PENETAPAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE KJELDAHL
1. Tujuan Percobaan
- Mahasiswa dapat melakukan analisis kadar protein dalam suatu bahan pangan - Mahasiswa dapat mengetahui kadar protein dalam bahan
2. Peralatan dan Bahan
- Pemanas Kjeldahl lengkap yang dihubungkan dengan pengisap uap aspirator - Labu Kjeldahl berukuran 30 ml / 50 ml
- Alat destilasi lengkap dengan erlenmeyer berpenampung berukuran 125 ml - Buret 25 ml/50ml
- Neraca analitik dengan ketelitian ± 0,1 - Tepung terigu cakra
3. Dasar Teori
Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh karena zat ini disampng berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur.
Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur C,H,O dan N. Senyawa ini digunakan terutama untuk pembentukan dan regenerasi daripada jaringan-jaringan yang rusak, dapat berfungsi sebagai enzim, antibodi dan merupakan bagian dari cairan tubuh seperti darah, susu dan lain-lain.
Protein memiliki beberapa sifat yang besar sekali pengaruhnya terhadap bahan makanan seperti:
- Perbedaan rasa dan tekstur dari berbagai jenis daging (ayam,sapi, kambing dan sebagainya)
- Konfigurasi protein dapat diubah dengan perlakuan fisik maupun kimia, misalnya putih telur yang terdenaturasi oleh pemanasan air susu akan menghasilkan crude dengan penambahan asam
- Protein dapat mengalamai degradasi yaitu pemecahan molekul kompleks menjadi molekul yang lebih sederhana. Hasil degradasi protein berbentuk sebagai berikut: protease-pepton-polipeptida-peptida-asam amino-amoniak-unsur N
Kadar protein dalam penetapan ini didefinisikan sebagai senyawa nitrogen yang terdapat dalam contoh diubah menjadi ammonium sulfat, ammonia yang dihasilkan dari
penambahan natrium hidroksida ( NaOH) yang didestilasi diikat suatu asam, kemudian kadar nitrogen yang diperoleh dikalikan suatu angka faktor.
Penetapan protein berdasarkan oksidasi bahan-bahan berkarbon dan konversi nitrogen menjadi ammonia. Selanjutnya amonia bereaksi menjadi basa dan amonium sulfat. Larutan dibuat menjadi basa dan amonia diuapkan untuk kemudian diserap dalam larutan asam borat. Nitrogen yang terkandung dalam larutan dapat ditentukan jumlahnya dengan titrasi menggunakan HCL 0,02 N. Kemudian kadar nitrogen yang diperoleh dikalikan suatu angka faktor.
Pereaksi
1. Asam sulfat pekat, berat jenis 1,84 2. Air raksa oksida
3. Kalium sulfat
4. Larutan natrium hidroksida-natrium tiosulfat ( Larutkan 60 gr NaOH dan 5 gr Na2S2O3. 5 H2O dalam 1 liter)
5. Larutan asam borat jenuh 6. Larutan asam klorida 0,02 N
7. Larutan indikator ( campuran 2 bagian metil red 0,2 % dalam alkohol dan 1 bagian metilen blue 0,2 % dalam alkohol)
Dasar Teori Tambahan
Protein merupakan suatu zat makanan yang amat penting bagi tubuh., karena zat ini di samping berfungsi sebagai bahan baker dalam tubuh juga berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur C,H,O dan N yang tidak di miliki oelh lemak dan karbohidrat. Molekul protein mengandung pula fosfor, belerang, dan ada jenis protein yang mengandung unsure logam seperti besi dan tembaga.
Sebagai zat pembangun protein merupakan bahan pembentuk jaringan-jaringan baru yang selalu terjadi dalam tubuh. Pada masa pertumbuhan proses pembentukan jaringan terjadi secara besar-besaran, pada masa kehamilan droteinlah yang membenuk jaringan janin dan pertumbuhan embrio. Protein juga mengganti jaringan tubuh yang rusak dan yang di rombak. Fungsi utama protein bagi tubuh ialah untuk membentuk jaringan baru dan mempertahankan jaringan yang telah ada.
Protein dapat juga di gunakan untuk bahan baker apabila keperluan energi tunbuh tidak terpenuhi oleh karbohidrat dan lemak. Protein ikut pula mengatur berbagai proses tubuh baik langsung maupun tidak langsung dengan membentuk zat-zat pengatur proses dalam tubuh. Protein mengatur keseimbangan cairan dalam jaringan dan pembuluh darah, yaitu dengan menimbulkan tekanan osmotic koloid yang dapat menarik cairan dari jaringan ke dalam pembuluh darah. Sifat atmosfer protein yang yapat bereaksi dengan asam dan basa, dapat mengatur keseimbangan asam-basa dalam tubuh.
Protein dalam tubuh manusia, terutama dalam sel jaringan, bertindak sebagai bahan membrane sel, dapat membentuk jaringan pengikat misalnya kolagen dan elastin, serta membentuk protwin yang inert seperti rambut dan kuku. Di samping itu protein yang bekerja sebagai enzim, bertindak sebagai plasma (albumin), membentuk antibody, membentuk komplek dengan molekul lain, serta dapat bertindak sebagai bagian sel yang bergerak. Kekurangan protein dalam waktu lama dapat menggaggu berbagai proses dalam tubuh dan menurunnkan daya tahan tubuh terhadap penyakit.
Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini telah banyak mengalami modifikasi. Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek. Metode ini kurang akurat bila diperlukan pada senyawa yang mengandung atom nitrogen yang terikat secara langsung ke oksigen atau nitrogen. Tetapi untuk zat-zat seperti amina, protein,dan lain – lain hasilnya lumayan.
Cara Kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah kadar nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,25, diperoleh nilai protein dalam bahan makanan itu. Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikut: 5,95, 5,71, dan 5,83. Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen.
Prinsip cara analisis Kjeldahl adalah sebagai berikut: mula-mula bahan didestruksi dengan asam sulfat pekat menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn. Amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan bantuan indikator. Cara Kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara, yaitu cara makro dan semimakro.
1. Cara makro Kjeldahl digunakan untuk contoh yang sukar dihomogenisasi dan besar contoh
1-3 g.
2. Cara semimikro Kjeldahl dirancang untuk contoh ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari
bahan yang homogen.
Cara analisis tersebut akan berhasil baik dengan asumsi nitrogen dalam bentuk ikatan N-N dan N-O dalam sampel tidak terdapat dalam jumlah yang besar. Kekurangan cara analisis ini ialah bahwa purina, pirimidina, vitamin-vitamin, asam amino besar, kreatina, dan kreatinina ikut teranalisis dan terukur sebagai nitrogen protein. Walaupun demikian, cara ini kini masih digunakan dan dianggap cukup teliti untuk pengukuran kadar protein dalam bahan makanan.
Analisa protein cara Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan yaitu proses destruksi, proses destilasi dan tahap titrasi :
1. Tahap destruksi
2. Tahap destilasi
3. Tahap titrasi
%N = ml NaOH blanko – ml NaOH sampel × N. HCl × 14,008 × 100% Gram bahan x 1000
Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan.
Kadar protein (%) = % N x faktor konversi.
Tabel Nilai F aktor K o rek si S ampel Pada Bahan Pangan :
N o
Bahan Pangan Faktor Koreksi
1 Sereal 5,7 2 Roti 5,7 3 Sirup 6,25 4 Biji-bijian 6,25 5 Buah 6,25 6 Beras 5,95 7 Susu 6,38 8 Kelapa 5,20 9 Kacang Tanah 5,46
Tiga Tahapan dalam analisa protein dengan metode Kjeldahl: a. Proses destruksi (Oksidasi)
Tahapan pertama penentuan kadar protein ini yaitu destruksi, destruksi protein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin terjadi pada struktur sekunder dan tersier protein. Sampel g ditimbang, kemudian ditambahkan HgO dan K2SO4 sebagai katalis.
Destruksi merupakan proses pengubahan N protein menjadi ammonium sulfat. Proses ini berlangsung selama sampel yang ditambah dengan katalisator direaksikan dengan H2SO4
pekat dan dididihkan di atas pemanas labu Kjeldahl. Penambahan asam sulfat dilakukan dalam ruang asam untuk menghindari S yang berada di dalam protein terurai menjadi SO2
yang sangat berbahaya. Setelah penambahan asam sulfat larutan menjadi keruh. Asam sulfat pekat berfungsi untuk mendestruksi protein menjadi unsur-unsurnya, sedangkan katalisator berfungsi untuk mempercepat proses destruksi dan menaikkan titik didih asam sulfat. Tiap 1 gram K2SO4 menaikkan titik didih 30C.
Dari proses ini semua ikatan N dalam bahan pangan akan menjadi ammonium sulfat (NH4SO4) kecuali ikatan N=N; NO; dan NO2. Ammoniak dalam asam sulfat terdapat dalam
bentuk ammonium sulfat. Pada tahap ini juga menghasilkan CO2, H2O, dan SO2 yang
terbentuk adalah hasil reduksi dari sebagian asam sulfat dan menguap. Reaksi yang terjadi selama destruksi:
HgO + H2SO4 → HgSO4 + H2O 2HgSO4 → Hg2SO4 + SO2 +2On Hg2SO4 + 2H2SO4 → 2HgSO4 + 2H2O + SO2 (CHON) + On + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 + SO2 Katalisator (Sudarmadji, 1996)
Proses pemanasan dilakukan ± 2 jam sampai larutan jernih.Larutan yang jernih menunjukkan bahwa semua partikel padat bahan telah terdestruksi menjadi bentuk partikel yang larut tanpa ada partikel padat yang tersisa. Larutan jernih yang telah mengandung senyawa (NH4)2SO4 ini kemudian didinginkan supaya suhu sampel sama dengan suhu luar
sehingga penambahan perlakuan lain pada proses berikutnya dapat memperoleh hasil yang diinginkan.
b. Proses Destilasi
Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3). Prinsip
destilasi adalah memisahkan cairan atau larutan berdasarkan perbedaan titik didih. Dari hasil destruksi protein, labu destruksi didinginkan kemudian dilakukan pengenceran dengan penambahan aquades. Pengenceran dilakukan untuk mengurangi kehebatan reaksi bila ditambah larutan alkali. Larutan dijadikan basa dengan menambahkan NaOH 60%, lalu corong ditutup dan ditambahkan aquades ± setengah bagian. Sampel harus dimasukkan terlebih dahulu kedalam alat destilasi sebelum NaOH, karena untuk menghindari terjadinya superheating. Fungsi penambahan NaOH adalah untuk memberikan suasana basa karena reaksi tidak dapat berlangsung dalam keadaan asam
Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh larutan asam standar. Untuk menampung NH3 yang keluar, digunakan asam borat dalam erlenmeyer dan telah
ditambahkan indikator Toshiro (Metil Merah + Metil Biru), menghasilkan larutan berwarna biru tua. Indikator ini digunakan untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebih. Hasil destilasi (uap NH3 dan air) ditangkap oleh larutan H3BO3 yang terdapat dalam labu
erlenmeyer dan membentuk senyawa (NH4)3BO3. Senyawa ini dalam suasana basa akan
melepaskan NH3. Agar kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung
semua N sudah tertangkap oleh asam borat dalam labu erlenmeyer atau hasil destilasi tidak merubah kertas lakmus merah serta menghasilkan larutan berwarna hijau jernih. Ujung selang dibilas dengan aquades, agar tidak ada ammonia yang tertinggal di selang.
Reaksi yang terjadi:
(NH4)SO4 + NaOH Na2SO4 + 2 NH4OH
2NH4OH 2NH3 + 2H2O
4NH3 + 2H3BO3 2(NH4)2BO3 +H2
c. Proses Titrasi
Titrasi merupakan tahap akhir pada penentuan kadar protein dalam bahan pangan ini. Banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia (N) dapat diketahui dengan volume HCl yang dibutuhkan destilat. Titik akhir titrasi dihentikan sampai larutan berubah dari hijau ke biru (kembali ke warna awal). Selisih jumlah titrasi blanko dan sampel merupakan jumlah ekuivalen nitrogen.
4. Prosedur Percobaan
- Menimbang sejumlah sampel 1 gr, memindahkan ke dalam labu Kjeldahl. - Menambahkan 1,9 ± 0,1 gr K2SO4, 40 ± 10 mg HgO dan 12,0± 0,1ml H2SO4.
- Menambahkan beberapa butir batu didih. Memanaskan sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijau-hijauan. Melakukan dalam lemari asam menggunakan alat dekstruksi dengan unit pengisapan asap
- Mendinginkan, menambahkan sejumlah air kira-kira 30-50 ml secara perlahan-lahan ( Hati-hati tabung menjadi panas kemudian didinginkan)
- Memindahkan isi labu ke dalam alat destilasi. Mencuci dan membilas labu 5-6 kali dengan 1-2 ml air, memindahkan air cucian ini ke dalam alat destilasi
- Meletakkan erlenmeyer 125 ml yang berisi 5 ml larutan H3BO3 dan 2 tetes
indikator dibawah kondensor. Ujung tabung kondensor harus terendam di dalam larutan H3BO3
- Menambahkan 8-10 ml larutan NaOH- Na2S2O3, kemudian melakukan destilasi
sampai tertampung destilat ke dalam erlenmeyer
- Membilas tabung kondenser dengan air dan tampung bilasannya dalam erlenmeyer yang sama
- Mengencerkan isi erlenmeyer sampai kira-kira 50 ml kemudian menitrasi dengan HCL 0,02 N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Melakukan juga penetapan blanko
