i
AKTIVITAS ANTIANGIOGENESIS EKSTRAK ETANOL BUAH
MENGKUDU (Morinda citrifolia L.) TERHADAP CHORIOALLANTOIC
MEMBRANE YANG DIINDUKSI BASIC FIBROBLAST GROWTH
FACTOR
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Pande Putu Krisna Wedana NIM : 108114030
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
ii
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Om Dewa suksma parama acintya ya namah swaha Sarwa karya prasidhantam
Om santih santih santi Om
Akhir dari upaya terbaik kita adalah awal dari campur tangan Tuhan.
Maka bekerjalah sebaik mungkin, lalu bersabarlah seyakin mungkin.
Ku persembahkan skripsi ini untuk :
Tuhan ku “Ida Sang Hyang Widhi Wasa”, sebagai pelindung dan sumberkekuatanku . . .
Papa dan Mama tercinta sebagai motivator terbesar dalam hidupku . . .
Pande Made Bayu Wedayana, Pande Nyoman Wahyu Wedadana adikku
dan keluarga besar yang selalu memberi dukungan dan doa . . .
Bapak Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt yang selalu membimbing dengan sabar .
Sahabat dan teman-teman seperjuangan Nover, Stien dan Retno
Almamaterku tercinta Universitas Sanata Dharma . . .
vi
vii
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi berjudul “Aktivitas Antiangiogenesis Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda citrifolia L) terhadap CAM yang diinduksi bFGF“
dengan baik dan tepat waktu.
Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) program studi Farmasi Universitas Sanata Dharma.
Penulis menyadari bahwa dalam pelaksanaan dan penyusunan skripsi, tidak terlepas dari bantuan dan campur tangan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada :
1. Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmatnya selama ini. 2. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 3. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt., sebagai Dosen Pembimbing Utama
skripsi ini atas segala kesabarannya telah memberikan bimbingan, pengarahan, tuntunan, dukungan dan motivasi selama penelitian dan penyusunan skripsi.
4. Ibu, Bapak, Ninik, Bayu, Komang, Tante-tante, Om dan Keluarga Besar Pande tercinta yang tidak putus-putusnya mendoakan dan memberi dukungan hingga penulis bisa menyelesaikan skripsi dengan baik.
5. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt, selaku Dosen Penguji yang telah
viii
6. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt, selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan kritik dan saran selama penyusunan skripsi.
7. Ni Putu Cintya Maharani penyemangatku yang selalu setia menemani dan memberikan masukan positif.
8. Teman-teman seperjuangan Nover, Stien dan Retno atas segala kerjasama, bantuan dan semangat yang selalu bergelora dalam penyusunan skripsi ini dari awal hingga akhir.
9. Sahabat-sahabat sejati, Therezita S. L., Inggrid R. T., Angelina Pangala, Tirzayana A. T., Catharina A., Pricilla Diana V. V., dan Catharina S. atas bantuan, kerjasama dan motivasi yang diberikan. 10.Seluruh warga FKK angkatan 2010 kelas C dan semua teman Farmasi
USD atas semngat kebersamaan dan keceriaan selama menempuh S1 di Fakultas Farmasi Sanata Dharma.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu peneliti menerima kritik dan saran yang membatu dan bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan, serta dapat menjadi acuan bagi penelitian-penelitian selanjutnya.
ix
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL...i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING...ii
HALAMAN PERSEMBAHAN...………...iii
PRAKATA...iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...vi
DAFTAR ISI...vii
DAFTAR TABEL...xi
DAFTAR GAMBAR...xii
DAFTAR LAMPIRAN...xiii
INTI SARI...xiv
ABSTRACT...xvi
BAB I. PENGANTAR... 1
A. LATAR BELAKANG... 1
1. Perumusan masalah………...4
2. Keaslian penelitian……….4
3. Manfaat penelitian………..4
B. TUJUAN PENELITIAN……….5
a. Tujuan umum ...5
x
A.Jenis dan Rancangan Penelitian……….25
B. Variabel……….25
1. Variabel utama………25
xi
3. Definisi operasional ………...26
C. Bahan Penelitian………....27
D.Alat Penelitian………...27
E. Tata Cara Penelitian ……….28
1. Determinasi tanaman ………...28
2. Preparasi ekstrak etanol buah mengkudu………....28
3. Sterilisasi alat………...29
4. Pembuatan larutan uji basic fibroblast growth factor………...29
5. Uji angiogenesis………..29
F. Analisis Data……….31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN………...33
A. Hasil Determinasi dan Ekstraksi Buah Mengkudu………33
B. Aktivitas Basic Fibroblast Growth Factor Dalam Menginduksi Angiogenesis………..34
C. Uji Daya Hambat Ekstrak Etanol Buah Mengkudu Morinda Citrifolia L. Terhadap Angiogenesis Pada CAM Terinduksi bFGF………...38
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN……….46
A. Kesimpulan………46
B. Saran………...46
DAFTAR PUSTAKA………47
LAMPIRAN ………..54
xii
DAFTAR TABEL
Tabel I Jumlah Pembuluh Darah Baru Kelompok Kontrol Paper Disc, Kontrol Pelarut, Kontrol bFGF + Pelarut dan Kelompok Perlakuan ……... 37
Tabel II Persentase Penghambatan Angiogenesis Dengan Varian Konsentrasi Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda citrifolia. L ) ………….. ...39 Tabel III Matriks Signifikasi % Penghambatan Angiogenesis (P < 0,05)…41 Tabel IV Rata-rata dan Standar Deviasi Pembuluh Darah Baru…………...61 Tabel V Persentase Penghambatan Angiogenesis………63
xiii
DAFTAR GAMBAR
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Foto Buah Mengkudu Morinda citrifolia.L………...55
Lampiran 2 Foto Serbuk Morinda citrifolia.L……….55
Lampiran 3 Foto Ekstrak Kental Etanol Buah Mengkudu Morinda citrifolia.L………..56
Lampiran 4 Foto Pembuatan larutan uji dan larutan basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)………...56
Lampiran 5 Foto Pembuatan Jendela Berukuran 1x1 cm………..57
Lampiran 6 Data Perhitungan Rendemen Ekstrak Etanol Buah Mengkudu………...57
Lampiran 7 Data Perhitungan Pengenceran bFGF………....58
Lampiran 8 Perhitungan Berat Ekstrak dan Volume DMSO………...59
Lampiran 9 Persentase Penghambatan Angiogenesis………61
Lampiran 10 Foto Pengamatan makroskopik pembentukan pembuluh darah pada setiap kelompok………....64
Lampiran 11 Analisis uji statistik normalitas………...65
Lampiran 12 Analisis uji statistik one way anova………65
Lampiran 13 Analisis uji statistik Tukey………...…………..67
xv
INTISARI
Salah satu strategi penghambatan perkembangan kanker adalah dengan menghambat proses angiogenesis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek antiangiogenesis ekstrak etanol buah Morinda citrifolia. L menggunakan metode
chorioallantoic membrane (CAM). CAM telur ayam berembrio umur 8-9 hari diberi perlakuan bFGF (induktor angiogenesis) dan ekstrak etanol buah Morinda citrifolia. L kemudian diinkubasi selama 3 hari untuk selanjutnya diamati respon angiogenesisnya.
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan didapatkan hasil ekstrak etanol buah Morinda citrifolia. L mampu menghambat angiogenesis pada CAM. Penelitian ini menunjukkan bahwa kandungan ekstrak etanol buah mengkudu memiliki aktivitas antiangiogenesis. Kemampuan penghambatan angiogenesis ekstrak etanol buah Morinda citrifolia. L adalah pada konsentrasi 100 µg/ml, ekstrak mempunyai kemampuan menghambat sebesar 12,86% ; konsentrasi 150 µg/ml sebesar 37,17% ; konsentrasi 225 µg/ml sebesar 50,03%.
Kata kunci : Morinda citrifolia L., angiogenesis, Chorioallantoic Membrane
xvi
ABSRACT
One strategy is the inhibition of the progression of cancer by inhibiting angiogenesis process. This study aims to determine the antiangiogenesis effects of ethanol extract of Morinda citrifolia. L fruit using the method of chorioallantoic membrane (CAM). CAM embryonated chicken eggs 8-9 days of age treated with bFGF (inductor angiogenesis) and ethanol extract of Morinda citrifolia. L fruit and then incubated for 3 days then observed the response to angiogenesis.
Based on the results of research conducted showed ethanol extract of
Morinda citrifolia. L fruit was able to inhibit angiogenesis in CAM. This study shows that the content of the ethanol extract of noni fruit has a antiangiogenesis activity. Angiogenesis inhibition ability of ethanol extract of Morinda citrifolia. L fruit is at a concentration of 100 ug / ml, the extract has the ability to inhibit by 12.86%; concentration of 150 ug / ml was 37.17%; concentration of 225 ug / ml was 50.03%.
Kata kunci : Morinda citrifolia L., angiogenesis, Chorioallantoic Membrane (CAM), bFGF.
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Menurut Organisasi Kesehatan Dunia setiap tahun penderita kanker di dunia bertambah 6,25 juta orang. Di Indonesia diperkirakan setiap tahun terdapat 100 penderita baru dari setiap 100.000 penduduk. Penyakit kanker menduduki urutan ketiga penyebab kematian di Indonesia (Nugroho dkk, 2000).
Banyaknya usaha dilakukan untuk mencegah dan mengobati penyakit kanker. Pengobatan medis seperti kemoterapi, pembedahan, dan penyinaran bukanlah pilihan yang diminati pasien karena biaya obat dan perawatan yang mahal dan menimbulkan efek samping setelah terapi yang tidak diinginkan seperti daya tahan tubuh menurun, rambut rontok, kulit dan gigi menjadi rusak (Nafrialdi & Gan 1982). Oleh karena itu perlu adanya alternatif pencegahan dan pengobatan kanker yang aman dan mudah tersedia dengan memanfaatkan dan mengkonsumsi bahan alami yang terdapat dan tumbuh di daerah yang terjangkau pada penderita kanker.
2
untuk pengobatan maupun menjaga kesehatan tubuh (Bestari, 2005). Menurut Will Mcclatchey, (2002) (dalam jurnal Aruma, et al., 2013), menyebutkan bahwa buah mengkudu mengandung berbagai komponen seperti vitamin C, vitamin A, terpenoid, alkaloid, antrakuinon (damnachantal, mirindon, rubiadin-1-metil eter), rutin, alizarin, asam kapirat, kumarin, skopoletin dan flavonoid.
Pada penelitian (Hiramatsu dkk., 1993) menyebutkan bahwa buah mengkudu dapat menghambat pertumbuhan tumor dengan merangsang sistem imun yang melibatkan makrofag atau limfosit. Buah mengkudu memiliki aktivitas adaptogen, yang artinya bahwa buah mengkudu termasuk salah satu nutrisi yang dapat mengembalikan fungsi sel yang abnormal menjadi normal.
Berdasarkan hasil penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa buah mengkudu diketahui mempunyai efek antikanker. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek antikanker dari ekstrak etanol buah mengkudu, termasuk efek antiangiogeniknya, yang sangat menarik dan penting untuk dilakukan. Hal ini didukung oleh hasil-hasil penelitian sebelumnya yang telah menyatakan bahwa kandungan-kandungan senyawa aktif buah mengkudu memiliki efek antikanker.
Metode CAM merupakan salah satu media yang paling umum digunakan untuk mempelajari respon angiogenesis. Ini karena CAM merupakan suatu membran yang kaya akan pembuluh darah (Ribatti dkk., 1998), sehingga pengamatan terhadap respon angiogenesis akan lebih mudah diamati. Keunggulan metode CAM itu sendiri yaitu telur ayam berembrio mudah didapat, relatif murah dan mudah dikerjakan dilaboratorium (Vu dkk., 1985 cit Kirchner dkk, 1996).
Selain itu di dalam telur berembrio memiliki lingkungan yang tertutup dan terlindung oleh cangkang telur, sehingga aman, mudah dipegang dan dipelihara selama inkubasi di laboratorium (Evans, 1991).
Menurut (Hirazumi, 1999) menyatakan bahwa buah mengkudu mengandung substansi polysaccharide-rich yang mempunyai aktivitas anti tumor. Berdasarkan hasil penelitiannya terbukti bahwa ekstrak etanol buah mengkudu mampu mengatasi kanker dan infeksi. Pernyataan serupa dikemukakan oleh (Wang, 2001), mengkudu mengandung senyawa yang mampu memperbaiki kerusakan DNA. Pernyataan tersebut didukung oleh (Hiramatsu dkk., 1993) bahwa mengkudu mengandung zat anti tumor yang dapat meningkatkan respon sel-sel T dan makrofag.
4
1. Perumusan masalah
a. Apakah ekstrak etanol buah mengkudu memiliki aktivitas antiangiogenesis pada CAM embrio ayam yang diinduksi bFGF ?
b. Adakah hubungan antara konsentrasi ekstrak etanol buah mengkudu dengan aktivitas antiangiogenesis pada CAM embrio ayam yang diinduksi bFGF ?
2. Keaslian penelitian
Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang uji angiogenesis buah mengkudu pernah dilakukan oleh Hornick, et al, 2003 melakukan penelitian tentang Penghambatan inisiasi angiogenik dan gangguan pembuluh darah baru dengan jus dari mengkudu. Perbedaan penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah buah mengkudu yang digunakan didapat dari Bangli, Bali, yang kemudian diolah menjadi simplisia di Bantul, Yogyakarta. Model uji antiangiogenesis yang digunakan adalah metode CAM dengan membran
chorioallantoic embrio ayam yang telah diinduksi bFGF. Perbedaan juga terletak pada konsentrasi ekstrak buah mengkudu yang akan di gunakan. Sepengetahuan penulis, penelitian uji antiangiogenesis buah mengkudu dengan metode CAM
menggunakan chorioallantoic membrane embrio ayam yang diinduksi bFGF
belum pernah dilakukan.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis
Dapat memperkaya ilmu pengetahuan mengenai adanya aktivitas antiangiogenesis pada buah mengkudu.
b. Manfaat metodologi
Dapat memberikan pengetahuan mengenai tata cara pengujian aktivitas anti-angiogenesis ekstrak etanolik buah mengkudu mengunakan metode
CAM pada embrio ayam yang diinduksi bFGF. c. Manfaat praktis
Dapat memberikan informasi mengenai adanya aktivitas antiangiogenesis pada buah mengkudu.
B. Tujuan Penelitian
1. Tujuan umum :
Untuk memberikan informasi kepada masyarakat tentang ekstrak buah mengkudu sebagai obat antikanker.
2. Tujuan khusus :
6
BAB II
PENELAHAAN PUSTAKA
A. Mengkudu
1. Sistematika tumbuhan
Berikut sistematika tumbuhan mengkudu :
Dunia : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Sub Divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Bangsa : Rubiales
Suku : Rubiaceae
Marga : Morinda
Jenis : Morinda citrifolia L. (Backer & Brink, 1965).
2. Nama daerah
Morinda citrifolia L. mempunyai nama daerah ; Pace (Jawa), Cangkudu (Pasundan), Kodhuk (Madura), Bakudu (Sumatra), Wangkudu (Kalimantan), Bakulu (Nusa Tenggara) (Suryowinoto, 1997).
3. Deskripsi
Mengkudu termasuk jenis tanaman pohon dan berbatang bengkok, ketinggian dapat mencapai 3-8 m. Daun tunggal dengan ujung dan pangkal kebanyakan runcing. Buahnya termasuk buah bongkol, benjol-benjol tidak teratur, berdaging, jika masak daging buah berair. Buah masak berwarna kuning kotor atau putih kekuning-kuningan dengan panjang 5-10 cm, lebar 3-6 cm (Suryowinoto, 1997).
Tanaman mengkudu berbuah sepanjang tahun. Mudah tumbuh pada berbagai tipe lahan, dengan daerah penyebaran dari dataran rendah hingga ketinggian 1500 dpl. Ukuran dan bentuk buahnya bervariasi, pada umumnya mengandung banyak biji, dalam satu buah terdapat ≥ 300 biji, namun ada juga tipe buah mengkudu yang memiliki sedikit biji. Bijinya dibungkus oleh suatu lapisan atau kantong biji, sehingga daya simpannya lama dan daya tumbuhnya tinggi. Dengan demikian, perbanyakan mengkudu dengan biji sangat mudah dilakukan (Djauhariya dkk., 2006).
4. Kandungan kimia dan manfaat
8
antibakteri. Vitamin C, sebagai antioksidan (Peter, 2005; Waha, 2000; Winarti, 2005).
Di dalam buah mengkudu terkandung zat-zat berkaitan dengan kesehatan dan telah dibuktikan hanya terdapat di dalam mengkudu. Tanaman mengkudu mengandung berbagai vitamin, mineral, enzim alkaloid, proxeronin yang dapat dibentuk menjadi xeronin, ko-faktor dan sterol tumbuhan yang terbentuk secara alamiah (Waha, 2001).
Mengkudu mengandung zat antikanker yang dinamakan damnacanthal
adalah sebuah antrakuinon (Hiramatsu et al., 1993). Zat tersebut paling efektif untuk melawan sel-sel abnormal dibanding zat-zat antikanker yang terdapat dalam tumbuhan lainnya. Senyawa scopoletin dalam buah mengkudu ditemukan pada tahun 1993 oleh para peneliti di Universitas Hawaii (Waha, 2001). Selanjutnya, ditemukan bahwa scopoletin dapat memperlebar saluran pembuluh darah yang menyempit dan melancarkan peredaran darah. Selain itu, juga scopoletin juga dapat membunuh beberapa tipe bakteri dan bersifat fungisida terhadap bakteri
Pythium sp dan bersifat anti peradangan dan alergi (Waha, 2001).
B. Ekstraksi
Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Zat-zat aktif terdapat di dalam sel, namun sel tanaman dan hewan berbeda demikian pula ketebalannya, sehingga diperlukan metode ekstraksi dengan pelarut tertentu dalam mengekstraksinya. Tujuan ekstraksi bahan alam adalah untuk menarik komponen
kimia yang terdapat pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut, yang menyebabkan perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut (Harborne, 1996). Menurut (Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2010) ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair yang dibuat dengan menyari simplisia, diluar cahaya matahari langsung. Ekstrak kering harus mudah digerus menjadi serbuk. Cairan penyari yang dapat digunakan dalam pembuatan ekstrak yaitu air, etanol, eter atau campuran etanol dan air.
10
C. Kanker
1. Definisi kanker
Sel kanker merupakan the outlaw cell karena tumbuh secara tidak teratur, melanggar kaidah normal, tidak peduli akan kontrol dalam perbanyakan, dan menggunakan agendanya sendiri (Sofyan, 2000). Artinya sel tersebut mampu memanipulasi lingkungan dan faktor-faktor yang dapat mendukung pertumbuhannya. Sel kanker mampu berproliferasi secara cepat dan tidak terkontrol pada satu sisi yang lain, ia juga mempunyai kemampuan untuk tidak mengalami apoptosis (program bunuh diri sel). Sel kanker juga dapat mencegah dirinya untuk tidak mengalami diferensiasi atau melakukan diferensiasi agar dapat terus tumbuh. Sel kanker juga kehilangan inhibisi kontak dengan sel yang lain atau dengan matriks ekstraseluler, sifat yang pada sel normal dapat mencegah pertumbuhan tidak terkendali. Untuk memperbesar masa selnya, sel kanker dapat membentuk pembuluh darah (angiogenesis) yang akan menyuplai oksigen, nutrisi dan protein-protein yang berguna untuk pertumbuhannya. Adanya pembuluh darah ini juga kemungkinan sel kanker untuk menginvasi jaringan lain dan bermetastasis (King, 2000 ; Hanalan dan Weinberg, 2000; Mulyadi, 1996), dan membentuk masa pada daerah baru di dalam tubuh (Sofyan, 2000).
Menurut WHO, kanker adalah istilah umum untuk satu kelompok besar penyakit yang dapat mempengaruhi setiap bagian dari tubuh. Istilah lain yang digunakan adalah tumor ganas dan neoplasma. Kanker juga dapat didefinisikan sebagai pertumbuhan sel-sel baru secara abnormal yang tumbuh melampaui batas normal, dan yang kemudian dapat menyerang bagian tubuh dan menyebar ke
organ lain. Proses ini disebut metastasis. Metastasis merupakan penyebab utama kematian akibat kanker (WHO, 2009).
Terjadinya kanker disebabkan oleh sel abnormal jaringan tubuh yang tumbuh dan berkembang dengan cepat dan tak terkendali. Sel abnormal akan menyusup ke jaringan di sekitarnya (invasif) dan terus menyebar melalui jaringan ikat dan darah serta menyerang organ-organ penting dan sel saraf tulang belakang. Saat sel abnormal tersebut menumpuk, mendesak, serta merusak jaringan dan organ yang ditempatinya barulah proses ini disebut tumor ganas atau kanker ( Zuhud, 2011).
2. Penyebab kanker
Secara pasti penyebab kanker yang menimbulkan pertumbuhan sel yang terus menerus, menembus batas normal yang akhirnya dapat menginvasi jaringan yang lain belum diketahui. Meski gelap, namun ada indikasi cukup kuat bahwa ada tiga agen yang menyebabkan kanker, yaitu agen kimia, fisika dan biologik (Sinardi & Yuswanto, 2000).
12
3. Morfologi sel kanker
Sifat fisiologis sel kanker sendiri meliputi enam perubahan esensial berikut ini. 1) Kemampuan sel dalam mencukupi kebutuhan signal pertumbuhannya
sendiri
Sel memerlukan signal pertumbuhan mitogenik sebelum mereka berpindah dari fase istirahat menuju fase aktif proliferatif. Ketergantungan pada signal pertumbuhan ini tampak ketika sel normal mengalami propagasi dalam kultur, di mana ploriferasi (memperbanyak diri) hanya terjadi ketika ditambah dengan faktor mitogenik yang cukup dan terintegrasi di dalam sel. Sebaliknya sel tumor akan melakukan regenerasi tergantung pada signal pertumbuhannya sendiri (Hanahan & Weinberg, 2000).
2) Ketidakpekaan sel terhadap signal anti pertumbuhan
Signal anti pertumbuhan dapat menghentikan proliferasi (memperbanyak diri) sel dengan dua mekanisme yaitu sel dipaksa keluar jalur aktif proliferasi menuju fase istirahat atau sel akan diinduksi yang kemudian akan melepaskan potensi proliferasi secara permanen menuju fase akhir pembelahan (post mitotic). Sel kanker harus dapat menghindari signal anti proliferatif ini, jika mereka ingin terus tumbuh (Hanahan & Weinberg, 2000).
3) Kemampuan sel untuk mencegah apoptosis
dan hilang. Sel kanker mempunyai kemampuan untuk mencegah apoptosis. Resistensi terhadap apoptosis ini diperoleh sel kanker melalui beberapa cara, yang paling umum adalah melalui sebuah mutasi yang melibatkan tumor supresor p53. Dengan adanya p53 yang abnormal, maka akan membiarkan sel yang mengandung DNA yang rusak untuk tetap bertahan dan melakukan replikasi yang diteruskan dengan proliferasi. Kemampuan sel dalam melakukan replikasi diperlukan untuk perkembangan sel kanker menjadi sel malignan (Hanahan & Weinberg, 2000).
4) Kemampuan sel melakuan replikasi potensial secara terbatas
Pada jaringan dewasa yang normal, sel-sel tetap terpelihara dalam jumlah tetap. Pada beberapa jaringan, misalnya tulang, keadaan ini diatur oleh tingginya kecepatan pembelahan sel yang diimbangi dengan hilangnya sel dengan kecepatan yang sama (Thurston & Lobo), 1988). Yang terjadi pada sel kanker, tidaklah demikian, mereka terus tumbuh dan tidak mati. Hal ini ditunjukkan dengan adanya potensial replikasi yang terbatas, yang diperlukan oleh sel kanker selama masa perkembangannya sampai mejadi tumor ganas (Hanahan & Weinberg, 2000).
5) Kemampuan sel dalam menopang angiogenesis
14
mereka dapat melakukan ekspansi ke jaringan lain. Oleh karena itu, sel kanker terus mengembangkan kemampuan angiogenesisnya (Hanahan & Weinberg, 2000).
6) Kemampuan sel malakukan metastasis dan invasi
Dalam masa perkembangannya, cepat atau lambat sebagian besar jenis kanker manusia, massa tumor primernya dapat melahirkan sel-sel sekunder. Sel-sel sekunder tersebut dapat berpindah tempat ke jaringan lain, menginvasi jaringan darah dan berhenti pada tempat-tempat tertentu, kemudian sel akan tumbuh dan berkembang membentuk koloni baru (Hanahan & Weinberg, 2000).
4. Proses terjadinya kanker
Kanker terjadi sebagai akibat dari perubahan sel sehingga sel terlepas dari mekanisme pengaturan pertumbuhan normal. Perubahan sel ini dikenal dengan istilah transformasi. Sebagai dasar transformasi adalah kelainan (mutasi) di dalam gen dari kanker, sehingga kanker dikatakan sebagai suatu gangguan atau kelainan genetik.
Tingkat perubahan sel pada pertumbuhan kanker adalah sebagai berikut :
Hiperplasi, yaitu perkembangan organ tubuh akibat pertumbuhan sel-sel baru yang abnormal karena hilangnya kontrol pertumbuhan. Metaplasia, yaitu perubahan epitel suatu jenis jaringan dewasa menjadi jaringan lain yang juga dewasa. Displasi, yaitu perubahan sel dewasa ke arah kemunduran dalam hal bentuk, besar orientasinya. Masih bersifat reversibel. Anaplasi, yaitu perubahan
serupa displasi yang menyimpang lebih jauh dari normal. Merupakan suatu ciri tumor ganas yang bersifat irreversibel. Karsinoma insitu yaitu gambaran sel menjadi sangat atipik namun belum terdapat pertumbuhan infiltratif. Invasi, yaitu sel kanker telah menembus lapisan basal jaringan (Sinardi & Yuswanto, 2000).
D. Angiogenesis
Angiogenesis adalah proses pembentukan pembuluh darah baru. Proses ini bermanfaat bagi keadaan fisiologi normal, seperti pada penyembuhan luka, mentruasi, proses reproduksi, perkembangan embrio, sebaliknya, juga menjadi faktor penting dalam pertumbuhan beberapa penyakit, termasuk kanker (Leahy, 2003; King, 2000; Folkman, 1996).
Angiogenesis adalah rate elimiting step pada sel kanker yang menentukan terjadinya metastasis atau pertumbuhan menjadi ukuran yang lebih besar dari 1mm (King, 2000). Angiogenesis merupakan langkah yang krusial bagi tumor untuk berubah dari ukuran yang kecil dan tidak berbahaya menjadi besar, bersifat malignan, dan dapat menyebar ke organ yang lain (Folkman, 1996). Lebih dari 2500 Ilmuan melaporkan bahwa angiogenesis sangat berhubungan dengan pertumbuhan dan perkembangan tumor (Brem, 1999).
16
nutrisi, oksigen, dan protein-protein growth factor yang didifusikan dari kapiler. Pada fase ini tumor disebut sebagai “tumor in situ” (Folkman, 1996).
Seperti diketahui, transfer oksigen dari pembuluh darah ke sel-sel, termasuk sel tumor, dilakukan melalui mekanisme difusi. Proses dipengaruhi oleh jarak antara pembuluh darah dengan sel tersebut. Ada nilai limit di mana difusi itu tidak terjadi dan sel akhirnya mengalami hipoksia. Data dari angiogram menyatakan pada percobaan menggunakan Dunning rat prostate carcinoma xenograft nilai limit tersebut adalah 110 µm. Daerah yang mengalami hipoksia tersebut dapat mengalami nekrosis ( Kerbel & Folkman 2002).
Angiogenesis diaktifkan oleh bermacam-macam pemicu fisiologi seperti gangguan sistem homeostatis oksigen dan diregulasi oleh sistem hormonal, serta dikontrol oleh keseimbangan antara faktor proangiogenik dan antiangiogenik (Keshet dan Sasson, 1999). Aktivator angiogenesis dapat dikategorikan menjadi tujuh, yaitu (1) faktor pertumbuhan, (2) protease, (3) trance elemen, (4) onkogen (5) molekul sinyal transduksi (6) cytokine dan(7) inducer endogen (Brem, 1999).
Angiogenesis dapat terjadi pada ujung-ujung sel endotel diikuti oleh pembentukan tunas-tunas kapiler baru yang saling beranastomose membentuk putaran seperti jari-jari lingkaran. Pembentukan tunas pembuluh darah berlangsung terus menerus mencapai sumber stimulus. Tunas pembuluh darah ini terbentuk dari tunas mikrovaskuler, kebanyakan berasal dari venula dan kapiler (Schor & Schor, 1983). Warren dkk. (1972) melaporkan bahwa tunas pembuluh darah terutama berasal dari sel endotel kapiler, venula dan kadang-kadang dari arteriola.
Pertumbuhan angiogenesis dapat terjadi melalui tiga fase, yaitu inisiasi oleh faktor pertumbuhan tumor melalui rute parakrin, stimulasi proliferasi dan invasi sel endotel, dan yang terakhir, yaitu maturasi dan diferensiasi sel endotel ( King, 2000). Fase-fase ini mencakup proses-proses seperti degradasi membran basalis, invasi stroma, morphogenesis pembuluh kapiler, penggabungan pembuluh darah kapiler menjadi pembuluh darah yang lebih besar, dan menambah pelindung sel periendhotelial (Keshet & Sasson, 1999).
Degradasi membran basalis diawali dengan dilatasi dengan peningkatan permeabilitas pembuluh darah. Sel endotel menjadi tegang, hubungan antar sel hilang dan diikuti dengan hancurnya membran basalis. Selanjutnya sel endotel bergerak menembus membran basalis dan mengadakan migrasi ke dalam stroma jaringan perivaskuler menuju sumber stimulus angiogenik. Kembudian sel endotel akan mengalami proliferasi atau mitosis. Proses diakhiri dengan maturasi tunas-tunas kapiler yang diikuti dengan sintesis dinding pembuluh darah dan membrane basalis yang baru serta diferensiasi arteriola dan venula. Ketika membran basalis terbentuk, pembuluh darah menjadi struktur yang semipermiabel menyerupai pembuluh darah dewasa. Sel fibroblas bermigrasi menuju pembuluh darah baru, melingkar dan selanjutnya menjadi lapisan seluler dan adventisial (Schor & Schor, 1983).
E. b-FGF
1. b-FGF ( basic Fibroblast Growth Factor)
18
neuroektoderm. Reseptornya berupa protein transmembran dan membentuk suatu subkelompok keluarga reseptor tirosin kinase (Murray & Keeley, 1993).
Basic fibroblast growth factor (bFGF) merupakan polipeptida yang mengandung 50% asam amino, yang dapat menstimulasi pertumbuhan dan diferensiasi pada beberapa tipe sel termasuk fibroblast, sel endotel dan sel syaraf (King, 2000).
Basic fibroblast growth factor (bFGF) sedikit diproduksi pada sel normal tapi pada sel kanker dan sel yang berada pada lingkungan yang kekurangan oksigen (hypoksia), b-FGF diproduksi dalam jumlah yang besar (King, 2000).
Ekspresi yang berlebihan dari polipeptida b-FGF normal tidak dapat menginduksi transformasi sel. Hanya jika b-FGF diubah strukturnya hingga perubahan struktur ini mengijinkan produknya memasuki jalur sekresi normal, maka b-FGF akan menjadi onkogen. Oleh karena itu, transformasi autocrine oleh
b-FGF mungkin berperan dalam perkembangan kanker pada manusia (King, 2000).
bFGF merupakan faktor angiogenik yang poten karena b-FGF dapat menstimulasi ketiga fase yang dibutuhkan dalam proses angiogenesis yaitu proliferasi, sekresi protease, dan kemotaksis sel endotel. Selain itu, b-FGF juga mempunyai reseptor yang terdistribusi lebih luas dibandingkan reseptor Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) (King, 2000).
bFGF yang diekspresikan pada CAM merupakan faktor penentu pada proses vaskularisasi pada masa perkembangan. Pemberian sejumlah tertentu
pemeberian bFGF pada CAM. Hal ini menunjukkan bahwa bFGF memang dikeluarkan oleh sel-sel tersebut dan diakumulasikan pada lingkungan ekstraseluler. bFGF akan berinteraksi dengan sel endothelial melalui reseptor
FGF tirosin kinase (Ribatti dkk., 1995 & 1998). Pemberian bFGF adalah untuk menginduksi terjadinya angiogenesis pada CAM dibuat seperti yang terjadi pada jaringan yang terkena tumor.
Kemampuan bFGF menginduksi angiogenesis ini dapat melalui berbagai jalur, salah satunya yaitu dengan menginduksi ekspresi mRNA COX-2. COX-2 adalah salah satu jenis enzim yang menpunyai pernan kunci pada konversi asam arakhidonat menjadi prostaglandin (PG). prostaglandin yang berasal dari COX-2 mengupregulasi produksi faktor pertumbuhan termasuk VEGF dan bFGF melalui mekanisme parakrin. VEGF adalah mitogen yang spesifik terhadap sel endothelial yang menyebabkan perubahan bentuk, produksi protease dan migrasi sel. Kesemua proses itu sangat diperlukan dalam pembentukan pembuluh darah baru. Jadi mekanisme bFGF dalam menginduksi angiogenesis ini, yaitu dengan meningkatkan produksi COX-2 yang ekspresinya akan menghasilkan prostaglandin dalam jumlah besar yang selanjutnya akan mengupregulasi produksi
VEGF (Leahy, 2003).
20
Protease yang dipengaruhi bFGF antara lain, yaitu plasmin yang dapat menghasilkan degradasi komponen terbesar ECM. Plasmin merupakan hasil aktivasi dari proenzim plasminogen. Aktivasi plasminogen ini diawali dari bFGF
mengupregulasi produksi urokinase plasminogen (uPA). Sekeresi uPA akan mengikat reseptornya (uPAR) pada permukaan sel endothelial. uPAR berinteraksi dengan non katalitik amino terminal (ATF) dari rantai tunggal pro uPA. Ikatan zymogen secara proteolitik diaktifkan dalam bentuk rantai ganda. Hal ini akan mempercepat aktivasi proenzim plasminogen menjadi plasmin (Ribatti dkk, 1999).
Degradasi Extracelluler–matrix (ECM) tergantung uPA/plasmin dengan pergerakan yang konsekuen dari faktor angiogenesis yang disimpan, dipengaruhi oleh bioavailibilitas bFGF di ECM. Sintesis bFGF baru disimpan di ECM dan karena adanya ikatan dengan heparin sulfat maka pengeluaran bFGF dari ECM
terhindar dari inaktivasi dan sangat membantu dalam proses difusinya. uPA dapat memfasilitasi angiogenesis dengan meningkatkan bioavailibilitas bFGF simpanan
ECM (Ribatti, 1999).
Mekanisme lain yang dapat menyebabkan terjadinya angiogenesis akibat dari pemberian induktor bFGF yaitu dengan menginduksi integrin αvβ3 (King,
2000) dan dapat menyebabkan sel menginvasi sekitar ECM dan memasuki cell cycle. Integrin αvβ3 dapat mengikat matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Eliceiri
dkk, 1999) dan mendegradasi komponen ECM yang merupakan barrier sel endothelial sehingga terjadi migrasi sel (Stetler-Stevenson, 1999). Integrin αvβ3
berperan penting dalam signaling intraseluler yang meregulasi pertahanan diri sel, proliferasi dan migrasi (Eliceiri dkk, 1999).
F. Chorioallantoic Membrane (CAM)
Alantois merupakan salah satu membran (bungkus) ekstraembrionik. Membran ini secara temporer membantu keperluan selama perkembangan embrional dan mempunyai fungsi yang cukup penting, tetapi tidak bergabung dalam tubuh hewan dewasa karena akan mati pada saat penetasan tiba. Alantois terbentuk dari lapisan endoderma dan mesoderma splanchis ekstraembrional. Dalam perkembangannya akan bergabung dalam karion membentuk membran kario alantois (Patten, 1978 ; Storer dkk, 1979).
Chorioallantoic Membrane (CAM) dari embrio ayam adalah sebuah membran tipis dengan jaringan yang kaya akan pembuluh darah, yang menyerupai jaringan endometrium pada uterus (Ribatti dkk, 1998). Ketika CAM
tervaskularisasi dengan tinggi, CAM merupakan media yang cocok/baik untuk propagasi virus dan mikroorganisme yang lain (Gojovic & Gruss, 1998).
22
juga berfungsi sebagai tempat pembuangan dan pencernaan (Patten, 1978; Storer dkk.,1979). Menurut Folkam (1971), membran kario alantois embrio ayam dapat digunakan sebagai salah satu metode untuk mempelajari respon angiogenesis terhadap implan jaringan tumor.
Pembuluh darah baru dalam embrio sendiri terbentuk melalui dua proses berbeda, yaitu vaskulogenesis dan angiogenesis. Vaskulogenesis meliputi diferensiasi (menjadi pembuluh darah) sel endotel dari precursor mesodermal, yang hanya terjadi selama masa perkembangan embrionik, sedangkan angiogenesis pembuluh darah baru dihasilkan dari prekursor mesodermal sebelum embrio hidup. Pembuluh-pembuluh kapiler baru yang terbentuk melalui angiogenesis kemudian akan bercabang atau membelah menjadi dua dari pembuluh darah asalnya (Ferrara & Alitalo, 1999).
G. Landasan Teori
Kanker merupakan suatu pertumbuhan atau membengkaknya massa dari sel yang abnormal yang bersifat ganas. Sel kanker untuk tumbuh dan berkembang dengan cara mengambil nutrisi dan oksigen dari inang (host) yaitu dengan cara membentuk pembuluh darah baru (angiogenesis) dari pembuluh darah baru yang sudah ada. Menghambat proses angiogenesis dari sel kanker akan menyebabkan sel kanker mengalami penghambatan pertumbuhan, kelaparan dan pada akhirnya akan mati. Terapi kanker yang selama ini digunakan adalah agen kemoterapi yang bersifat sitotoksik, terapi ini dianggap kurang spesifik karena selain merusak sel
kanker juga dapat mempengaruhi sel normal yang lain (Hanahan & Weinberg, 2000).
Antiangiogenesis adalah suatu proses penghentian pembentukan pembuluh darah baru. Pada jaringan normal, pembuluh darah baru terbentuk selama pertumbuhan dan perbaikan jaringan, misalnya ketika proses penyembuhan luka, dan selama perkembangan janin di masa kehamilan. Pembuluh darah membawa oksigen dan nutrisi ke jaringan yang diperlukan untuk pertumbuhan dan bertahan hidup. Demikian juga pada kanker. Melalui proses yang kompleks, sel-sel endotel (membentuk pembuluh darah) bisa membelah diri dan tumbuh membentuk pembuluh darah baru. Proses ini disebut angiogenesis dan terjadi pada jaringan sehat maupun pada jaringan kanker (Ribatti et al., 2002).
Buah mengkudu yang sudah banyak dikenal sejak dulu hingga saat ini mengandung zat antikanker. Berdasarkan hasil penelitian, disebutkan bahwa
Morinda citrifolia mengandung komponen bioaktif seperti flavonoid, triterpen, triterpenoid, atrakuinon, dan saponin dalam jumlah yang signifikan. Senyawa flavonoid yang terkandung dalam mengkudu bermanfaat sebagai antioksidan yang terbukti memiliki aktivitas sebagai hepatoprotektif pada uji in vivo. Selain itu, flavonoid yang terkandung dalam tanaman ini juga terbukti mampu mencegah terjadinya kanker.
24
tentang penghambatan inisiasi angiogenik dan gangguan pembuluh darah baru dengan jus dari mengkudu yang terbukti bahwa jus mengkudu memiliki aktivitas antiangiogenesis. Pada penelitian ini dilakukan untuk membuktikan aktivitas antiangiogenesis dari ekstrak buah mengkudu dan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi ekstrak buah mengkudu dengan aktivitas antiangiogenesis.
H.Hipotesis
1. Ekstrak etanol buah mengkudu memiliki aktivitas antiangiogenesis pada CAM) embrio ayam yang diinduksi bFGF.
2. Terdapat hubungan antara konsentrasi ekstrak etanol buah mengkudu dengan aktivitas antiangiogenesis pada CAM embrio ayam yang diinduksi bFGF.
25
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni. Jenis penelitian yang dilakukan termasuk jenis penelitian eksperimental murni yaitu dengan melakukan percobaan pada kelompok perlakuan dan dibandingkan dengan kelompok kontrol. Rancangan penelitian ini menggunakan rancangan lengkap pola searah. Penelitian ini dilakukan secara lengkap, yaitu terdapat kontrol negatif, kontrol positif dan kelompok perlakuan. Pola searah, yaitu dengan memberikan perlakuan yang sama dengan kelompok perlakuan. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Laboratorium Steril Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel utama
a. Variabel bebas berupa konsentrasi ekstrak buah mengkudu . b. Variabel tergantung berupa banyaknya pembuluh darah baru.
2. Variabel pengacau
26
b. Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca dan musim, kelembaban ruangan.
3. Definisi operasional
a. Ekstrak etanol buah mengkudu adalah ekstrak kental yang diperoleh dengan mengekstraksi serbuk kering buah mengkudu seberat 100 g yang kemudian dilarutkan dengan etanol 70% secara maserasi (perendaman) selama ± 24 jam, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner, yang dilapisi kertas saring, sehingga diperoleh filtrat. Lalu hasil penyaringan (filtrat) diuapkan pelarutnya dengan Rotary Evaporator hingga diperoleh ekstrak kental etanol buah mengkudu.
b. Konsentrasi ekstrak etanol buah mengkudu adalah sejumlah (µg/ml) ekstrak etanol buah mengkudu untuk masing-masing perlakuan. Ekstrak etanol buah mengkudu dibuat dengan mengekstraksi sejumlah (gram) buah mengkudu dalam pelarut polar (etanol).
c. Penurunan jumlah pembuluh darah baru adalah kemampuan ekstrak etanol buah mengkudu pada konsentrasi tertentu untuk menurunkan jumlah pembuluh darah baru pada Chorioallantoic membrane terinduksi bFGF d. Pembuluh darah baru adalah serabut-serabut pembuluh darah yang keluar
dari pembuluh darah utama.
C. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan antara lain : ekstrak buah mengkudu, Chorio Allantoic Membrane (CAM) yang berasal dari telur ayam Standard Patogen Free
(SPF) dalam kondisi terinkubasi, larutan bFGF, PBS, kertas payung, paper disc, aqua steril, etanol 96%, etanol 70% teknis, kertas Whatman filter, DMSO 0,2 % (Dimethyl sulfoxide), aquabidest steril, iodium, paper disc berisi ampisilin.
D. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain : oven (merk memmert), ayakan, bejana maserasi, shaker (merk innova 2100), chamber, labu alas bulat, Laminar Air Flow (LAF) (Local), autoklaf (merk KR 40D), incubator (jishampai), lampu, mini drill, gunting, kamera, teropong telur, gunting bengkok, penyedot udara, scalpel, kaca pembesar, gunting bedah dan alat – alat gelas (pyrex), rotary evaporator (merk buchi).
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Untuk memastikan bahan yang digunakan benar-benar ekstrak buah mengkudu, maka sebelumnya dilakukan determinasi terlebih dahulu. Determinasi dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta berdasarkan “Flora of Java”.
2. Preparasi ekstrak etanol buah mengkudu
28
di bawah sinar matahari dengan ditutup kain hitam. Simplisia yang kering kemudian di serbuk menggunakan blender, dan kemudian di ayak dengan ayakan. Simplisa serbuk ditimbang sebanyak 100 gram dan dituang kedalam bejana maserasi. Kemudian ditambah etanol 70% sampai terendam sempurna dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama ± 24 jam. Kemudian disaring dengan kertas Whatman filter dengan corong Buchner. Lalu hasil penyaringan (filtrat) diuapkan pelarutnya dengan Rotary Evaporator hingga diperoleh ekstrak kental etanol buah mengkudu.
3. Sterilisasi alat
Alat-alat yang digunakan untuk uji antiangiogenesis dicuci bersih dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan disterilkan dengan pemanasan basah dalam autoklaf, suhu 121oC selama 15-30 menit.
4. Pembuatan larutan uji dan larutan basic Fibroblast Growth Factor
(bFGF)
a. Preparasi bFGF sebagai induktor angiogenesis. bFGF yang digunakan sebanyak 25 ng/µl yang kemudian diencerkan dengan PBS (PH 7,4) menjadi 1 ng/µl. Dosis tiap telur 10 ng/µl. Preparasi bFGF ini dilakukan secara aseptis di dalam Laminar Air Flow (LAF).
5. Uji angiogenesis
Satu atau beberapa hari sebelum diberi perlakuan telur diinkubasi dalam inkubator laboratorium pada suhu 37oC agar dapat menyesuaikan diri dengan lingkungan barunya. Telur ayam usia 8-9 hari diberikan perlakuan. Tahap awal perlakuan, yaitu dengan membersihkan telur dari kotoran yang menempel di cangkang telur menggunakan alkohol 70%. Telur diberi tanda pada kerabang telur yang meliputi batas ruang udara, lokasi embrio dan daerah yang akan dibuat segiempat (jendela) berukuran 1x1 cm di atas embrio menggunakan pensil. Lokasi embrio diketahui melalui candling menggunakan cahaya lampu pada telur. Kerabang telur pada bagian kutub yang mengandung ruang udara dan kerabang di atas embrio dibersihkan dengan larutan yodium. Selanjutnya pada ruang udara tersebut dibuat lubang kecil dan pada daerah yang dibuat segiempat (jendela) dibuat luka dengan menggunakan mini drill dan scalpel.
Udara dari ruang udara disedot dengan karet penghisap sampai berpindah dari kutub kerabang bagian atas telur. Perlakuan ini dilakukan dengan posisi telur horizontal, di ruang gelap, dan melalui candling, sehingga ruang udara buatan yang terbentuk di atas embrio dapat terlihat.
30
a. Kelompok I adalah telur dengan implantasi paper disc.
b. Kelompok II adalah implantasi paper disc + pelarut (DMSO – aquabidest steril).
c. Kelompok III kelompok kontrol bFGF + pelarut adalah kelompok telur dengan implantasi paper disc termuati bFGF 10 ng + pelarut (DMSO –
aquabidest steril) sebanyak 10µl.
d. Kelompok IV, V dan VI merupakan telur yang digunakan untuk melihat efek penghambatan ekstrak etanol buah mengkudu dengan tiga variasi kadar.
Setelah diberi perlakuan implantasi paper disc sesuai kelompok perlakuan, lubang kecil pada daerah kutub dan lubang segiempat ditutup dengan paraffin yang dicairkan. Kemudian telur diinkubasi pada suhu 37oC dengan kelembaban relatif 60% selama tiga hari atau 72 jam dengan inkubator, kemudian telur dimasukkan ke dalam kulkas selama 24 jam. Telur dibuka (umur 13 hari) dengan cara menggunting cangkang telur menjadi dua bagian dimulai dari cangkang yang dekat dengan rongga udara menggunakan gunting bedah secara hati-hati agar tidak merusak membran korio alantois telur. Setelah itu, membran korio alantois dibersihkan secara hati-hati dengan aquabidest steril. Membran korio alantois yang melekat pada bagian cangkang yang terdapat paper disc diamati secara makroskopik. Pengamatan makroskopis dilakukan secara langsung dan tidak langsung. Pengamatan makroskopik secara langsung dilakukan dengan bantuan kaca pembesar dan dikuantifikasi dengan menghitung jumlah pembuluh darah baru yang terbentuk pada paper disc dan di sekitar paper disc dan secara tidak langsung dengan foto kamera hasil CAM. Pembuluh darah baru yang dihitung,
yaitu pembuluh darah yang tipis pada paper disc dan di sekitar paper disc (Paten, 1978 ; Storer dkk, 1879).
F. Analisis data
Data berupa persentase terbentuknya pembuluh darah baru (angiogenesis) pada CAM dengan ekstrak etanol buah mengkudu. Selanjutnya dihitung sebagai persentase pertumbuhan relatif terhadap kelompok III (kontrol bFGF + pelarut) dengan menggunakan rumus :
% persentase pertumbuhan pembuluh darah = x 100% Keterangan :
a = jumlah pembuluh darah baru rata-rata konsentrasi ekstrak etanol buah mengkudu
b = jumlah pembuluh darah baru rata-rata kontrol bFGF
Untuk % penghambatnya :
% penghambatan = 100% - persentase pertumbuhan relatif terhadap kontrol
Data penelitian uji antiangiogenesis berupa banyaknya pembuluh darah baru pada dan sekitar paper disc yang dianalisis menggunakan analisis satu arah
32
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas anti angiogenesis dari ekstrak buah mengkudu dan untuk mengetahui kekerabatan antara konsentrasi ekstrak buah mengkudu dengan aktivitas antiangiogenesis. Tujuan tersebut dapat tercapai dengan serangkaian pengujian.
A. Hasil Determinasi dan Ekstraksi Buah Mengkudu
Determinasi bahan dilakukan agar bahan tanaman percobaan benar-benar buah mengkudu. Determinasi dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, berdasarkan buku “Flora of Java”. Hasil determinasi terbukti bahwa buah yang digunakan dalam penelitian
adalah jenis Morinda citrifolia. L. Hasil determinasi ditampilkan pada Lampiran 14.
Pembuatan ekstrak etanol buah mengkudu menggunakan metode penyarian yaitu maserasi. Pemilihan metode maserasi karena metode ini efektif untuk menyari senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan atau senyawa yang mudah menguap. Prinsip pelarutan senyawa aktif dengan metode maserasi adalah dinding sel ditembus cairan penyari sehingga cairan penyari masuk ke rongga sel. Senyawa aktif yang dimaksud pada penelitian ini adalah senyawa yang memiliki efek farmakologi. Dengan metode maserasi, cairan penyarian masuk ke dalam sel melewati dinding sel sehingga isi sel akan larut akibat perbedaan konsentrasi
antara larutan dalam sel dan di luar sel. Larutan dengan konsentrasi tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan konsentrasi rendah (proses difusi). Peristiwa tersebut akan terjadi secara berulang-ulang hingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Selanjutnya endapan dipisahkan dan filtrat dipekatkan.
Saat melakukan maserasi juga dilakukan pengadukan. Pengadukan dilakukan agar konsentrasi larutan di luar butir serbuk simplisia rata dan tidak terjadi kejenuhan, sehingga proses osmosis dan difusi akan terus berjalan. Pelarut yang digunakan adalah etanol 70 % yang diharapkan dapat menyari kandungan senyawa aktif pada buah mengkudu. Ekstrak kental yang diperoleh berwarna coklat. Dari serbuk simplisia diperoleh ekstrak kental 15,68 gram, sehingga rendemen ekstrak dihasilkan sebesar 15,68 %.
B. Aktivitas basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) dalam menginduksi
angiogenesis
34
Lingkungan tertutup tersebut relatif konstan karena keberadaan cairan ekstra embrionik dan beberapa membran pembungkus dalam telur ayam berembrio (Evans, 1991).
CAM embrio ayam sendiri merupakan salah satu media yang paling umum digunakan untuk mempelajari respon angiogenesis. Ini karena CAM merupakan suatu membran yang kaya akan pembuluh darah (Ribatti dkk., 1998), sehingga pengamatan terhadap respon angiogenesis akan lebih mudah diamati. Telur ayam berembrio yang dipergunakan untuk uji respon angiogenesis dapat dilakukan setelah terbentuknya CAM pada hari ke-4 (Patten, 1978) dan implantasi ke dalam
CAM dapat dilakukan pada telur berembrio umur 5-16 hari (Knighton dkk., 1977). Berdasarkan hasil uji pendahuluan, implantasi ke dalam CAM dilakukan telur berumur 8 atau 9 hari, karena pada umur tersebut letak rongga udara lebih mudah diamati dengan pembuluh darahnya pun sudah lebih banyak dan lebih jelas. Selain itu menurut penelitian Ariyanti (1999), pembuluh darah CAM yang mulai tumbuh pada telur umur 4 hari lebih sensitif terhadap kerusakan pembuluh darah akibat trauma dari luar, seperti goncangan.
Penelitian ini menggunakan rancangan acak pola searah, setiap telur uji mendapatkan peluang yang sama untuk dimasukkan dalam kelompok tertentu dan hanya mendapatkan satu kali perlakuan. Penelitian ini menggunakan 30 butir telur untuk kelompok kontrol. Untuk kelompok I (paper disc), kelompok II (DMSO –
aquabidest steril) dan kelompok III (bFGF + pelarut). Masing-masing kelompok mendapatkan 10 telur.
Analisis hasil yang dilakukan meliputi pengamatan secara makroskopik. Pengamatan makroskopik dilakukan secara kualitatif dengan membandingkan pertumbuhan pembuluh darah baru pada kelompok uji penghambatan angiogenesis dengan kelompok III (bFGF + pelarut). Pengamatan secara kualitatif dikuantifikasi dengan menghitung jumlah pembuluh darah baru pada (bFGF dan ekstrak buah mengkudu). Pembuluh darah baru adalah pembuluh darah rambut yang keluar dari pembuluh darah utama. Kemampuan ekstrak buah mengkudu sebagai antiangiogenik dilihat dari persentase penghambatan angiogenesis pada
CAM embrio ayam.
Parameter terjadinya angiogenesis baru pada CAM dilihat dari bertambahnya jumlah pembuluh darah baru pada kelompok yang diberi bFGF
dibandingkan dengan kelompok tanpa diberi bFGF. Hal ini dapat dilihat dari hasil penelitian, di mana pengamatan makroskopik pada CAM untuk kelompok I (paper disc) dan kelompok III (bFGF + pelarut) menunjukan adanya perbedaan pertumbuhan pembuluh darah baru di CAM, dan berdasarkan hasil uji tukey
menunjukkan hubungan berbeda bermakna (P < 0,05) (Tabel I dan Tabel IV). Hal ini berarti bFGF meningkatkan pembuluh darah baru pada CAM. Parameter untuk mengetahui apakah pelarut ekstrak (DMSO 0,2 %) mempengaruhi hasil uji antiangiogenesis dengan meningkatkan aktivitas antiangiogenesis dengan cara membandingkan hasil uji antara kontrol pelarut dengan kontrol paper disc. Berdasarkan hasil uji menunjukan jumlah pembuluh darah baru antara kontrol
36
berarti bahwa DMSO 0,2 % tidak memiliki aktivitas antiangiogenesis sehingga tidak mempengaruhi hasil uji.
Pembuluh darah baru yang terbentuk pada CAM akibat induksi oleh bFGF
diamati pada hari ketiga setelah pemberian bFGF. Setelah telur dibuka, kemudian dilakukan pengamatan makroskopik. Hasil pengamatan makroskopik pada kontrol
bFGF + pelarut menunjukan adanya pertumbuhan pembuluh darah baru yang banyak di sekitar paper disc, yang mengarah secara radial menuju paper disc. Pertumbuhan pembuluh darah baru pada kelompok III (kontrol bFGF + pelarut) lebih banyak dibandingkan dengan kelompok I (paper disc) dan kelompok II (kontrol pelarut). Pengamatan makroskopik dan jumlah pembuluh darah baru yang terbentuk pada kelompok kontrol ditampilkan pada Lampiran 5 dan Tabel I.
Tabel I. Jumlah pembuluh darah baru kelompok kontrol paper disc, kontrol pelarut, kontrol bFGF + pelarut dan kelompok perlakuan
Kelompok kontrol N Jumlah pembuluh darah baru X ± SD
Kontrol paper disc 3 14,33 ± 1,15
C. Uji daya hambat ekstrak etanol buah Morinda citrifolia L. terhadap
angiogenesis pada CAM terinduksi bFGF
Respon penghambatan ekstrak etanol buah Morinda citrifolia L. terhadap angiogenesis dapat diamati pada kelompok telur kelompok IV, V dan VI dengan
konsentrasi 100, 150 dan 225 µg/ml. Pemberian larutan dengan konsentrasi tersebut berdasarkan pada penelitian penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa ekstrak buah mengkudu memiliki Inhibitory Concentration = IC50 terhadap COX-2 sebesar 150 µg/ml (Rachel dkk, 2003).
Untuk pengamatan makroskopik CAM pada kelompok perlakuan ekstrak etanol buah mengkudu menunjukan penurunan jumlah pertumbuhan pembuluh darah baru dibandingkan dengan kelompok III (kontrol bFGF - DMSO - aquabidest steril). Urutan jumlah pertumbuhan pembuluh darah dari terbanyak yaitu kelompok perlakuan ekstrak etanol buah mengkudu dengan konsentrasi 100, 150 dan 225 µg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak etanol buah mengkudu yang digunakan semakin sedikit jumlah pertumbuhan pembuluh darah baru. Hal ini dapat dilihat pada Lampiran 5 dan Tabel I.
Persentase pembuluh darah baru masing-masing kelompok perlakuan ekstrak etanol buah mengkudu dibandingkan dengan persentase pembuluh darah baru kelompok kontrol III (bFGF – DMSO – Aquabidest Steril) untuk menghitung respon angiogenesis dan persentase penghambatan angiogenesisnya.
Hasil perhitungan menunjukan bahwa pada konsentrasi terkecil yaitu 100 µg/ml,
diperoleh persentase penghambatan terkecil yaitu sebesar 12,86 %. Konsentrasi 150 µg/ml persentase penghambatannya sebesar 37,17%. Sedangkan persentase
penghambatan konsentrasi terbesar ada pada konsentrasi 225 µg/ml dengan angka
38
ekstrak buah mengkudu yang digunakan, maka persentase penghambatannya akan semakin besar.
Tabel II. Persentase penghambatan angiogenesis dengan varian konsentrasi ekstrak etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia. L )
Kelompok perlakuan n Persentase penghambatan angiogenesis (%)
Konsentrasi 100 µg/ml 3 12,86
Konsentrasi 150 µg/ml 3 37,17
Konsentrasi 225 µg/ml 3 50,03
Gambar 2. Persentase penghambatan angiogenesis
Dengan adanya kenaikan kadar ekstrak maka pembuluh darah pada CAM
semakin berkurang, baik dalam paper disc maupun di daerah sekitar paper disc. Data yang diperoleh kemudian diuji statistik dengan menggunakan analisis satu arah Anova yang kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk melihat adanya perbedaan bermakna antar kelompok perlakuan. Terlebih dahulu dilakukan uji normalitas dengan (P > 0,05) dan taraf kepercayaan 95%. Dari uji normalitas yang dilakukan, maka diperoleh data sebagai berikut : kelompok I (paper disc) 0,766, kelompok II (kontrol pelarut) 1,000, kelompok III (kontrol bFGF + pelarut) 0,766
dan untuk ekstrak etanol buah mengkudu 100; 150; dan 225 µg/ml berturut-turut
adalah 0,991; 0,991 dan 0,766, bahwa data yang diperoleh terdistribusi normal (P > 0,05). Hasil uji statistik normalitas dapat dilihat pada Lampiran 6.
Kemudian dilanjutkan dengan uji homogenitas di mana data dikatakan homogen apabila (P > 0,05). Hasil yang didapat dari uji homogenitas menunjukkan bahwa data mempunyai varian yang homogen dengan hasil 0,179, sehingga analisis statistik dapat dilanjutkan dengan uji Tukey. Dari hasil uji Tukey
diperoleh data sebagai berikut : Terdapat perbedaan yang bermakna (P < 0,05) antara kelompok kontrol bFGF + pelarut dengan kelompok perlakuan ekstrak etanol buah mengkudu pada konsentrasi 2 dan konsentrasi 3, namun antara kontrol bFGF + pelarut dengan konsentrasi 1 menunjukan berbeda tidak bermakna (P > 0,05). Hal ini berarti bahwa ekstrak etanol buah mengkudu memiliki aktivitas antiangiogenesis pada konsentrasi 2 dan konsentrasi 3.
40
Tabel III. Matriks signifikasi % penghambatan angiogenesis (P < 0,05) Kelompok Kontrol bFGF
Tanda * : menunjukan berbeda bermakna pada level 0,05
0
Gambar 3. Diagram batang rata-rata perbandingan jumlah pembuluh darah antarkelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol Morinda citrifolia L.
Secara umum inhibitor angiogenesis adalah obat yang mampu menghambat pertumbuhan pembuluh darah baru (angiogenesis). Penghambatan pembuluh darah baru tersebut diharapkan dapat menghentikan suplai oksigen dan
nutrien ke sel tumor (MacDonald, 2003). Kemungkinan titik tangkap antiangiogenesis dari senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol buah mengkudu adalah sebagai berikut.
1. Menghambat secara langsung sel endothelial
Sel endothelial adalah sel yang membentuk dinding pembuluh darah, yang merupakan sumber pembuluh darah baru (MacDonald, 2003). Untuk mendukung pertumbuhan sel kanker memerlukan angiogenesis, dimana proses angiogenesis itu tergantung pada sel endothelial.
Senyawa polifenol dalam anggur yaitu resveratrol diketahui mampu menghambat pertumbuhan kapiler sel endothelial dan senyawa polifenol yang terkandung dalam daun tanaman cangkring Erythrina fusca Lour, juga mampu menghambat pertumbuhan kapiler sel endothelial, sehingga kemungkinan kandungan polifenol (flavonoid) dan antrakuinon (damnachantal) dalam ekstrak etanol buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) memiliki aktivitas yang sama dalam proses penghambatan pertumbuhan kapiler sel endothelial, di mana senyawa tersebut mampu menghambat fosforilasi dari mitogen active protein kinase (MAP kinase) terinduksi bFGF. MAP kinase merupakan komponen yang penting dalam jalur signal proliferasi sel endotel untuk pembentukan pembuluh darah baru.
2. Menghambat faktor pertumbuhan
42
kemampuan menginduksi pembuluh darah yang ada di sekeliling sel tumor tersebut (MacDonald, 2003).
Pada penelitian ini faktor pertumbuhan berupa bFGF diinduksi dari luar CAM. Fibroblast Growth Factor (FGF) dikenal sebagai stimulator yang poten untuk proliferasi dan angiogenesis pembuluh darah sel endothelial. Proses signal transduksi dimulai dengan adanya rangsangan dari luar yang berupa faktor pertumbuhan, dalam hal ini berupa bFGF. Basic Fibroblast Growth Factor
(bFGF) selanjutnya akan berinteraksi dengan sel endothelial melalui reseptor FGF tirosin kinase dan heparin sulfat proteoglikan (HAPGs) yang ada dipermukaan matriks ekstraseluler. Reseptor akan menyampaikan signal ke protein di sitoplasma (Ribatti dkk, 1999; Weinberg, 1996).
Menurut Tosetti dkk. (2002) flavonoid mampu mengurangi angiogenesis melalui mekanisme penghambatan reseptor tirosin kinase. Senyawa flavonoid yang kemungkinan terkandung dalam ekstrak etanol buah mengkudu kemungkinan mampu menghambat bFGF, sehingga stimulasi bFGF tidak sampai ke reseptor di permukaan sel. Akibatnya bFGF tidak dapat ditangkap oleh reseptor sehingga terjadi ikatan antara bFGF dengan reseptor dan aktivitas proliferasi pun tidak terjadi, sedangkan menurut Thararat nualsnit et al., (2012) (dalam jurnal Aruma, et al., 2013), mengatakan bahwa ekstrak mengkudu mengandung sebuah antrakuinon (damnachantal). Adanya kandungan antrakuinon pada ekstrak buah mengkudu yang memiliki aktivitas dalam mengubah fungsi sel yang abnormal menjadi normal dan juga berpotensi sebagai antikanker karena sifatnya sebagai
antiangiogenesis (menghambat pembentukan pembuluh darah baru pada sel kanker).
3. Penghambatan terhadap COX-2
Ekstrak etanol buah mengkudu kemungkinan mampu menghambat COX-2 pada CAM terinduksi bFGF. Sel endothelial yang diaktifkan/dirangsang oleh
bFGF akan memacu COX-2 pada sintesis sejumlah besar prostaglandin (PG). Prostaglandin mempunyai kemampuan untuk mempromosikan proliferasi sel kapiler endothelial, sehingga sel endothelial akan membentuk pembuluh darah baru (angiogenesis). Penghambatan terhadap COX-2 akan mengurangi secara poten proliferasi sel endothelial, karena produksi PG menjadi terlambat. Akibatnya sel endothelial tidak bisa mengalami angiogenesis.
44
angiogenesis yang dihasilkan oleh induksi bFGF oleh senyawa flavonoid, antrakuinon dan alkaloid buah mengkudu (Elkin dkk, 2000).
45
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A.Kesimpulan
Berdasarkan hasil yang diperoleh dan analisis statistik yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan :
1. Pemberian ekstrak etanol buah mengkudu dengan konsentrasi 150, dan 225 µg/ml mempunyai aktivitas antiangiogenesis pada CAM.
2. Tidak ada hubungan antara peningkatankonsentrasi ekstrak etanol buah mengkudu dengan aktivitas antiangiogenesis pada CAM embrio ayam yang diinduksi bFGF
B.Saran
1. Identifikasi dan isolasi senyawa murni pada buah mengkudu sebagai antiangiogenesis, sehingga bisa diketahui mekanisme penghambatannya secara spesifik.
46
DAFTAR PUSTAKA
Ariyanti, T., 1999, Penggunaan Model Tumor Angiogenesis faktor untuk Deteksi Biologis Karsinogenesis Paru Serviks Uterus Mencit (Mus musculus) yang Diinduksi dengan Benzo(a)piren, Tesis, Program Pasca Sarjana UGM, Jogjakarta.
Backer and Brink, V.B., 1965, Flora of Java, Wolters Mood Hoff N. V., Netherlands, pp 167-173
Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2010, Acuan Sediaan Herbal, 5 (1), Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI, pp. 6-7.
Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2005, Standarisasi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia, Salah Satu Tahapan Penting dalam Pengembangan Obat Asli Indonesia, 6, Badan Pengawasan Obat dan Makanan RI, pp. 5.
Bergers, G., Hanahan, D., 2008, Modes of resistance to anti-angiogenic therapy.
Nat Rev Cancer 8: 592–603.
Bestari, J., Parakkasi. A., and Akil, S., 2005, Pengaruh pemberian tepung daun mengkudu (Morinda citrifolia. L) yang direndam air panas terhadap penampilan ayam boiler, Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner, 704.
Bosman, F.T., 1999, Aspek-aspek Fundamental Kanker, In Van de Velde, C.J.H., Bosman, F.T., Wagner, D.J.Th.(Eds)., Onkology, diterjemahkan oleh Arjono, Edisi kelima, Panitia Kanker RSUD DR Sardjito, Jogjakarta, 3-10
Djauhariya, Endjo, 2003, Mengkudu (Morinda citrifolia L.) Tanaman Obat Potensial, Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat. Pengembangan Teknologi TRO, 15(1) : 1-16.
Djauhariya, E., Raharjo, M., dan Ma‟un, 2006, Karakterisasi Morfologi dan Mutu Buah Mengkudu. Buletin Plasma Nutfah, 12(1) : 1-8.
Eliceiri, B.P., and Cheresh, D.A., 1999, The role of αv Integrins During Angiogenesis : Insight Into Potential Mechanism of Action and Clinical Development, J., Clint. Invest, vol 103 : 1227-1230.
Elkin, M. dkk., 2000, “Halofuginone: a potent inhibitor of critical steps in angiogenesis progression”, The FASEB Journal, 14, 2477-2485.
Evans, C.W., 1991, The Metastatic Cell, Edisi pertama, Champman and Hall, London, pp. 191-289.
Folkman, J., 1971, Tumour Angiogenesis: Therapeutic Implications, New England J. Medicine, 285(21); 1182-1186.
Folkman, J, 1996, Fighting Cancer by Attaching its Blood Supply, Scientific American 19: 116-119.
Ferrara, N., and Alitalo, K., 1999, Clinical Application of Angiogenic Growth Factors and Their Inhibitor, Nature Medicine, 5 (12) : 1359-1364.
Gajovic, S., and Gruss, P., 1988, Differentiation oh The Mouse Embryoid Bodies Grafted on The Chariallantoic Membrane oh The Chick Embryo, Int.J. Dev. Biol., 42: 225-228.
Giavazzi, R., Albini, A., Bussolino, F., DeBraud, F., Presta, M., Ziche, M., Costa, A., 2000, The biological basis for antiangiogenic therapy (meeting report),
European Journal of Cancer., 36: 1913-1918
Grant, B,. 2008, Medical Nutrition Therapy for Cancer Prevention, Treatment, and Recovery. Di dalam: Mahan LK, Stump SE, editor. Krause’s Food,
Nutrition & Diet Therapy. USA: Saunders Elsevier, pp. 25.
Hanahan, D., and Weinberg, R.A., 2000, The Hallamarks of Cancer, Cell, Cell
Hiramatsu, Tomonori, Imoto, Masaya, Koyano, Umezawa, Kazuo, 1993, Induction of normal Phenotypes in Ras-Transformed cell by Damnacanthal from Morinda Citrifolia.Cancer Letters. 73 (3) : 161-166.
Hirazumi A, Furusawa E., 1999, An immunomodulatory polysacchariderich substance from the fruit juice of Morinda citrifolia (noni) with antitumour activity. Phytother Res. 13(5):380-387.
Kerbel, R., Folkman, J., 2002, Clinical Translation of Angiogenesis Inhibitors,
Nature Cancer Rev., 2: 727-739.
