuan teknologi informasi, saya tidak berkeberatan jika nama, tanda tangan, gambar atau image yang ada di dalam karya ilmiah saya terindeks oleh mesin pencari (search engine), misalnya google.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 20 Juni 2022
Yang menyatakan
Advenia Larassati
vi ABSTRAK
Gen PRKAA2 merupakan gen yang menyandi enzim AMPKα2. Salah satu Reference SNPs gen PRKAA2, yaitu rs857148 di daerah 3’UTR yang berpengaruh terhadap kemampuan enzim AMPKα2 untuk melakukan fosforilasi dalam aktivasi enzim AMPK. Tujuan dari penelitian ini, yaitu untuk mengetahui kondisi optimum metode PCR berdasarkan parameter suhu annealing dan konsentrasi primer, mengetahui produk PCR yang menggunakan kondisi optimum dapat memenuhi parameter validasi metode, yaitu reprodusibilitas dan spesifisitas, kemudian mengetahui hasil identifikasi SNPs gen PRKAA2 rs857148. Variasi suhu annealing yang akan dioptimasi, yaitu 55; 56,1; 57,9; 60,7; 64; 67; 68,9; dan 70℃.
Konsentrasi primer yang dioptimasi pada penelitian ini, yaitu 2;2,5;3; dan 3,5 μM.
Identifikasi SNPs gen PRKAA2 rs857148 menggunakan metode PCR-RFLP dengan ditambahkan enzim restriksi BsuRI. Kondisi optimum metode PCR yang diperoleh, yaitu suhu annealing 56,1℃ dan konsentrasi primer 3 μM. Band DNA yang diperoleh menggunakan kondisi optimum ini, yaitu tunggal, jelas, dan sesuai ukuran target (369 bp). Hasil visualisasi produk PCR menggunakan isolat DNA yang berbeda menghasilkan ukuran band yang sama, yaitu 369 bp sehingga memenuhi parameter reprodusibilitas. Hasil analisis primer Nucleotide-BLAST menunjukkan kesamaan, yaitu 100% sehingga telah memenuhi parameter spesifisitas. Adapun hasil identifikasi SNPs yang didapatkan, yaitu terdapat fragmen DNA yang membentuk homozigot wildtype, homozigot mutan, dan heterozigot.
Kata kunci : PRKAA2, SNPs, PCR-RFLP, optimasi, validasi
vii ABSTRACT
PRKAA2 is a gene that encodes AMPKα2 enzyme. One of the reference SNPs in PRKAA2 gene is rs857148 its location in 3'UTR could affect the ability of AMPKα2 to phosphorylate AMPK enzyme. This study aims to known the optimum conditions of PCR method based on the annealing temperature and primer concentration, determine PCR product that use optimum conditions could fulfill reproducibility and specificity parameter, determine identification of SNPs PRKAA2 rs857148 gene. Annealing temperature variations in this study were 55;
56,1; 57,9; 60,7; 64; 67; 68,9; and 70℃. Primer concentrations optimized in this study were 2; 2,5; 3; and 3,5 μM. SNPs of PRKAA2 rs857148 gene identified by PCR-RFLP method with restriction enzyme BsuRI. The results of optimum conditions for the PCR were temperature annealing (56,1℃) and primer concentration (3 μM). DNA bands obtained were single, clear, and the length of PCR product was also suitable (369 bp). Visualization of PCR products using different DNA isolates resulted the same length of PCR product is 369 bp which fulfills reproducibility parameters. Nucleotide-BLAST tools were used to check primer specificity. After being analyzed, it has 100% similarity with human genome PRKAA2. SNPs PRKAA2 rs857148 were found in wildtype homozygous, mutant homozygous, and heterozygous.
Keywords : PRKAA2, SNPs, PCR-RFLP, optimization, validation
viii DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI... v
ABSTRAK… ... vi
ABSTRACT… ... vii
DAFTAR ISI ... viii
DAFTAR TABEL ... x
DAFTAR GAMBAR ... xi
DAFTAR LAMPIRAN ... xii
BAB I. PENDAHULUAN ... 1
A. Latar Belakang ... 1
B. Rumusan Masalah ... 3
C. Keaslian Penelitian ... 3
D. Tujuan Penelitian ... 5
E. Manfaat Penelitian ... 5
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... 7
A. Mekanisme Terapi Metformin ... 7
B. Enzim Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase (AMPK) ... 7
C. Gen PRKAA2 ... 10
D. Desain Primer Metode PCR ... 11
E. Metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) ... 12
F. Enzim Restriksi ... 14
G. Landasan Teori ... 15
H. Hipotesis ... 16
BAB III. METODE PENELITIAN... 17
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 17
B. Variabel Penelitian ... 17
C. Definisi Operasional ... 17
D. Bahan Penelitian ... 18
E. Alat Penelitian ... 18
F. Tata Cara Penelitian ... 19
G. Analisis Hasil ... 23
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 24
A. Analisis Kualitatif Isolat DNA ... 24
B. Optimasi Kondisi PCR Gen PRKAA2 rs857148 ... 25
C. Validasi metode PCR ... 29
D. Pemotongan Produk PCR menggunakan Metode PCR-RFLP ... 31
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 36
A. Kesimpulan ... 36
B. Saran….. ... 36
ix
DAFTAR PUSTAKA ... 37 LAMPIRAN. ... 44 BIOGRAFI PENULIS ... 54
x
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel I. Pengaruh SNPs pada gen PRKAA2... 10 Tabel II. Komposisi PCR mixture ... 20
xi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA ... 25
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen gen PRKAA2 ... 26
Gambar 3. Hasil Optimasi Suhu Annealing Gen PRKAA2 rs857148 ... 27
Gambar 4. Hasil Optimasi Konsentrasi Primer Gen PRKAA2 rs857148 ... 29
Gambar 5. Hasil Nucleotide-BLAST Primer Gen PRKAA2 rs857148 ... 30
Gambar 6. Hasil Validasi Metode PCR ... 31
Gambar 7. Situs Pengenalan Enzim BsuRI pada Sekuen Gen PRKAA2 rs857148 ... 32
Gambar 8. Ukuran Fragmen DNA yang direstriksi oleh Enzim BsuRI ... 33
Gambar 9. Hasil Pemotongan Produk PCR menggunakan Enzim BsuRI ... 34
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian ... 45
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis ... 46
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix ... 47
Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladders and Markers ... 48
Lampiran 5. Informasi Primer Gen PRKAA2 rs857148 ... 49
Lampiran 6. Informasi Enzim Restriksi BsuRI ... 50
Lampiran 7. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA ... 51
Lampiran 8. Hasil Optimasi Suhu Annealing Gen PRKAA2 rs857148 ... 51
Lampiran 9. Hasil Optimasi Konsentrasi Primer Gen PRKAA2 rs857148 ... 51
Lampiran 10. Hasil Validasi Metode PCR ... 52
Lampiran 11. Hasil Pemotongan Produk PCR Menggunakan Enzim BsuRI... 52
Lampiran 12. Perhitungan Konsentrasi Primer ... 52
Lampiran 13. Perhitungan Konsentrasi Buffer TBE 1x ... 53
Lampiran 14. Analisis Spesifisitas Primer Gen PRKAA2 rs857148 ... 53
1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang
Metformin digunakan sebagai terapi pilihan pertama pada pasien Diabetes Melitus tipe 2. Metformin direkomendasikan dengan mempertimbangkan efek yang menguntungkan pada berat badan, risiko rendah mengalami Hipoglikemia, dan biaya yang rendah (International Diabetes Federation, 2012). Metformin memiliki profil keamanan dan efikasi yang baik serta dapat menurunkan kejadian kardiovaskular (Schlender et al., 2017). Mekanisme aksi dari Metformin, yaitu menurunkan produksi glukosa dengan menghambat hepatik glukoneogenesis kemudian mengaktivasi enzim AMPK (Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase) sehingga dapat meningkatkan kontrol glikemik pada pasien DM tipe 2 (Kinaan, Ding, and Triggle, 2015).
AMPK (Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase) merupakan suatu enzim yang mengatur metabolisme energi di seluruh tubuh. Aktivasi AMPK merangsang pembentukan energi serta menghambat penggunaan energi pada beberapa jaringan, yaitu otot, jantung, hipotalamus, hati, adiposa, dan pankreas (Coughlan, Valentine, Ruderman, and Saha, 2014). AMPK memiliki 3 subunit, yaitu α, β, dan γ (Hardie, Ross, and Hawley, 2012). Subunit α merupakan enzim katalitis yang bertanggung jawab untuk mentransfer fosfat dari ATP ke protein target (Ke et al., 2018). Subunit α memiliki 2 isoform, yaitu α1 dan α2 (Li et al., 2018). AMPKα2 (AMP-activated protein kinase subunit alpha 2) merupakan enzim yang mengatur metabolisme glukosa dan lipid, enzim ini memiliki jumlah yang banyak, yaitu sekitar 80% dibandingkan dengan subunit lainnya serta banyak terdistribusi di jaringan otot skeletal, jantung, dan hati (Liu and Jiang, 2013).
Gen PRKAA2 merupakan gen yang menyandi enzim AMPKα2 dan terdapat pada kromosom 1p32.2 serta memiliki Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) pada rs10789038, rs2796498, dan rs2746342 (Li et al., 2018), adanya SNPs pada gen PRKAA2 akan mempengaruhi aktivasi AMPK (Spencer-Jones et al., 2006; Nasykhova et al., 2020). Beberapa penelitian lain melaporkan adanya variasi
genetik pada rs9803799, rs2796498, dan rs2746342 pada pasien diabetes melitus tipe 2 yang akan mempengaruhi efektivitas terapi metformin (Jablonski et al., 2010;
Virginia et al., 2020; Virginia et al., 2021). Tang et al., (2011) melakukan penelitian terkait pengaruh polimorfisme gen, salah satunya yaitu gen PRKAA2 rs857148 pada individu yang memiliki penyakit diabetes atau mengalami obesitas pada pasien kanker pankreas. SNPs gen PRKAA2 pada rs857148 ditandai dengan perubahan basa nukleotida A menjadi C di daerah 3’UTR, frekuensi terjadinya SNPs A>C pada populasi Asia sebesar 60,49% (NCBI, 2022). SNPs pada daerah 3’UTR berpengaruh terhadap stabilitas mRNA dan proses translasi sehingga kemampuan enzim AMPKα2 dalam mengaktivasi enzim AMPK akan menurun (Spencer-Jones et al., 2006; Skeeles et al., 2013). Penelitian mengenai variasi gen PRKAA2 masih banyak dieksplorasi. Oleh karena itu, diperlukan kondisi optimum metode PCR untuk menghasilkan produk PCR yang reprodusibel sehingga dapat digunakan untuk mengidentifikasi SNPs pada gen PRKAA2 terutama pada rs857148.
Salah satu metode PCR yang dapat mengidentifikasi SNPs, yaitu PCR- RFLP. PCR-RFLP merupakan suatu metode yang memperbanyak DNA target menggunakan sepasang primer yang spesifik, kemudian dilakukan pemotongan menggunakan enzim restriksi yang dapat mendigesti dan memotong DNA pada situs tertentu menjadi fragmen-fragmen DNA (Erwanto et al., 2012; Hikmah, Retnoningsih, and Habibah, 2016). Keuntungan metode PCR-RFLP dalam mendeteksi SNPs, yaitu metode ini memiliki reliabilitas yang tinggi karena dapat memotong lokasi spesifik SNPs pada sekuen gen target oleh enzim restriksi sehingga memiliki hasil yang konsisten (Yang et al., 2013). Parameter-parameter yang berpengaruh terhadap produk PCR, yaitu sepasang primer, dNTPs, buffer PCR, MgCl2, dan enzim polimerase DNA. Faktor penting dalam melakukan amplifikasi, yaitu kondisi PCR yang berupa konsentrasi primer dan suhu annealing.
Kondisi PCR yang tidak optimum akan menyebabkan produk PCR menjadi tidak sesuai dengan yang ditargetkan sehingga perlu dilakukan optimasi kondisi PCR untuk mendapatkan produk PCR yang optimal. Pengembangan suatu metode melalui tahapan optimasi dan validasi perlu dilakukan pada suatu penelitian.
Optimasi metode bertujuan untuk memastikan parameter-parameter penting dalam
metode dapat memberikan hasil yang dikehendaki serta meningkatkan efisiensi waktu pengerjaan dan penggunaan bahan. Pada penelitian ini, optimasi dilakukan terhadap suhu annealing dan konsentrasi primer untuk mendapatkan kondisi PCR yang optimum. Validasi metode pada penelitian ini bertujuan untuk memastikan kondisi PCR yang digunakan dapat memberikan hasil produk PCR yang reprodusibel serta memiliki spesifisitas primer yang baik untuk mendukung keberhasilan amplifikasi sekuen gen target (Joko, Kusumandari, and Hartono, 2011; Febriyana, Febrianti, and Sunarno; 2021). Kondisi PCR yang sudah optimal dan valid diharapkan dapat mengidentifikasi terjadinya SNPs yang didigesti menggunakan enzim restriksi.
B. Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian di atas, maka rumusan masalah yang akan diteliti, yaitu:
1. Bagaimana kondisi optimum metode PCR yang digunakan untuk identifikasi SNPs pada gen PRKAA2 rs857148?
2. Bagaimana tingkat kesesuaian spesifisitas primer gen PRKAA2 rs857148 yang digunakan untuk amplifikasi produk PCR?
3. Apakah hasil kondisi optimum metode PCR dapat menghasilkan produk PCR yang reprodusibel?
4. Bagaimana hasil identifikasi SNPs gen PRKAA2 rs857148 dengan metode PCR- RFLP pada produk PCR yang telah menggunakan kondisi optimum metode PCR?
C. Keaslian Penelitian
Terdapat beberapa penelitian terkait identifikasi SNPs gen PRKAA2 yang telah dilakukan oleh peneliti-peneliti sebelumnya, yaitu :
1. Optimisation of Polymerase Chain Reaction Conditions to Amplify D-Loop Region in the Malaysian Mousedeer Genomic DNA oleh Bakar et al., (2017).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum suhu annealing dan konsentrasi primer metode PCR menggunakan DNA T. kanchil dan T. napu.
2. Validation of PCR Method for Mycoplasma Detection in the Yellow Fever- Vaccine Quality Control oleh Ferreira et al., (2016). Penelitian ini bertujuan untuk memastikan metode PCR memiliki kemampuan diagnosis yang cepat dan akurat untuk mendeteksi kontaminasi mikoplasma dalam vaksin YF (Yellow Fever).
3. Body Mass Index and Obesity and Diabetes-Associated Genotypes and Risk for Pancreatic Cancer oleh Tang et al., (2011). Penelitian ini bertujuan untuk melihat pengaruh polimorfisme gen PRKAA2 rs857148 pada individu yang memiliki penyakit diabetes atau mengalami obesitas pada pasien kanker pankreas.
4. Evaluation of PRKAA2 Genetic Variation on Metformin Efficacy as an Initial Therapy Among Drug-Naïve Patients With Type II Diabetes Mellitus oleh Virginia, Wahyuningsih, and Nugrahaningsih (2020). Penelitian ini bertujuan untuk mengamati frekuensi genotipe pada pasien DM tipe 2 di Indonesia yang mendapatkan terapi metformin dan menyelidiki pengaruh variasi genetik PRKAA2 yaitu rs2796498, rs9803799, dan rs2746342 mengenai efikasi Metformin pada pasien DMT2 yang ditentukan oleh penurunan kadar HbA1c.
5. PRKAA2 Variation and the Clinical Characteristics of Patients Newly Diagnosed with Type 2 Diabetes Mellitus in Yogyakarta, Indonesia oleh Virginia, Wahyuningsih, and Nugrahaningsih (2021). Penelitian ini bertujuan untuk menilai hubungan variasi genetik gen PRKAA2 yaitu rs2796498, rs9803799, dan rs2746342 dengan karakteristik klinis pasien yang baru terdiagnosa DM tipe 2.
Berdasarkan hasil penelusuran pustaka, penelitian mengenai “Optimasi dan Validasi Identifikasi Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Gen PRKAA2 rs857148 Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)” belum pernah dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum metode PCR yang digunakan, memastikan kondisi optimum metode PCR dapat menghasilkan produk PCR yang reprodusibel, memastikan primer yang digunakan untuk amplifikasi produk PCR telah memenuhi parameter spesifisitas, dan mengetahui hasil identifikasi SNPs gen
PRKAA2 rs857148 pada produk PCR yang telah menggunakan kondisi optimum metode PCR. Penelitian ini merupakan bagian dari proyek penelitian Kampus Merdeka “Farmakogenetik sebagai Aplikasi Personalisasi Terapi Metformin pada Pasien Diabetes Melitus Tipe 2 dengan Status Perokok”.
D. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum
Mengetahui informasi mengenai kondisi optimum metode PCR dan spesifisitas primer gen PRKAA2 rs857148 sehingga menghasilkan produk PCR yang reprodusibel dan dapat digunakan untuk mengidentifikasi SNPs menggunakan metode PCR-RFLP.
2. Tujuan khusus
a) Mengetahui kondisi optimum metode PCR yang digunakan untuk identifikasi SNPs gen PRKAA2 rs857148.
b) Mengetahui tingkat kesesuaian spesifisitas primer gen PRKAA2 rs857148 yang digunakan untuk amplifikasi sekuen gen target.
c) Mengetahui hasil kondisi optimum metode PCR yang dapat menghasilkan produk PCR reprodusibel.
d) Mengetahui hasil identifikasi SNPs gen PRKAA2 rs857148 dengan metode PCR-RFLP pada produk PCR yang telah menggunakan kondisi optimum metode PCR.
E. Manfaat Penelitian 1. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai pentingnya dilakukan optimasi pada metode PCR serta menganalisis spesifisitas primer yang digunakan untuk menghasilkan produk PCR yang reprodusibel sehingga dapat dilanjutkan untuk melakukan identifikasi SNPs gen PRKAA2 rs857148 menggunakan metode PCR-RFLP.
2. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat menjadi bahan referensi dan dapat berkontribusi pada bidang Farmasi mengenai informasi kondisi optimum
metode PCR sehingga diharapkan dapat mengidentifikasi SNPs gen PRKAA2 pada rs857148 menggunakan metode PCR-RFLP.
7 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA A. Mekanisme Terapi Metformin
Metformin merupakan terapi lini pertama yang paling banyak diresepkan pada penyakit Diabetes Melitus tipe 2. Metformin memiliki efikasi dan toleransi efek samping yang baik (Schlender et al., 2017; Baker et al., 2021). Metformin bekerja dengan menghambat glukoneogenesis dan lipogenesis serta meningkatkan pengambilan glukosa sehingga menyebabkan penurunan kadar glukosa darah dan meningkatkan sensitivitas insulin (Salomo, 2020). Metformin memiliki muatan positif dan bersifat hidrofilik sehingga membutuhkan transporter organik kation (OCT1) untuk masuk ke dalam mitokondria. Setelah masuk ke dalam mitokondria, Metformin akan menghambat loop matriks yang mengandung residu sistein (Cys39) dari subunit ND3 yang berada di wilayah amfipatik kompleks I mitokondria atau enzim NADH:ubiquinone oxireductase sehingga menurunkan oksidasi NADH serta pemompaan proton yang melewati membran mitokondria untuk menghasilkan energi ATP, gradien proton yang berkurang menyebabkan AMP meningkat sehingga memicu aktivasi AMPK (Kim and You, 2017; Vial, Detaile, and Guigas, 2019). AMPK akan menghambat substrat CRTC2 (CREB- regulated transcription coactivator 2) yang berperan dalam ekspresi enzim glukoneogenesis. Enzim ACC (acetyl-CoA carboxylase) merupakan prekursor lipogenesis akan dihambat oleh AMPK sehingga sintesis lipid akan berkurang.
AMPK akan memperbaiki sensitivitas insulin dengan meningkatkan pengambilan glukosa dengan memfosforilasi protein AS160 (TBC1D4) yang berperan dalam pengangkutan glukosa ke dalam otot rangka (Foretz, Guigas, Viollet, 2019;
Salomo, 2020).
B. Enzim Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase (AMPK) Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase (AMPK) merupakan enzim yang berfungsi sebagai pengatur metabolisme utama dalam tubuh yang memiliki subunit katalitik α serta regulator β dan γ (Coughlan et al., 2014).
Mekanisme aktivasi AMPK, yaitu dengan peningkatan AMP. AMP mengalami
peningkatan karena energi ATP menurun yang disebabkan oleh penghambatan rantai transport elektron pada kompleks I atau diketahui sebagai enzim NADH:ubiquinone oxidoreductase yang berperan dalam proses pembentukan ATP, kemudian AMP akan berikatan dengan subunit γ yang membantu fosforilasi pada treonin 172 atau residu asam amino dari AMPKα2, fosforilasi ini dilakukan oleh enzim LKB1 (Liver kinase B1). AMPKα2 (AMP-activated protein kinase subunit alpha 2) merupakan subunit α yang dominan dan berfungsi mengatur metabolisme glukosa dan lipid, enzim ini terdistribusi sekitar 80% pada jaringan otot skeletal, jantung, dan hati (Liu and Jiang, 2013). AMPK yang teraktivasi akan menghambat dengan substrat yang mengatur metabolisme energi pada tubuh antara lain pengambilan glukosa, glukoneogenesis, dan lipogenesis (Garcia and Shaw, 2017).
1. Pengambilan glukosa
Pengambilan glukosa dari darah berperan dalam mempertahankan keadaan homeostasis sel untuk menjaga kadar normal glukosa di dalam darah. Pada keadaan normal, pengambilan glukosa dimediasi oleh insulin, apabila terjadi gangguan insulin, pengambilan glukosa ke dalam otot rangka akan terhambat sehingga dapat menimbulkan terjadinya hiperglikemia dan diabetes (Dzamko and Steinberg, 2009). Enzim AMPK dapat memediasi pengambilan glukosa. AMPK dapat diaktivasi oleh senyawa obat, bahan alam, hormon, dan aktivitas fisik. Mekanisme pengambilan glukosa diawali dengan AMPK mengkatalis reaksi fosforilasi pada protein AS160 (TBC1D4). Protein TBC1D4 akan mengaktivasi protein Rab-GTP yang akan melepaskan vesikel transporter glukosa 4 (GLUT4), GLUT4 akan mengalami translokasi ke permukaan membran plasma lapisan fosfolipid vesikel untuk membawa glukosa agar masuk ke dalam sel otot rangka, selanjutnya glukosa akan diperlukan dalam proses metabolisme glikolisis (Pareira et al., 2017)
2. Glukoneogenesis
Glukoneogenesis merupakan suatu proses mengubah substrat non- karbohidrat seperti laktat, asam amino, dan gliserol menjadi glukosa. Laktat merupakan produk siklus glikolisis anaerob yang akan dikonversi lagi menjadi glukosa. Laktat akan masuk ke dalam mitokondria kemudian mengalami karboksilasi menjadi oksaloasetat oleh enzim piruvat karboksilase (PC).
Oksaloasetat direduksi menjadi malat kemudian masuk ke dalam sitoplasma, malat akan mengalami reoksidasi menjadi oksaloasetat. Oksaloasetat mengalami dekarboksilase dan fosforilasi menjadi phosphoenolpyruvate (PEP) oleh enzim PEP carboxykinase (PEPCK). Phosphoenolpyruvate dikonversi menjadi fructose 1,6 biphosphate kemudian mengalami defosforilasi oleh enzim fructose 1,6- biphosphatase membentuk fructose 6-phosphate yang akan dikonversi menjadi glucose 6-phosphate oleh phosphoglucoisomerase. Glucose 6-phosphate mengalami defosforilasi oleh enzim glucose 6-phosphatase menjadi glukosa.
CREB-regulated transcription coactivator-2 (CRTC2) akan berinteraksi dengan cAMP-response element binding protein (CREB) untuk membantu aktivasi enzim glucose 6-phosphatase dan PEP carboxykinase. Glukoneogenesis terjadi di dalam hati untuk mempertahankan kadar glukosa darah. Proses glukoneogenesis abnormal merupakan salah satu faktor utama dari DM tipe 2 yang menyebabkan metabolisme glukosa di dalam hati menjadi abnormal. Aktivasi AMPK akan membantu mempertahankan kadar glukosa darah yang abnormal dengan menghambat CRTC2 melalui reaksi fosforilasi agar tidak berinteraksi dengan CREB sehingga aktivitas enzim glucose 6-phosphatase dan PEP carboxykinase menjadi berkurang (Dzamko and Steinberg, 2009; Zhang, Yang, Chen, and Su, 2019; Chen et al; 2021).
3. Lipogenesis
Lipogenesis merupakan pembentukan asam lemak (palmitat) yang berasal dari asetil-KoA. Mekanisme lipogenesis diawali dengan sitrat yang merupakan salah satu produk akhir glikolisis dan siklus kreb ditransport ke dalam sitosol kemudian dikatalisis oleh enzim ATP-citrate lyase (ACYL) menjadi asetil-KoA.
Asetil-KoA mengalami karboksilase menjadi malonil-KoA oleh enzim asetil-KoA karboksilase 1 (ACC1) kemudian enzim fatty acid synthase (FAS) mengubah malonil-KoA menjadi asam lemak palmitat. Enzim AMPK berperan untuk menurunkan lipogenesis apabila terjadi akumulasi lipid yang disebabkan oleh peningkatan esterifikasi asam lemak. Pusat regulasi pembentukan asam lemak adalah asetil-KoA karboksilase 1 (ACC1) yang mengubah asetil-KoA menjadi malonil-KoA. AMPK akan melakukan inaktivasi enzim ACC1 dengan reaksi
fosforilasi sehingga sintesis asam lemak akan menurun (Dzamko and Steinberg, 2009; Song, Xiaoli, and Yang, 2018).
C. Gen PRKAA2
Lokasi Gen Protein Kinase AMP-activated Catalytic Subunit Alpha2 (PRKAA2) terdapat pada kromosom 1p32.2 serta diekspresikan di jaringan otot skeletal, hipotalamus, dan hati (Yang et al., 2021; Li et al., 2018). Gen PRKAA2 merupakan gen yang menyandi enzim AMPKα2 sehingga menyebabkan AMPK teraktivasi (Yang et al., 2020). Variasi genetik PRKAA2 berpengaruh terhadap kemampuan aktivasi enzim AMPK (Spencer-Jones et al., 2006). Beberapa penelitian melaporkan bahwa SNPs gen PRKAA2 terdapat pada beberapa Reference SNPs yang ditunjukkan pada tabel berikut.
Tabel I. Pengaruh SNPs pada gen PRKAA2 Reference
SNPs (rs) Pengaruh SNPs Pustaka
rs9803799 Efektivitas Metformin berkurang dalam mengontrol hiperglikemia pada pasien Diabetes Melitus tipe 2.
(Jablonski et al., 2010)
rs857148 Tujuan dari penelitian ini, yaitu untuk melihat perkembangan kanker pankreas akibat variasi gen pada pasien obesitas atau diabetes. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa mutasi dari basa nukleotida A menjadi C meningkatkan risiko kanker pankreas.
(Tang et al., 2011)
rs10789038, rs2796498, dan
rs2796498
SNPs pada rs10789039 dan rs2796598 memiliki hubungan yang signifikan terhadap populasi Cina Han yang rawan terkena diabetes melitus tipe 2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa genotipe GA dan GG pada rs10789038 memiliki kemungkinan menjadi faktor risiko yang dapat meningkatkan suseptibilitas DM tipe 2.
Namun, genotipe GA dan AA pada rs2796498 memiliki kemungkinan sebagai faktor proteksi yang menurunkan suseptibilitas DM tipe 2.
SNPs pada rs2796498 berhubungan dengan kejadian diabetes nefropati.
(Li et al., 2018)
rs2746342 Alel G pada polimorfisme rs2746342 ditemukan berpengaruh secara signifikan dalam meningkatkan risiko DM tipe 2.
(Shen et al., 2016)
Berdasarkan tabel tersebut, adanya SNPs dapat mempengaruhi efektivitas terapi metformin dan terjadi peningkatan terhadap kejadian Diabetes Melitus tipe 2. Salah satu SNPs pada gen PRKAA2, yaitu rs857148 yang mengalami perubahan basa nukleotida Adenin menjadi Sitosin di daerah 3’UTR pada urutan 56709485 (NCBI, 2022). Daerah 3’UTR (3’untranslated region) merupakan bagian yang tidak diterjemahkan dan terletak di hilir urutan pengkodean protein. Daerah 3’UTR berperan dalam stabilisasi dan translasi mRNA. RNA-binding proteins (RBPs) akan mengikat elemen cis 3’UTR untuk memediasi fungsinya. RBP berperan sebagai adaptor yang menghubungkan 3’UTR dengan protein efektor. Stabilisasi mRNA dilakukan dengan penambahan gugus poli(A) (AAUAAA) untuk memediasi translokasi mRNA serta menghindari degradasi oleh 3’exonuclease ke dalam sitoplasma (Jalkanen, Coleman, and Wilusz, 2014; Mayr, 2017).
D. Desain Primer Metode PCR
Amplifikasi DNA target dilakukan dengan tiga langkah antara lain denaturasi, annealing, dan ekstensi. Keberhasilan amplifikasi dipengaruhi oleh desain primer. Parameter-parameter yang penting dalam desain primer, yaitu : 1. Panjang primer, berpengaruh terhadap spesifisitas reaksi PCR serta menentukan
suhu annealing primer ke DNA template. Ukuran panjang primer yang optimal, yaitu 18-25 nukleotida.
2. Suhu leleh (Temperature melting) merupakan suhu yang diperlukan primer untuk melepaskan ikatan, temperature melting antara primer forward dan reverse dipastikan semirip mungkin agar memiliki efisiensi yang maksimum.
Temperature melting dapat dihitung dengan rumus : Tm(℃)= 2(A+T) + 4(G+C).
3. Kandungan Guanin dan Sitosin (GC) digunakan untuk menghitung nilai temperature melting dari sekuen target. Kandungan GC pada primer sebaiknya berada pada rentang 40%-60%. Basa GC pada ujung 3’ dari primer dapat membuat hibridisasi lebih stabil. Jumlah basa G atau C lebih dari 3 perlu dihindari pada 5 basa terakhir ujung 3′ karena dapat membentuk struktur dimer yang menyebabkan non-spesific priming (Maddocks and Jenkins, 2017).
E. Metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)
PCR adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro yang melibatkan beberapa siklus. Prinsip dari metode PCR adalah memperbanyak bagian spesifik menggunakan enzim DNA polimerase yang diinisiasi oleh penempelan primer dengan menghubungkan deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) dalam reaksi PCR. Adapun komponen yang dibutuhkan pada proses PCR, yaitu :
1. DNA template berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama.
2. Primer merupakan sepasang oligonukleotida pendek dan beruntai tunggal, berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi sekaligus menyediakan gugus hidroksil (-OH) pada ujung 3’ untuk proses ekstensi DNA.
3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat), dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat).
Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) berfungsi sebagai building block yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA, dNTP akan menempel pada gugus -OH pada ujung 3’ dari primer untuk membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template.
4. Buffer berfungsi untuk menjaga pH dalam kondisi yang sesuai, yaitu antara 8 dan 9,5. Selain buffer PCR, diperlukan ion Mg2+ yang berasal dari MgCl2. MgCl2
bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase.
5. Enzim DNA Polimerase berfungsi sebagai enzim katalis untuk reaksi polimerisasi DNA yang diperlukan untuk tahap ekstensi (Handoyo and Rudiretna, 2001).
Proses PCR merupakan suatu teknik duplikasi DNA target yang melibatkan beberapa siklus yang terdiri dari beberapa tahap, yaitu:
1. Denaturation, yaitu pemisahan untai DNA yang dilakukan pada suhu tertinggi yaitu 94-95 ºC dan dapat dipertahankan oleh enzim selama 30 siklus atau lebih tanpa mengalami kerusakan.
2. Annealing, yaitu tahap penempelan primer pada untai DNA yang sesuai dan dilakukan pada suhu berkisar antara 55-65 ºC tergantung pada urutan primer dan panjangnya. Suhu sangat berpengaruh terhadap proses annealing, apabila suhu terlalu tinggi, maka hasil amplifikasi terlalu rendah. Sebaliknya, suhu annealing yang terlalu rendah akan mengakibatkan amplifikasi segmen DNA yang tidak diinginkan.
3. Extension, yaitu tahap perpanjangan sekuens DNA. Suhu ideal yang digunakan untuk sintesis DNA adalah 72-78 ºC (Ehtisham et al., 2016).
Optimasi metode PCR perlu dilakukan untuk mendapatkan kondisi dan komposisi PCR yang optimal (Yuenleni, 2019). Suhu annealing dan konsentrasi primer merupakan faktor kritis dari kondisi PCR. Suhu annealing merupakan suhu yang diperlukan primer berhasil menempel pada DNA target, suhu annealing yang terlalu rendah dapat menyebabkan terjadinya false priming, sebaliknya jika suhu annealing lebih tinggi dari suhu optimum maka primer tidak dapat menempel pada DNA target (Astriani et al., 2014). Variasi suhu annealing didapatkan dari perhitungan Tm primer forward dan primer reverse dikurangi dan ditambahi 5℃
(Yuenleni, 2019). Primer berperan dalam amplifikasi DNA target sehingga perlu dilakukan optimasi untuk menjamin ketebalan dan kejelasan band DNA (Joko, Kusmandari, and Hartono, 2011). Konsentrasi primer yang terlalu rendah dan tinggi dapat menyebabkan tidak terjadi amplifikasi dan pembentukan primer dimer (Setyawati and Zubaidah, 2021).
Validasi metode analisis merupakan suatu penilaian percobaan di laboratorium terhadap parameter tertentu untuk membuktikan parameter tersebut telah memenuhi persyaratan dalam penggunaan suatu instrumen (Irnawati, Sahumena, and Dewi, 2016). Tujuan validasi metode analisis, yaitu untuk memastikan bahwa semua prosedur pengujian yang akan digunakan dapat mencapai hasil yang diinginkan secara konsisten (Wisudyaningsih, 2012).
Parameter yang harus dipenuhi dalam validasi metode PCR, yaitu spesifisitas dan
reprodusibilitas. Primer dikatakan spesifik apabila proses amplifikasi terjadi pada daerah yang diinginkan sehingga spesifisitas primer merupakan parameter kritis dalam keberhasilan amplifikasi sekuen target (Wasdili, 2019; Ye et al., 2012). Reprodusibilitas (ketertiruan) adalah sebuah parameter acuan analisis yang mampu menunjukkan tingkat presisi suatu hasil pengukuran dari sebuah instrumen untuk menjamin hasil pengujian yang konsisten (Hewajuli and Dharmayanti, 2014;
Sutrisno et al., 2017).
Variasi gen dapat dideteksi menggunakan salah satu jenis metode PCR, yaitu Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). PCR-RFLP merupakan metode perbanyakan/amplifikasi suatu fragmen DNA tertentu menggunakan sepasang primer yang spesifik untuk menghasilkan fragmen DNA target. Hasil amplifikasi tersebut akan didigesti menggunakan enzim restriksi sehingga menghasilkan potongan fragmen yang ukurannya bervariasi tergantung dengan keberadaan situs restriksi. Prinsip dari metode PCR-RFLP, yaitu adanya polimorfik pada sisi pengenal yang spesifik pada masing-masing gen (Erwanto et al., 2012).
Kelebihan dari metode PCR-RFLP, yaitu mudah dan tidak membutuhkan peralatan khusus sedangkan kelemahan metode ini, yaitu hasil amplifikasi tidak dapat dilihat secara langsung namun perlu dianalisis menggunakan elektroforesis serta divisualisasikan menggunakan alat dokumentasi gel kemudian ukuran pita amplikon hanya dibandingkan dengan DNA ladder (Nurwidayati, 2015; Tan et al., 2016).
F. Enzim Restriksi
Enzim restriksi merupakan enzim yang dapat memotong DNA pada sekuen tertentu yang disebut “recognition site” dan dapat mengenali 4-8 pasangan basa (Suriasih, 2015; White et al., 2018). Enzim restriksi berperan mengenali SNPs yang bekerja secara spesifik pada sekuen gen yang dikenali (Latifah, Muarifah, Guntur, and Atik, 2020). Pertimbangan pemilihan enzim restriksi yang perlu diperhatikan, yaitu mengenali situs sekuens DNA tertentu dan jumlah maksimal pemotongan sebanyak tiga kali sehingga memudahkan pengenalan lokasi SNPs pada saat dianalisis menggunakan elektroforesis (Prihandini et al., 2021;
Timbuleng, Kolondam, and Katili, 2021). Enzim restriksi terbagi menjadi 3 tipe, yaitu:
1. Enzim Restriksi Tipe I
Enzim restriksi tipe I memotong sisi DNA yang jauh dari lokasi spesifik. Salah satu contoh enzim restriksi tipe I, yaitu EcoKI. EcoKI merupakan enzim yang berasal dari Escherichia coli yang bekerja dengan metilasi DNA atau translokasi, memotong secara acak, serta dapat menghasilkan ratusan pasangan basa (Kennaway et al., 2009).
2. Enzim Restriksi Tipe II
Enzim restriksi tipe II mengenal urutan spesifik molekul DNA yang akan dipotong. Enzim tertentu akan memotong DNA pada urutan pengenal dan tidak pada tempat lain sehingga menghasilkan fragmen yang sesuai dengan yang diinginkan. Enzim ini biasanya digunakan dalam analisis DNA. Salah satu contoh enzim restriksi tipe II yaitu, BsuRI.
3. Enzim Restriksi Tipe III
Enzim restriksi tipe II merupakan enzim restriksi yang memotong DNA di luar situs pengenalan. Enzim restriksi tipe I dan III hanya memiliki kemampuan terbatas dalam rekayasa genetika sehingga kedua golongan enzim ini jarang digunakan. Contoh enzim restriksi tipe III, yaitu EcoPI, EcoP15I, dan PstII.
Enzim Tipe III mengenali urutan yang pendek dan membelah DNA nonspesifik sebanyak 25-28 nukleotida (Aelst et al., 2010).
G. Landasan Teori
Mekanisme potensial aksi dari Metformin, yaitu aktivasi AMPK. AMPK merupakan enzim yang berfungsi sebagai pengatur metabolisme utama dan memiliki subunit katalitik α serta regulator β dan γ. AMPK diaktivasi melalui fosforilasi Treonin 172 pada subunit AMPKα2, AMPK yang teraktivasi akan menghambat glukoneogenesis dan lipogenesis serta meningkatkan pengambilan glukosa. AMPKα2 (AMP-activated protein kinase subunit alpha 2) merupakan subunit α yang dominan yang berfungsi dalam mengatur metabolisme glukosa dan lipid, enzim ini terdistribusi sekitar 80% di jaringan otot skeletal, jantung, dan hati.
Gen PRKAA2 merupakan gen yang menyandi enzim AMPKα2 serta terdapat pada kromosom 1p32.2. Salah satu SNPs pada gen PRKAA2 adalah rs857148 dimana terjadi perubahan basa nukleotida Adenin menjadi Sitosin pada posisi 56709485 di daerah 3’UTR, SNPs ini akan menyebabkan stabilitas mRNA dan proses translasi menjadi terganggu sehingga mempengaruhi aktivitas enzim AMPKα2.
Variasi gen dapat dideteksi dengan salah satu jenis metode PCR, yaitu Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Hasil amplifikasi akan didigesti menggunakan enzim restriksi sehingga menghasilkan ukuran fragmen DNA yang beragam. Keberhasilan identifikasi SNPs dipengaruhi oleh kondisi PCR yang digunakan dalam amplifikasi sekuen target. Oleh karena itu, optimasi suhu annealing dan konsentrasi primer perlu dilakukan untuk mendapatkan kondisi amplifikasi yang sesuai. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan kondisi optimum yang didapatkan dapat memberikan hasil produk PCR yang reprodusibel serta memiliki tingkat spesifisitas primer yang baik dalam mengamplifikasi sekuen gen target. Kondisi PCR yang sudah optimal dan valid diharapkan dapat mengidentifikasi adanya SNPs yang didigesti oleh enzim restriksi menggunakan metode PCR-RFLP.
H. Hipotesis
Hipotesis yang dirumuskan dalam penelitian ini adalah:
1. Kondisi metode PCR yang digunakan untuk identifikasi Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) gen PRKAA2 rs857148 sudah optimum.
2. Spesifisitas primer gen PRKAA2 rs857148 memiliki tingkat persamaan sebesar 100% dengan database NCBI pada manusia (Homo sapiens).
3. Kondisi optimum metode PCR yang didapatkan mampu menghasilkan produk PCR yang reprodusibel.
4. Hasil identifikasi produk PCR dengan metode PCR-RFLP yang menggunakan kondisi optimum memiliki SNPs gen PRKAA2 rs857148.
17 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis dan rancangan penelitian yang dilakukan adalah observasional deskriptif karena tidak diberikan intervensi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum metode PCR yang memenuhi parameter validasi metode analisis sehingga dapat digunakan untuk melakukan identifikasi Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) gen PRKAA2 rs857148 menggunakan metode PCR-RFLP.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah suhu annealing dan konsentrasi primer.
2. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah produk PCR dengan kondisi optimum yang dideteksi menggunakan elektroforesis sudah reprodusibel serta memiliki tingkat spesifisitas primer yang baik sehingga dapat digunakan untuk mengidentifikasi SNPs gen PRKAA2 rs857148 menggunakan metode PCR- RFLP.
3. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kemurnian isolat DNA, ketepatan primer, dan suhu inkubator pada saat restriksi.
C. Definisi Operasional
1. PRKAA2 adalah gen yang menyandi enzim AMPKα2 terdapat pada kromosom 1p32.2.
2. Suhu annealing adalah suhu yang diperlukan primer untuk menempel pada DNA target.
3. Primer adalah sepasang oligonukleotida pendek dan beruntai tunggal, berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi, sekaligus menyediakan gugus hidroksil (-OH) pada ujung 3’ untuk proses ekstensi DNA.
4. Reprodusibilitas adalah sebuah parameter acuan analisis yang mampu menunjukkan tingkat presisi suatu hasil pengukuran dari sebuah instrumen untuk menjamin hasil pengujian yang konsisten.
5. Spesifisitas primer adalah parameter kritis yang mempengaruhi keberhasilan amplifikasi pada sekuen target yang diinginkan.
6. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) adalah perubahan basa tunggal pada posisi tertentu di dalam suatu genom.
7. Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) adalah metode penandaan DNA yang didasarkan pada perbedaan situs pemotongan. Pemotongan dilakukan menggunakan enzim restriksi yang dapat memotong pada situs restriksi tertentu menjadi fragmen-fragmen dengan ukuran yang bervariasi.
D. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat DNA dari subjek uji Diabetes Melitus tipe 2 di salah satu rumah sakit swasta Yogyakarta yang telah mendapat persetujuan dari Komisi Etik Penelitian bidang Kesehatan Medis, Fakultas Kedokteran, Kesehatan Masyarakat, dan Keperawatan Universitas Gadjah Mada dengan nomor : KE/FK/0520/EC, promega Go Taq Green Master Mix (berisi DNA taq polymerase, dNTPs, MgCl2 dan reaction buffer), Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer (10x), primer forward (5’-GACTAAGTTTCTCCTGTGTTAGTGG- 3’) dan primer reverse (5’-TTCCCAAAAGAGGTATGGACCC-3’) (Macrogen), Water For Injection (WFI), nuclease free water, agarose, FluorovueTM Nucleic Acid Gel Stain (Smobio), 50 bp dan 100 bp DNA Ladder (Smobio), kit restriksi (berisi enzim restriksi BsuRI (HaeIII), buffer tango, dan buffer R 10x) (thermoscientific).
E. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Thermal cycler (Biorad), satu set Elektroforesis (Biorad), UV Transilluminator (Fisher Scientific), inkubator Laboratorium Biokimia (Heraeus) dan Kultur Jaringan (Memmert), centrifuge (Biologix), mikropipet 1-10 µL (Socorex Acura 825), mikropipet 2-20 µL (Socorex Acura 825), Microwave (Electrolux), white tip, yellow tip, microtube
0,2 mL (Axygen), gelas beaker (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), erlenmeyer (Pyrex), labu takar (Pyrex), sendok tanduk, pipet tetes, dan kamera.
F. Tata Cara Penelitian 1. Analisis Kualitatif Isolat DNA
Gel agarose konsentrasi 1% dibuat dengan melarutkan 0,25 g agarose dalam larutan buffer 1x TBE sebanyak 25 mL ke dalam erlenmeyer 100 mL, lalu dipanaskan menggunakan microwave selama 5 menit dengan daya pemanasan low hingga larut sempurna, setelah erlenmeyer mulai dingin, diaduk hingga homogen.
Larutan tersebut dituang kedalam cetakan yang telah diberi sisiran dan dibiarkan mengeras, setelah mengeras, sisiran dicabut hingga terbentuk 8 sumur kemudian cetakan dimasukkan ke dalam chamber lalu ditambahkan larutan buffer 1x TBE sampai permukaan gel terendam. Isolat DNA yang digunakan pada uji kemurnian sebanyak 7 sampel yang berbeda dan dimasukkan pada masing-masing sumuran, salah satu sumuran dimasukkan DNA ladder 100 bp sebanyak 5 μL. Isolat DNA diambil sebanyak 3 μL, ditambahkan WFI 2 μL, dan dicampurkan dengan loading dye 1 μL. Campuran tersebut diambil sebanyak 5 μL dan dimasukkan ke dalam sumuran kemudian dilakukan elektroforesis dengan tegangan 110 volt selama 30 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan UV transilluminator lalu didokumentasikan menggunakan kamera.
2. Pembuatan Gel Agarose 1,5%
Pembuatan gel agarose 1,5% dilakukan dengan cara 0,375 g agarose dilarutkan dalam larutan buffer TBE 1x sebanyak 25 mL ke dalam erlenmeyer 100 mL, lalu dipanaskan di microwave selama 5 menit dengan daya pemanasan low hingga larut sempurna, setelah erlenmeyer mulai dingin, diaduk hingga homogen.
Larutan tersebut kemudian dituang kedalam cetakan yang telah diberi sisiran dan dibiarkan mengeras, kemudian sisiran dicabut hingga membentuk sumur-sumur sebagai tempat dimasukkannya sampel yang akan diuji.
3. Optimasi Suhu Annealing
Optimasi suhu annealing dilakukan perhitungan Temperature melting primer menggunakan rumus Tm (℃) = 2 (A+T) + 4 (G+C) (Maddocks and Jenkins,
2017). Nilai Tm yang didapatkan masing-masing primer dikurangi dan ditambah 5℃ untuk mendapatkan nilai Ta kemudian variasi suhu annealing dibuat menggunakan program gradien PCR sehingga didapatkan variasi suhu 55; 56,1;
57,9; 60,7; 64; 67; 68,9; dan 70℃. Promega go taq green master mix diambil 12,5 μL, primer forward dan reverse masing-masing 1 μL, isolat DNA 5 μL, dan nuclease free water 5,5 μL sehingga volume total menjadi 25 μL. Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR. Kondisi PCR yang digunakan yaitu initial denaturasi pada suhu 95°C selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik, suhu annealing selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 25 detik. Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali, lalu diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit. Produk PCR divisualisasikan menggunakan elektroforesis kemudian dilihat ketebalan produk PCR yang optimal dan memiliki ukuran 369 bp.
4. Optimasi Konsentrasi Primer
Primer forward dan reverse yang baru, dilarutkan terlebih dahulu menggunakan nuclease-free water sebanyak 250 μL sehingga didapatkan konsentrasi 100 μM sebagai larutan stok primer, kemudian dilakukan pengenceran 2x dengan membuat larutan intermediet primer, sebanyak 5 μL larutan stok diambil lalu ditambahkan 5 μL nuclease-free water sehingga didapatkan konsentrasi primer 50 μM. Optimasi konsentrasi primer dilakukan dengan membuat variasi konsentrasi 2; 2,5; 3; dan 3,5 μM dari larutan intermediet. Komposisi PCR untuk optimasi konsentrasi primer dapat dilihat pada tabel berikut.
Tabel II. Komposisi PCR mixture Komposisi
Konsentrasi (μM)
2 2,5 3 3,5
Green taq 12,5 μL 12,5 μL 12,5 μL 12,5 μL
Isolat DNA 5 μL 5 μL 5 μL 5 μL
Primer-F 1 μL 1,25 μL 1,5 μL 1,75 μL Primer-R 1 μL 1,25 μL 1,5 μL 1,75 μL
Nuclease-free water 5,5 μL 5 μL 4,5 μL 4 μL
Volume total 25 μL
Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR. Kondisi PCR yang digunakan, yaitu initial denaturasi pada suhu 95°C selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik, annealing berdasarkan hasil optimasi yang didapatkan selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 25 detik.
Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali, lalu diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit. Produk PCR divisualisasikan menggunakan elektroforesis kemudian dilihat ketebalan produk PCR yang optimal, sisa primer, dan memiliki ukuran band sebesar 369 bp.
5. Analisis Produk PCR Hasil Optimasi menggunakan Elektroforesis
Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis menggunakan gel agarose konsentrasi 1,5% sebagai fase diam kemudian ditambah 2,5 µL reagen nucleic acid gel stain. Gel dicetak di dalam cetakan, diberi sisiran kemudian dilepaskan jika sudah keras. Gel agarose dimasukkan ke dalam gel tray elektroforesis berisi larutan buffer 1x TBE hingga permukaan gel terendam. Produk PCR diambil sebanyak 5 μL dan dimasukkan ke dalam sumuran, salah satu sumuran diisi DNA ladder 50 bp sebanyak 5 μL kemudian elektroforesis dijalankan pada tegangan 110 volt selama 30 menit. Setelah 30 menit, produk PCR hasil elektroforesis divisualisasikan dengan UV transilluminator lalu didokumentasikan menggunakan kamera.
6. Validasi Metode PCR
a. Spesifisitas. Primer gen PRKAA2 rs857148 dianalisis menggunakan program Primer-BLAST website NCBI terlebih dahulu untuk menguji parameter spesifisitas (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Primer forward dan reverse disalin ke dalam kotak “Primer Parameters” dan pilih “Get Primers”, kemudian sepasang primer yang digunakan akan muncul beserta lokasi sekuen target, nomor aksesi, dan ukuran produk PCR yang akan diamplifikasi. Data primer yang didapatkan akan dianalisis menggunakan program Nucleotide-BLAST untuk melihat perbandingan hasil yang sesuai dengan target amplifikasi dalam bentuk persentase. Nomor aksesi diklik untuk melihat sekuen target (FASTA) yang akan
diamplifikasi oleh primer gen PRKAA2 rs857148, kemudian masuk ke dalam website Nucleotide-BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Nomor aksesi atau sekuens FASTA disalin ke kotak “Enter Query Sequence” kemudian pilih Homo sapiens dan klik “BLAST” maka akan muncul tingkat persamaan nukleotida yang dianalisis dengan database nukleotida NCBI, apabila tingkat persamaan primer yang didesain sebesar 100% pada gen target (manusia) maka primer yang digunakan sudah memiliki spesifisitas yang baik (Febriyana et al., 2021; Sihotang et al., 2021).
b. Reprodusibilitas. Amplifikasi produk PCR dilakukan menggunakan 7 sampel isolat DNA yang berbeda. Amplifikasi dilakukan dengan mengambil Promega go taq green master mix 12,5 μL, primer forward dan reverse menggunakan hasil optimasi yang didapatkan, isolat DNA 5 μL, dan nuclease-free water 4,5 μL sehingga volume total menjadi 25 μL. Kondisi PCR yang digunakan, yaitu initial denaturation pada suhu 95°C selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik, suhu annealing sesuai kondisi optimal yang didapat selama 30 detik, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 25 detik. Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali, lalu diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit. Produk PCR diambil sebanyak 5 μL dan dimasukkan ke dalam sumuran, salah satu sumuran diisi DNA ladder 50 bp sebanyak 5 μL kemudian elektroforesis dijalankan pada tegangan 110 volt selama 30 menit. Produk PCR divisualisasikan dengan UV transilluminator lalu didokumentasikan menggunakan kamera, apabila ukuran band yang terbentuk sebesar 369 bp, maka metode PCR telah memenuhi parameter reprodusibilitas.
7. Pemotongan Produk PCR dengan Metode PCR-RFLP
Enzim restriksi pada penelitian ini didesain menggunakan website genscript. Jumlah produk PCR yang digunakan dalam pemotongan, yaitu 7 sampel.
Pemotongan dilakukan dengan mengambil produk PCR 10 μL, nuclease-free water 18 μL, 10x Buffer R 2 μL, dan enzim BsuRI 1 μL dimasukkan ke dalam microtube 0,2 mL lalu diinkubasi pada suhu 37℃ selama 2 jam kemudian dilakukan inaktivasi pada suhu 80℃ selama 20 menit. Produk PCR yang sudah direstriksi divisualisasikan menggunakan elektroforesis gel agarose dengan konsentrasi 1,5%.
Produk PCR diambil sebanyak 5 μL dan dimasukkan ke dalam sumuran, salah satu sumuran diisi DNA ladder 50 bp sebanyak 5 μL kemudian elektroforesis dijalankan pada tegangan 110 volt selama 30 menit, setelah itu divisualisasikan dengan UV transilluminator lalu didokumentasikan menggunakan kamera.
G. Analisis Hasil 1. Kondisi Optimum Metode PCR
Kondisi metode PCR yang dioptimasi, yaitu suhu annealing dan konsentrasi primer. Suhu annealing dikatakan optimal apabila hasil visualisasi menggunakan metode elektroforesis menunjukkan ketebalan yang optimal dan panjang band produk PCR sebesar 369 bp pada salah satu produk PCR. Konsentrasi primer dikatakan optimal apabila hasil visualisasi menggunakan metode elektroforesis menunjukkan ketebalan dan sisa primer pada media gel agarose yang optimal serta memiliki ukuran sebesar 369 bp.
2. Spesifisitas
Metode PCR memenuhi parameter spesifisitas apabila hasil BLAST primer gen PRKAA2 rs857148 menggunakan website NCBI menunjukkan kemiripan sebesar 100% dengan gen PRKAA2 pada manusia (Homo sapiens).
3. Reprodusibilitas
Metode PCR memenuhi parameter reprodusibilitas apabila hasil visualisasi produk PCR dari sampel isolat DNA yang berbeda memiliki ukuran produk PCR yang sama, yaitu 369 bp.
4. Analisis Hasil Identifikasi SNPs pada Produk PCR
Penentuan hasil identifikasi SNPs pada produk PCR divisualisasikan menggunakan elektroforesis. Produk PCR yang memiliki SNPs gen PRKAA2 rs857148 ditandai dengan band yang terpotong menjadi fragmen-fragmen DNA dengan ukuran band yang berbeda. Fragmen DNA yang terpotong kemungkinan membentuk homozigot mutan dan heterozigot yang dapat dilihat dengan pola band DNA yang terbentuk.
24 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum metode PCR untuk menghasilkan produk PCR yang reprodusibel sehingga dapat dilanjutkan untuk melakukan identifikasi Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) gen PRKAA2 rs857148 menggunakan metode PCR-RFLP. Penelitian ini meliputi beberapa tahapan, yaitu analisis kualitatif isolat DNA, optimasi suhu annealing dan kadar primer, validasi metode PCR, dan pemotongan produk PCR menggunakan metode PCR-RFLP. Optimasi kondisi PCR bertujuan untuk mendapatkan komposisi dan kondisi yang sesuai dalam menghasilkan produk PCR yang optimal dengan memiliki band tunggal, tebal, dan sesuai ukuran target (Setyawati and Zubaidah, 2021). Validasi metode PCR dilakukan untuk membuktikan metode ini memenuhi parameter spesifisitas dan reprodusibilitas sehingga mendapatkan hasil yang akurat (Wahyuni, Maryam, and Aminah, 2019). Setelah itu, dilakukan identifikasi SNPs menggunakan metode PCR-RFLP dengan enzim restriksi yang memotong pada urutan spesifik sekuen tertentu sehingga menghasilkan fragmen- fragmen DNA yang beragam (Nurhayati and Darmawati, 2017).
A. Analisis Kualitatif Isolat DNA
Analisis kualitatif isolat DNA bertujuan untuk melihat kemurnian isolat DNA. Isolat DNA yang digunakan pada penelitian ini berasal dari subjek uji Diabetes Melitus tipe 2 di salah satu rumah sakit swasta Yogyakarta. Isolat DNA dianalisis menggunakan teknik elektroforesis gel agarose 1% sebagai fase diam dan buffer TBE 1x sebagai fase gerak kemudian divisualisasikan menggunakan UV transilluminator. Pada uji ini, DNA ladder digunakan sebagai penanda/marker dengan range 100 bp-3000 bp dan loading dye yang mengandung pewarna seperti bromophenol blue atau xylene cyanol untuk memudahkan pengamatan melalui UV transilluminator dan gliserol untuk meningkatkan densitas dari DNA sehingga tetap berada di sumuran (Magdeldin, 2012). Ukuran isolat DNA utuh manusia mencapai 3 juta bp (Adil, Kumar, Jan, and Asger, 2021). Isolat DNA dikatakan
murni jika menunjukkan band yang tunggal, tebal, terletak diatas marker pada sumuran, dan tidak adanya smear. Band yang tebal dan terang menandakan konsentrasi DNA yang dihasilkan tinggi sedangkan band yang tipis menandakan konsentrasi DNA yang rendah (Hidayati, Saleh, and Aulawi, 2016). Hasil analisis kualitatif isolat DNA pada gambar 1 menunjukkan bahwa band yang terbentuk, yaitu tunggal, tebal, memiliki ukuran lebih dari 3000 bp, dan tidak terbentuk smear sehingga isolat yang digunakan pada penelitian ini dinyatakan murni dan dapat digunakan untuk proses selanjutnya, yaitu amplifikasi produk PCR.
Gambar 1. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA
Keterangan : M = Marker/DNA Ladder; 1-7 = isolat DNA subjek uji
B. Optimasi Kondisi PCR Gen PRKAA2 rs857148
Metode PCR merupakan suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA pada daerah tertentu secara in vitro yang melibatkan beberapa siklus serta terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda pada setiap siklusnya (Handoyo and Rudiretna, 2001). Metode PCR digunakan untuk diagnosis secara molekuler yang dapat mendeteksi adanya suatu virus, bakteri, protozoa, dan parasit (Pertiwi et al., 2018). Metode ini dapat menghasilkan amplifikasi produk PCR secara akurat, cepat, spesifik, dan membutuhkan jumlah sampel yang sedikit (Ismaun, Muzuni, and Hikmah, 2021). Amplifikasi produk PCR akan berhasil apabila kondisi PCR yang digunakan sudah optimal (Setyawati dan Zubaidah, 2021). Pada penelitian ini, setelah isolat DNA yang dianalisis dinyatakan murni, selanjutnya dilakukan optimasi kondisi PCR berupa suhu annealing dan konsentrasi primer.
Kondisi PCR yang sesuai ditandai dengan produk PCR yang optimal.
Produk PCR dikatakan optimal apabila menghasilkan band yang tebal, tunggal, dan memiliki ukuran yang sesuai dengan DNA target (Setyawati and Zubaidah, 2021).
Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen PRKAA2 rs857148, yaitu primer forward (5’-GACTAAGTTTCTCCTGTGTTAGTGG-3’) dan primer reverse (5’- TTCCCAAAAGAGGTATGGACCC-3’). Amplifikasi menggunakan primer tersebut akan menghasilkan produk PCR berukuran 369 bp. Primer forward akan menempel pada gen PRKAA2 rs857148 urutan 56709240 sampai 56709264, sedangkan primer reverse akan menempel pada urutan 56709587 sampai 56709608, rs857148 merupakan SNPs gen PRKAA2 yang terletak pada urutan 56709485 dengan perubahan basa nukleotida Adenin menjadi Sitosin di daerah 3’UTR (NCBI, 2022). Posisi penempelan primer forward dan reverse dapat dilihat pada gambar berikut.
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen gen PRKAA2 (NCBI, 2022)
Optimasi suhu annealing penting dilakukan untuk meningkatkan keberhasilan dalam amplifikasi produk PCR yang mempengaruhi spesifisitas penempelan primer (Hidayati, Saleh, and Aulawi, 2016). Secara teoritis, optimasi suhu annealing dilakukan dengan menghitung nilai melting temperature (Tm) primer forward dan reverse gen PRKAA2 rs857148 menggunakan rumus Tm = [2(A+T) + 4(G+C)]. Nilai Tm primer forward, yaitu 72℃, sedangkan nilai Tm primer reverse, yaitu 66℃ kemudian nilai Tm primer forward dan primer reverse dikurangi dan ditambahi 5℃ untuk membuat rentang suhu annealing yang akan digunakan (Setyawati and Zubaidah, 2021). Berdasarkan hasil perhitungan, didapatkan rentang suhu primer forward sebesar 65℃-77℃ dan primer reverse sebesar 61℃-71℃, maka rentang suhu annealing dari kedua primer tersebut adalah 61℃-77℃. Rentang terendah suhu annealing, yaitu 61℃. Pemilihan suhu
annealing yang terlalu rendah maupun tinggi dapat menyebabkan terjadinya kegagalan penempelan primer pada sekuen target yang dikehendaki. Suhu annealing yang umum digunakan, yaitu 50℃-60℃ (Aulia, Suwignyo, and Hasmeda, 2021). Oleh karena itu, untuk menghindari terjadinya kegagalan penempelan primer, rentang suhu annealing terendah yang digunakan pada penelitian ini, yaitu 55℃. Rentang suhu annealing tidak dibuat hingga 77℃ karena suhu tersebut terlalu tinggi. Oleh karena itu, rentang tertinggi suhu yang digunakan pada penelitian ini, yaitu 70℃ sehingga rentang suhu annealing yang digunakan untuk optimasi adalah 55℃-70℃ kemudian variasi suhu annealing dibuat dengan bantuan program gradien pada alat thermal cycler sehingga gradien suhu yang digunakan untuk optimasi, yaitu 55; 56,1; 57,9; 60,7; 64; 67; 68,9; dan 70℃. Hasil optimasi suhu annealing dapat dilihat pada gambar 3.
(a) (b)
Gambar 3. Hasil Optimasi Suhu Annealing Gen PRKAA2 rs857148
Keterangan : M = Marker/DNA Ladder; A1-H1 : variasi suhu annealing, yaitu 70℃, 68,9℃, 67℃, 64℃, 60,7℃, 57,9℃, 56,1℃, 55℃
Pada penelitian ini, suhu annealing 67℃, 68,9℃, dan 70℃ menunjukkan bahwa band produk PCR tidak terbentuk kemudian band yang terbentuk pada suhu 64℃, yaitu tipis. Hal ini disebabkan oleh suhu annealing yang terlalu tinggi menyebabkan primer yang sudah menempel pada DNA template akan terlepas sehingga produk PCR tidak akan terbentuk (Aulia, Suwignyo, and Hasmeda, 2021).
Pada penelitian ini, suhu annealing optimum yang digunakan, yaitu 56,1℃ karena dapat mengamplifikasi DNA target dengan terbentuknya band tunggal, jelas, dan sesuai ukuran target, yaitu 369 bp. Suhu 55℃ sudah dapat menghasilkan band yang
dikehendaki, namun tidak digunakan sebagai suhu annealing optimum karena suhu tersebut merupakan rentang terendah dari variasi suhu annealing yang digunakan.
Suhu annealing yang terlalu rendah akan menyebabkan primer menempel pada situs yang tidak spesifik sehingga menyebabkan terjadinya amplifikasi DNA yang tidak diinginkan (Pertiwi, Mahardika, and Watiniasih, 2015). Konsentrasi primer yang digunakan pada optimasi suhu annealing, yaitu 100 μM. Hasil visualisasi elektroforesis pada gambar 3 menunjukkan terdapat sisa primer yang tebal karena konsentrasi primer yang digunakan terlalu tinggi. Oleh karena itu, perlu dilakukan penurunan konsentrasi primer untuk meningkatkan efisiensi komposisi PCR (Park et al., 2020).
Optimasi konsentrasi primer penting dilakukan untuk mengurangi sisa primer yang tebal pada produk PCR (Park et al., 2020). Hasil visualisasi optimasi konsentrasi primer dapat dilihat pada gambar 4. Pada penelitian ini, variasi konsentrasi primer yang dioptimasi, yaitu 2; 2,5; 3; dan 3,5 μM. Hasil optimasi konsentrasi primer dapat dilihat pada gambar 4, setiap konsentrasi primer menghasilkan band yang tebal, tunggal, sisa primer yang sedikit, dan memiliki ukuran 369 bp. Konsentrasi primer yang terlalu rendah dapat menyebabkan produk yang dihasilkan tidak konsisten serta setiap isolat DNA memiliki tingkat konsentrasi yang berbeda sehingga pita yang dihasilkan dapat memiliki ketebalan yang beragam (Joko, Kusumandari, and Hartono, 2011; Mulyani, Purwanto, and Nurruhwati, 2011). Oleh karena itu, untuk menghindari terjadinya band yang terbentuk tidak konsisten, maka konsentrasi 3 μM dipilih sebagai konsentrasi primer optimum.
Gambar 4. Hasil Optimasi Konsentrasi Primer Gen PRKAA2 rs857148 Keterangan : M = Marker/DNA Ladder; K1-K4 = konsentrasi primer, yaitu
2; 2,5; 3; dan 3,5 μM
C. Validasi metode PCR
Validasi merupakan faktor penting untuk membuktikan validitas suatu metode analisis yang akurat dengan memenuhi semua parameter analisis (Wahyuni, Maryam, and Aminah, 2019). Parameter validasi yang diuji pada penelitian ini, yaitu spesifisitas dan reprodusibilitas. Spesifisitas primer yang digunakan untuk amplifikasi sekuen target dianalisis menggunakan program Nucleotida-BLAST untuk melihat tingkat persamaannya dengan nukleotida yang terdapat pada database GenBank NCBI. Spesifisitas primer yang baik ditandai dengan tingkat persamaan dari nilai percent identity dan query cover sebesar 100% serta Expectation Value (E-value) sebesar ≤ 0.01. Percent identity merupakan nilai persentase kesesuaian antara sekuens target dengan database NCBI. Query Cover merupakan nilai persentase dari ukuran sekuen gen target dengan database NCBI (Newell, Fricker, Roco, Chandrangsu, and Merkel, 2013), sedangkan E-value merupakan merupakan indikator yang menunjukkan tingkat kecocokan sekuen target dengan database NCBI, E-value harus bernilai ≤ 0,01 (Rodríguez, Córdoba, Andrade, 2015). Hasil BLAST pada primer gen PRKAA2 rs857148 pada gambar 5 menunjukkan nilai percent identity dan query cover sebesar 100% serta E-value sebesar 0.0 dengan gen PRKAA2 pada Homo sapiens sehingga primer yang digunakan telah memenuhi parameter spesifisitas, kemudian dilakukan pengujian
