Genetic characteristic of protein membran of avian influenza viruses H5N1 subtype

(1)

Karakter Genetik Protein Membran Virus Avian Influenza

Subtipe H5N1

N.L.P.

I

NDI

D

HARMAYANTI

1

,

D.A.

H

EWAJULI

1

,

A.

K

R

ATNAWATI

1

,

R.

I

NDRIANI

1

dan D

ARMINTO

2

1

Balai Besar Penelitian Veteriner JL RE Martadinata 30, Bogor

2

Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan JL Raya Pajajaran, Bogor

(Diterima dewan redaksi 26 Juli 2010)

ABSTRACT

D

HARMAYANTI

,

N.L.P.I.,

D.A.

H

EWAJULI

,

A.

R

ATNAWATI

,

R.

I

NDRIANI

and

D

ARMINTO

. 2010. Genetic characteristic of protein

membran of avian influenza viruses H5N1 subtype.

JITV

15(3): 231-239.

In 2006-2008 there were findings about the antigenic drift on AI virus due to vaccination and the AI H5N1 subtype viruses

which was similar to H5N1 viruses in human. The findings indicated that the AI viruses continue and undergoing to mutate and

try to adapt with their environment. The objective of this study to characterize the mutation of recent AI viruses (2009) on the

membran protein namely Hemagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) and Matrix 2 (M2). In this study RT-PCR – sequencing

methods and genetic analysis for the protein membran of AI viruses were used. Result revealed that there were specific mutation

belong to AI 2009 viruses on HA and NA protein such as AI virus mutation in 2008 which isolated from backyard chicken. The

mutations were non synonimous and not caused by immunological pressure. Furthermore, M2 analysis indicated that the viruses

were resistant to amantadine.

Key Words:

Mutation, AI Subtype H5N1 Viruses, Membran Protein

ABSTRAK

D

HARMAYANTI

,

N.L.P.I.,

D.A.

H

EWAJULI

,

A.

R

ATNAWATI

,

R.

I

NDRIANI

dan

D

ARMINTO

. 2010. Karakter Genetik Protein Membran

virus avian influenza subtipe H5N1.

JITV

15(3): 231-239.

Ditemukannya virus AI yang mengalami

antigenic drift

akibat vaksinasi pada tahun 2006, 2007 dan 2008 serta beberapa

virus yang mempunyai kemiripan dengan virus H5N1 pada manusia memperlihatkan virus AI subtipe H5N1 di Indonesia sedang

dan terus bermutasi dan berusaha beradaptasi dengan lingkungannya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakter mutasi

pada tiga protein membran yaitu Hemagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) dan Matrix 2 (M2) pada virus AI subtipe H5N1

yang diisolasi pada tahun 2009. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah propagasi virus pada telur

specific pathogen

free

(SPF) dan karakterisasi dilakukan dengan RT-PCR sekuensing pada tiga protein membran virus AI subtipe H5N1 tahun

2009 yaitu HA, NA dan M2 dan analisis genetika. Hasil penelitian memperlihatkan mutasi spesifik terjadi pada virus AI tahun

2009 yaitu pada gen HA dan pada gen NA seperti yang dimiliki oleh virus AI tahun 2008 asal ayam buras. Virus yang dianalisis

menunjukkan bahwa mutasi yang terjadi bersifat non sinonim dan tidak disebabkan karena tekanan vaksinasi. Enam virus tahun

2009 yang dianalisis juga menunjukkan resisten terhadap amantadin yang ditunjukkan oleh adanya mutasi pada protein M2.

Kata Kunci

: Mutasi, Virus AI Subtipe H5N1, Protein Membran

PENDAHULUAN

Virus influenza adalah virus yang mempunyai

materi genetik RNA untai tunggal berpolaritas negatif

dengan genom bersegmen. Virus influenza A da B

mempunyai delapan segmen, sedangkan virus influenza

C mempunyai tujuh segmen (M

CGEOCH

et al.,

1976;

D

ESSELBERGER

et al

., 1980). Segmen-segmen tersebut

secara bebas diselubungi oleh nukleoprotein dan

dihubungkan dengan polimerase kompleks. Partikel

virus terdiri dari RNA viral (vRNA), Nukleoprotein

(NP) dan komplek polimerase yang disebut dengan

partikel ribonukleprotein (RNP) (K

ATES

et al

., 1962).

Tiga protein virus terdapat dalam membran adalah dua

glikoprotein permukaan (

spike

) yaitu hemaglutinin

(HA) dan neuraminidase (NA) dan protein

membran-channel

, (M2) (Z

EBEDEE

dan L

AMB

, 1988).

Haemagglutinin (HA) homotrimer yang mempunyai

aktifitas pengikatan terhadap reseptor dan aktivitas fusi

membran yang diaktivasi dengan pH rendah dalam

endosom selama masuknya virus ke dalam sel

(W

HARTON

et al.,

1990). Neuraminidase homotetramer

yang mempunyai aktifitas menghancurkan reseptor

untuk membebaskan virus baru dari permukaan sel

yang terinfeksi (C

OLMAN

, 1989), sedangkan M2 adalah

(2)

membran-spanning

yang juga menyediakan sinyal

untuk transpor ke permukaan sel yang berbentuk

tetramer membran

channel

(S

UGRUE

dan H

AY

, 1991;

P

INTO

et al.,

1992; W

EBSTER

et al

., 1992).

Setelah lebih dari enam tahun bersirkulasi di

Indonesia, karakter molekuler virus AI di Indonesia

telah mengalami perubahan. Virus AI yang diisolasi

dari unggas yang divaksinasi AI mengalami

antigenic

drift

yang cukup ektenstif jika dibandingkan dengan

virus AI yang diisolasi dari ayam yang tidak divaksinasi

AI (D

HARMAYANTI

, 2009). Penelitian D

HARMAYANTI

(2009) mengidentifikasi adanya motif tertentu yang

dimiliki oleh virus AI yang kemungkinan dapat

ditularkan ke manusia. Mutasi yang diamati pada virus

AI sepanjang tahun 2003-2008 adalah mutasi non

sinonim yang terjadi pada gen HA dan M. Penelitian ini

bertujuan untuk mengetahui karakter mutasi pada tiga

protein membran yaitu HA, NA dan M pada virus AI

subtipe H5N1 yang diisolasi pada tahun 2009. Hasil

penelitian diharapkan dapat memberikan gambaran dan

informasi terbaru tentang karakter genetik virus AI

subtipe H5N1 tahun 2009.

MATERI DAN METODE

Virus AI

Virus AI subtipe H5N1 yang digunakan untuk studi

ini dipropagasi pada telur

specific pathogen free

(SPF)

berembrio umur 9-11 hari. Cairan alantois hasil panen

dari telur SPF berembrio yang telah diinfeksi, diuji

lebih lanjut yaitu dikarakterisasi dengan RT-PCR dan

sekuensing.

Ekstraksi RNA dan RT-PCR

Ekstraksi RNA virus yang berasal dari cairan

alantois terinfeksi dilakukan dengan menggunakan

QIAmp RNA viral mini kit (Qiagen) (D

HARMAYANTI

,

2009). Reaksi RT-PCR dilakukan dengan menggunakan

Supercript III one step RT-PCR system (Invitrogen).

Sekuensing DNA

Strategi dan set primer untuk mengamplifikasi gen

HA dan M sesuai dengan H

OFFMAN

(2003); K

OMADINA

(2007, komunikasi pribadi) dan D

HARMAYANTI

(2009).

Fragmen DNA hasil amplifikasi dipurifikasi dengan

QIAquick PCR purification

(Qiagen). Reaksi

sekuensing dilakukan dengan menggunakan reagen Big

Dye Terminator v 3.1 (Applied Biosystem) dan DNA

sekuensing dilakukan dengan mesin Genetic Analyzer

3130 (Applied Biosystenm). Hasil sekuensing dianalisis

dengan menggunakan Finch TV

(http://www.geospiza.com/Products/finchtv.shtml) dan

pembuatan

multiple aligment

dengan menggunakan

BioEdit, versi 7

(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).

Pohon filogenetika dihasilkan dengan MEGA 4

(http://www.megasoftware.net).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sebanyak enam virus yang berhasil dianalisis

menunjukkan bahwa hasil analisis genetika pada gen

HA1 memperlihatkan bahwa virus AI tahun 2009

mempunyai mutasi asam amino yang tidak dimiliki oleh

virus AI tahun sebelumnya (2003-2008). Mutasi asam

amino terjadi pada urutan 9 yaitu asam amino A

menjadi S (A9S). Mutasi lainnya adalah asam amino

pada urutan 69 yaitu asam amino R menjadi K (R69K)

dan asam amino R menjadi M pada posisi 205

(R205M). Mutasi yang terjadi adalah mutasi non

sinonim (Gambar 1). Protein HA virus influenza

mempunyai glikoprotein trimerik yang mempunyai 3-9

N-linked glycosylation sequons

perunit, tergantung pada

galur virus (S

CHULZE

, 1997). Pada penelitian ini virus

mempunyai sebanyak 7 tempat glikosilasi pada protein

HA1 yaitu pada posisi 11, 23, 84, 154, 165, 193 dan

286 (Gambar 1). Hal berbeda jika dibandingkan dengan

virus yang mengalami

antigenic drift

yaitu virus yang

Tabel 1

. Isolat AI subtipe H5N1 yang digunakan pada penelitian

Nama Isolat

Patogenesitas Asal

sampel

A/Chicken/West Java/Bgr-Cmgg/2009

Mortalitas tinggi

Wabah unggas, disekitar kasus manusia terinfeksi H5N1

A/Chicken/West Java/Smi-Dmn/2009 Mortalitas tinggi

Wabah unggas

A/Chicken/West Java/Smi-Endo/2009 Mortalitas tinggi

Wabah unggas

A/Chicken/West Java/Smi-Mgg/2009 Mortalitas tinggi

Wabah unggas

A/Chicken/West Java/Indramayu-Indr/2009

Mortalitas tinggi

Wabah unggas

(3)

diisolasi dari unggas yang divaksinasi (Smi-Hj18/07,

Smi-Sud1/07, SMI-M1/08, SMI-M6/08, SMI- Biot/08

termasuk virus Pwt-Wij/06 dan Smi-Pat/06) hanya

memiliki sebanyak 4 tempat glikosilasi karena tidak

mempunyai tempat glikosilasi pada posisi 84, 165 dan

193 (D

HARMAYANTI

, 2009). Hasil penelitian ini

menunjukkan bahwa seluruh virus AI 2009 yang

dianalisis tidak mengalami penurunan atau peningkatan

jumlah glikosilasi sehingga kemungkinan tidak

menciptakan populasi virus yang mengalami

peningkatan afinitas terhadap reseptor dan tidak

menghasilkan populasi virus yang lebih tahan terhadap

netralisasi daripada parentalnya (S

CHULZE

, 1997), tidak

seperti halnya virus yang diisolasi dari ayam yang

divaksinasi AI yang telah terbukti lebih tahan terhadap

netralisasi daripada induknya. Berdasarkan sekuen asam

amino pada

cleavage site

HA, enam virus yang

digunakan pada penelitian ini mempunyai rangkaian

asam amino yang menandakan virus termasuk

kelompok

highly pathogenic

dan mempunyai substitusi

pada posisi -6 protein HA1 yaitu Arginin (R)ÆSerin

(S) (Gambar 1). Variasi pada motif dapat terjadi

berkaitan dengan geografi asal isolat, tidak

dihubungkan dengan perubahan virulensi dan infeksi

pada manusia (W

RITTING

C

OMMITTEE

O

F

S

ECOND

W

ORLD

O

RGANIZATION

C

ONSULTATION

, 2008). Virus

yang dianalisis pada penelitian ini tidak mengalami

mutasi pada asam amino posisi 222 dan 224 sehingga

masih mengenal

avian receptor

(

α

2,3) dan belum

mengenal

human receptor

(

α

2,6) (S

TEVENS

et al.,

2006). Substitusi sebuah asam amino pada protein

hemaglutinin dapat mengubah spesifisitas pengikatan

sialyl-linkage

Neu5Ac2-3Gal (Ac2-3) menjadi

Neu5Ac2-3Gal (Ac2-6) atau sebaliknya. Substitusi

Ser205Tyr yang terletak pada antigenik D dari

hemaglutinin virus H3 (jaraknya jauh dari

reseptor

binding site

), menghasilkan perubahan spesifisitas

pengikatan reseptor dari 2-3 ke 2-6. Perubahan

Leu226Gln pada

pocket receptor binding site

juga

mengubah spesifisitas pengikatan reseptor 2-6 ke 2-3.

Perubahan ini sangat penting karena berpengaruh pada

kemampuan infeksi virus pada inangnya. Pada

penelitian ini, dikarenakan virus masih mengenal

avian

receptor

(Ac2-3) sehingga infeksi pada manusia

kemungkinan tertular dari unggas yang terlebih dahulu

terinfeksi virus H5N1.

Pada

multiple alignment

protein NA menunjukkan

kekhasan virus AI 2009 yaitu perubahan asam amino

pada posisi 163 yaitu V menggantikan L (V143L).

Selain itu mutasi juga terjadi pada posisi 189 yaitu asam

amino S digantikan oleh G (S189G), asam amino E

digantikan oleh asam amino K pada posisi 259

(E259K), dan asam amino G menggantikan E (G382E)

(Gambar 2). Tiga mutasi ini serupa dengan virus AI

tahun 2008 yang diisolasi dari ayam buras tanpa

vaksinasi AI yaitu isolat A/Ck/West Java/Smi-Acl/08

dan A/Ck/Banten/Srg-Fadh/08. Pada protein NA, semua

virus H5N1 Indonesia mempunyai delesi 20 asam

amino pada regio

stalk

yaitu pada posisi 48-67. Tempat

glikosilasi pada regio

stalk

dari protein neuraminidase

berperan dalam menjaga struktur tetramer dari protein

(L

UO

et al.,

1993). Semua virus pada penelitian ini tidak

mempunyai tempat glikosilasi pada

stalk

protein

neuraminidase karena delesi di daerah ini, sehingga

pada protein NA hanya memiliki 3 tempat glikosilasi

yaitu pada posisi 88, 146 dan 235. Delesi pada daerah

ini akan meningkatkan retensi virion pada membran

plasma (

M

ATROSOVICH

et al.,

1999).

Mutasi yang terjadi tidak seperti virus yang diisolasi

dari ayam yang divaksinasi AI secara intensif dan tidak

terjadi pada epitop pengenalan antibodi

(D

HARMAYANTI

,

2009), sehingga besar kemungkinan

mutasi yang terjadi bukan akibat tekanan vaksinasi

sehingga asal virus diperkirakan adalah virus yang

bersirkulasi di lingkungan. Mutasi asam amino pada

protein permukaan virus yaitu HA dan NA yang terjadi

pada virus tahun 2009 mengindikasikan bahwa virus

terus berusaha beradaptasi dengan lingkungan

sekitarnya.

Indikasi adanya mutasi pada gen NA adalah hal

baru, karena sebelumnya D

HARMAYANTI

(2009) tidak

menemukan adanya mutasi pada gen NA pada

virus-virus tahun 2003-2008, sehingga paparan mutasi hanya

terbatas pada gen HA saja serta beberapa virus

memperlihatkan mutasi pada gen internal. Hal ini

tentunya sangat menarik karena paparan mutasi pada

virus AI tahun 2009 telah mengakibatkan perubahan

asam amino pada glikoprotein permukaan virus yaitu

Neuraminidase selain Hemagglutinin. Dengan

perkataan lain bahwa hasil penelitian ini

menggambarkan virus AI sedang dan terus bermutasi.

Hasil analisis filogenetika, enam virus 2009 yang

dianalisis pada aras gen HA (Gambar 3) dan NA

(Gambar 4) menunjukkan bahwa virus tahun 2009

membentuk kelompok tersendiri meskipun masih dalam

kelompok besar virus AI subtipe H5N1 asal Indonesia,

dan berbeda dengan kelompok virus yang mengalami

antigenic drift

yang berasal dari flok ayam yang

divaksinasi AI.

Substitusi asam amino tunggal pada asam amino

26(LeuÆPhe), 27 (ValÆAla atau Thr), 30 (AlaÆThr

atau Val), 31 (SerÆAsn atau Arg) dan 34 (GÆE)

dalam domain transmembran M2 diimplikasikan

dengan hilangnya sensitivitas bloker M2 yang

mengakibatkan resisten terhadap amantadin (H

AY

et al.,

1985; P

INTO

et al.,

1992; S

UZUKI

et al.,

2003). Analisis

pada protein M2 memperlihatkan bahwa enam virus

tahun 2009 yang digunakan pada penelitian ini

memiliki substitusi pada asam amino posisi 27 yaitu A

(ValÆAla; V27A) yang menunjukkan virus tersebut

resisten terhadap amantadin (Tabel 2). D

HARMAYANTI

(4)

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

Ck/East Java/BL-IPA/03

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKS

Ck/West Java/1074/03

...L...

MD/Jakarta/DKI-Uwit/04 ...S...

MD/West Java/Bgr-Cw/05

...K...S...

Ck/Jakarta/DKI31/05

...

...K...S...

Ck/West Java/Smi-Hay/05

...T...S...

MD/Jakarta/Sum106/06

...T...S...

Duck/Jakarta/Slmt306/06

...S...

MD/West Java/Bks3/07

...T...S...

Ck/Pessel/BPPVRII/07

...T...S...

Ck/Inhu/BPPVRII/07

...S...

Ck/Jakarta/DKI-Nurs/07

...K.Q...S.T...S...K...R...

Ck/West Java/Smi-Hj18/07

...K.Q...S.T...S...K...R...

Ck/West Java/Smi-Sud1/07

...K.Q...S.T...S...K...R...

Ck/West Java/Smi-Acul/08

...T...S...

Ck/Banten/Srg-Fadh/08

...K...T...S...

Ck/West Java/Smi-M1/08

...N...K.Q...S.T...S...K...R...

...N...K.Q...G...S.T...S...K...R...

Ck/West Java/Smi-Biot/08

.H...N...K.Q...S.T...S...K...R...

Ck/West Java/Bgr-Cmgg/09

...K...T...S...

Ck/West Java/Smi-Dmm/09

...T...L.K...T....D..S...

Ck/West Java/Smi-Emn/09

...E...K...T...S...

Ck/West Java/ Smi-Endo/09

...D...K...T...S...

Ck/West Java/Indramayu/09

...K...T...S...

Ck/West Java/Smi-Mgg/09

...R...K...T...S...

130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

SWSDHEASSGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAIN

...T...L...D...H...

MD/Jakarta/DKI-Uwit/04 ...L.R...NT...A...

...L.SP...T...K...N...

Ck/Jakarta/DKI31/05

...L.R...T...I...

...L.SP...T...K...N...

...L.SP...T...K...I...

Duck/Jakarta/Slmt306/06

...L.SP...NT...K...S...

...L.SP...T...K..K...NEE...I...

...L.SP...K...I...

Ck/Inhu/BPPVRII/07

...L.SP...NT...K...

D...L...L.SP...T...K..K...S.NVE...I....I...H...D...N...T..

D...-...L.SP...TQ...T..I..K..K...I...S.NVE...I....I...T..H...D...N...T..

...A....L.SP...T...K...TI...

...L.SP...T...KT...I...ND....M...I...

D.P...T.-...L.SP...TQ...T..I..K..K...I...S.NVE..KS....SI....I...T..H...D...N...T..

Ck/West Java/Bgr-Cmgg/09

...L.SL...T...KT...I...V....NE....M...I...

...M...L.SP...T...KT...I...NE....M...I...

...L.SP...T...KT...I...NE....M...D..I...S...

Ck/West Java/ Smi-Endo/09

...L.SP...T...KT...I...NE.D..M...I...

...L.SP...T...KT...I...NE....M...I...

...L.SP...T...KT...I...NE....MRN...I...S...

250 260 270 280 290 300 310 320 330 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . .

FESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIA

...

MD/Jakarta/DKI-Uwit/04 ...

...

Ck/Jakarta/DKI31/05

...

...S...

Duck/Jakarta/Slmt306/06

...

...S...

...

Ck/Inhu/BPPVRII/07

...G...

...D...S...

...S...

...D...I...S...

...D....D...I...S...

Ck/West Java/Bgr-Cmgg/09

...D...S...

...S...S...

...D...S...

Ck/West Java/ Smi-Endo/09

...D...S...

...S...

...G...S...

Gambar 1.

Multiple alignment

protein HA1 virus AI subtipe H5N1 tahun 2003-2009

Keterangan:

Tempat glikosilasi ditandai dengan kotak tertutup dan residu asam amino didaerah

cleavage site

HA ditunjukkan dengan

kotak tertutup dengan warna abu-abu. Penomoran asam amino berdasarkan virus BL-IPA/03. Ck : Chicken; MD :

Muscovy duck

(5)

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |

Goose/Guangdong/1/96 MNPNQKIITIGSICMVVGIISLMLQIGNIISIWVSHSIQTGNQHQAEPCNQSIITYENNTWVNQTYVNISNTNFLTEKAVASVTLAGNSSLCPISGWAVHSKDNGIRIGSKGDVFVIREP Ck/East Java/BL-IPA/03 ...I..V...M...S---T....P...R...S... Ck/West Java/1074/03 ...I..V...M...S---...P...R...S... MD/JakartDKI-Uwit/04 ...I..V...M...D...S---.I.N.P...N...R...S... Ck/Banten/Pdgl-Kas/04 ...I..V...M...D...S---.I.N.P...N...R...S... Ck/JakartDKI31/05 ...I..V...M....I...S---...P...R...S... MD/West Java/Bgr-Cw/05 ...AI..V...M...S---...PP...R...N... Ck/West Java/Smi-Hay/05 ...I..V...M...S---...P...R...N... MD/JakartSum106/06 ...I..V...M...S---...P...R...N... Duck/JakartSlmt306/06 ...I..V...M...S---...P...R...N... MD/West Java/Bks3/07 ...I..V...M...K...S---...P...R...N... Ck/Pessel/BPPVRII/07 ...I..V...M...K...S---...P...I...R...N... Ck/Inhu/BPPVRII/07 ...I..V...M...K...S---...P...I...R...N... Ck/JakartDKI-Nurs/07 ...I..V...M...S---...P...R...N... Ck/West Java/Smi-Hj18/07 ...I..V...M..T...S---...P.N...R...N... Ck/West Java/Smi-Sud1/07 ...I..V...M...S---...P.N...R...N... Ck/West Java/Smi-Acul/08 ...AT...I..V...M...K...S---...P...R...N...R... Ck/Banten/Srg-Fadh/08 ...A...I...M...K...S---...P...T...R...N... Ck/West Java/Smi-M1/08 ...I..V...M...S---...S.N..T...R...N... Ck/West Java/Smi-M6/08 ...I..V...M...S---...S.N...R...N... Ck/West Java/Smi-Biot/08 ...I..VG...M...S---...S.N...R...N... Ck/West Java/Smi-Dmn/09 ...I..V...MR...I...K...T.S---...P...R...N... Ck/West Java/Smi-Emn/09 ...I..V...M....I...K...T.S---...P...R...N... Ck/West Java/Smi-Endl/09 ...I..V...M....I...K...T.S---...P...R...N... Ck/West Java/Smi-Mgg/09 ...I..V...M....I...K...T.S---T....P....T...R...N... Ck/West Java/Indramayu/09 ...S...I..V...M...K...T.S---...P...T...R...N...

130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Goose/Guangdong/1/96 FISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFT Ck/East Java/BL-IPA/03 ... Ck/West Java/1074/03 ... MD/JakartDKI-Uwit/04 ... Ck/Banten/Pdgl-Kas/04 ... Ck/JakartDKI31/05 ... MD/West Java/Bgr-Cw/05 ... Ck/West Java/Smi-Hay/05 ... MD/JakartSum106/06 ...N...S..E... Duck/JakartSlmt306/06 ...N...E...K... MD/West Java/Bks3/07 ...E... Ck/Pessel/BPPVRII/07 ...E... Ck/Inhu/BPPVRII/07 ...E... Ck/JakartDKI-Nurs/07 ...E... Ck/West Java/Smi-Hj18/07 ...E... Ck/West Java/Smi-Sud1/07 ...E... Ck/West Java/Smi-Acul/08 ...G...E... Ck/Banten/Srg-Fadh/08 ...G...E... Ck/West Java/Smi-M1/08 ...E... Ck/West Java/Smi-M6/08 ...E... Ck/West Java/Smi-Biot/08 ...E... Ck/West Java/Smi-Dmn/09 ...L...G...E... Ck/West Java/Smi-Emn/09 ...L...G...E...A Ck/West Java/Smi-Endl/09 ...L...G...E...A Ck/West Java/Smi-Mgg/09 ...H...L...G...E...V Ck/West Java/Indramayu/09 ...L...G...E...

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Goose/Guangdong/1/96 VMTDGPSNGQASYKIFKMEKGKVVKSVELNAPNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSPNGAYGVKGFSFKYGNGVWIG Ck/East Java/BL-IPA/03 ...D...M... Ck/West Java/1074/03 ...D...M... MD/JakartDKI-Uwit/04 ...D...M... Ck/Banten/Pdgl-Kas/04 ...D...M... Ck/JakartDKI31/05 ...D...M...A... MD/West Java/Bgr-Cw/05 ...D...M... Ck/West Java/Smi-Hay/05 ...D...M... MD/JakartSum106/06 ...D...M... Duck/JakartSlmt306/06 ...D.T...M... MD/West Java/Bks3/07 ...K...D...M... Ck/Pessel/BPPVRII/07 ...K.D...M... Ck/Inhu/BPPVRII/07 ...D...M... Ck/JakartDKI-Nurs/07 ...D...M.S... Ck/West Java/Smi-Hj18/07 ...D...M.S... Ck/West Java/Smi-Sud1/07 ...D...M.S... Ck/West Java/Smi-Acul/08 ...K...M... Ck/Banten/Srg-Fadh/08 ...K...D...M...L... Ck/West Java/Smi-M1/08 ...D...I...M.S... Ck/West Java/Smi-M6/08 ...D...I...M.S... Ck/West Java/Smi-Biot/08 ...D...I...M.S... Ck/West Java/Smi-Dmn/09 ...K...D...M... Ck/West Java/Smi-Emn/09 ...K...D...M...S... Ck/West Java/Smi-Endl/09 ...K...D...M...S... Ck/West Java/Smi-Mgg/09 ...K...D...D...M... Ck/West Java/Indramayu/09 ...V...K...D...M... 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | Goose/Guangdong/1/96 RTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTGTDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDD Ck/East Java/BL-IPA/03 ...S...G Ck/West Java/1074/03 ...S...G MD/JakartDKI-Uwit/04 ...S...S...G Ck/Banten/Pdgl-Kas/04 ...N...S...G Ck/JakartDKI31/05 ...P...S... MD/West Java/Bgr-Cw/05 ...S...G Ck/West Java/Smi-Hay/05 ...L...S..C... MD/JakartSum106/06 ...S..R..G Duck/JakartSlmt306/06 ...S...G MD/West Java/Bks3/07 ...S...G Ck/Pessel/BPPVRII/07 ...S...G Ck/Inhu/BPPVRII/07 ...S...G Ck/JakartDKI-Nurs/07 ...K...S...G Ck/West Java/Smi-Hj18/07 ...S...G Ck/West Java/Smi-Sud1/07 ...G...S...G Ck/West Java/Smi-Acul/08 ...E...G...S...G Ck/Banten/Srg-Fadh/08 ...E...S...G Ck/West Java/Smi-M1/08 ...S...G Ck/West Java/Smi-M6/08 ...E...S...G Ck/West Java/Smi-Biot/08 ...T...S...G Ck/West Java/Smi-Dmn/09 ...E...S...G Ck/West Java/Smi-Emn/09 ...E...Q...S...G Ck/West Java/Smi-Endl/09 ...E...Q...S...G Ck/West Java/Smi-Mgg/09 ...E...S...G Ck/West Java/Indramayu/09 ...E...S...G

Gambar 2.

Multiple alignment

protein NA virus AI subtipe H5N1 tahun 2003-2009

Keterangan:

Glikosilasi ditandai dengan kotak tertutup. Delesi 20 asam amino ditunjukkan dengan kotak tertutup warna abu-abu.

(6)

A /chicken/Kupang-3-NTT/B P P V6/2004

A /chicken/B angli B ali/B B P V6-1/2004

A /chicken/Jembrana/B P P V6/2004

A /chicken/M angarai-NTT/B P P V6/2004

A /Ck/Indo nesia/B L/2003

A /Chicken/East Java/B L-IP A /2003

A /Ck/Indo nesia/P A /2003

A /Chicken/West Java/HA M D/2006

A /chicken/Indo nesia/11/2003

A /Go o se/Guangdo ng/1/96

A /chicken/Indo nesia/7/2003

A /quail/Tasikmalaya/B P P V4/2004

A /Chicken/West Java/1074/2003

A /Chicken/Jakarta/DKI31/2005

A /Chicken/P adang/B B P VII/2006

A /chicken/Dairi/B P P VI/2005

A /Chicken/M edan/B B P V1-576/2005

A /chicken/Tebing Tinggi/B P P VI/2005

A /Chicken/P idie/B P P V1/2005

A /chicken/Deli Serdang/B P P VI/2005

A /Quail/Central Java/SM RG/2006

A /Chicken/West Java/GA RUT-M A Y/2006

A /Chicken/Indo nesia/M agelang1631-57/2007

A /Chicken/Gunung Kidul/B B VW/2006

A /Indo nesia/6/2005

A /M usco vy Duck/Jakarta/DKI-Uwit/2004

A /M ucso vy duck/West Java/B gr-Cw/2005

A /Chicken/P apua/TA 5/2006

A /Chicken/P apua/TB 1/2006

A /duck/P arepare/B B VM /2005

A /Duck/Jakarta/Slmt306/2006

A /Chicken/Inhu/B P P VRII/2007

A /Chicken/Indo nesia/B angka SelA tan1631-2

A /Chicken/P alembang/B P P V-III/2005

A /Chicken/Way Kanan/B B P VIII/2006

A /Chicken/B andar Lampung/B B P VIII/2006

A /Duck/Indramayu/B B P W109/2006

A /Indo nesia/CDC7/2005

A /Chicken/West Java/Smi-Hay/2005

A /Chicken/West Java/SM I-ENDRI1/2006

A /M ucso vy duck/West Java/B ks3/2007

A /Chicken/B anten/Srg-Fadh/2008

A

/Chicken/West Java/B o go r-Cmgg/2009

A /Chicken/West Java/Smi-Dmn/2009

A /Chicken/West Java/Indramayu-Indr/2009

A /Chicken/West Java/Smi-M gg/2009

A /Chicken/West java/Smi-Emn/2009

A /Chicken/West java/Smi-Endl/2009

A /Quail/Jakarta/JU1/2006

A /Chicken/West Java/TA SIKSOL/2006

A /Indo nesia/5/2005

A /Chicken/West Java/TA SIK1/2006

A /Chicken/West Java/TA SIK2/2006

A /chicken/West Java/TA SIKSOB /2006

A /Chicken/M urao Jambi/B B P V-II/2005

A /Chicken/Indo nesia/P ekenbaru1631-11/200

A /Chicken/Indo nesia/P adang1631-1/2006

A /M usco vy Duck/Jakarta/HA B WIN/2006

A /Chicken/West Java/Smi-A cul/2008

A /M usco vy duck/Jakarta/Sum106/2006

A /Chicken/P essel/B P P VRII/2007

A /Chicken/Indo nesia/Semerang1631-62/2007

A /Swan/Indo nesia/M alang1631-61/2007

A /chicken/West Java/SM I-CSLK-EB /2006

A /Chicken/West Java/SM I-CSLK-EC/2006

A /Chicken/West Java/SM I-P A T/2006

A /Chicken/West Java/P WT-WIJ/2006

A /Chicken/Jakarta/DKI-Nurs/2007

A /Chicken/West Java/Smi-Sud1/2007

A /West Java/Smi-Hj18/2007

A /Chicken/West Java/Smi-B io t/2008

A /Chicken/West Java/Smi-M 1/2008

64

99

75

97

95

99

89

99

92

97

65

66

98

77

94

71

98

75

87

61

89

88

96

87

80

85

61

63

0.05

Virus AI H5N1

tahun 2009

Virus antigenic

drift th. 2006

Virus antigenic drift

th. 2007-2008

Gambar 3

. Filogenetika virus AI subtipe H5N1 pada aras gen HA1

Keterangan:

Virus yang berhasil diisolasi pada penelitian ditandai dengan warna biru. Nukleotida yang dianalisis pada aras gen HA1

(7)

A /Dk/Indo nesia/M S/2004

A /Chicken/East Java/B L-IP A /2003

A /Duck/IB ufeleng/B P P V1/2005

A /Duck/P ali/B B VW/2005

A /Ck/Indo nesia/P A /2003

A /Chicken/Indo nesia/Kulo n1631-47/2006

A /Chicken/Jakarta/DKI31/2005

A /Chicken/West Java/1074/2003

A /M usco vy Duck/Jakarta/DKI-Uwit/2004

A /Chicken/B anten/P dgl-Kas/2004

A /Chicken/Indo nesia/Wates83/2005

A /Duck/M adiun/B B VW1358/2005

A /Turkey/Langkat/B B P V1/2005

A /Chicken/M edan/B B P V1-498/2005

A /Chicken/Karo /B B P V1/2006

A /Chicken/Ro kan Hilli/B P P V11/2005

A /Chicken/P adang/B P P V11/2006

A /Chicken/P aulau Rampang/B P P V11/2006

A /M ucso vy duck/West Java/B gr-Cw/2005

A /Duck/Indramayu/B B VW109/2006

A /Chicken/B andar Lampung/B P P V111/2006

A /Chicken/P alembang/B P P V111/2005

A /Chicken/M urao Jambi/B P P V11/2005

A /Chicken/West Java/Smi-Hay/2005

A /Chicken/Indo nesia/So ppeng1631-71/2007

A /Swan/Indo nesia/M agelang1631-57/2007

A /Chicken/Indo nesia/Lampung1631-23/2006

A /Chicken/P essel/B P P VRII/2007

A /Chicken/Inhu/B P P VRII/2007

A /Chicken/Indo nesia/P ekenbaru1631-11/200

A /Ck/West Java/B ks 2/2007

A /M ucso vy duck/West Java/B ks3/2007

A /Chicken/West Java/Smi-A cul/2008

A /Chicken/B anten/Srg-Fadh/2008

A /Chicken/West Java/Smi-Dmn/2009

A /Chicken/West Java/Indramayu-Indr/2009

A /Chicken/West Java/Smi-M gg/2009

A /Chicken/West java/Smi-Emn/2009

A /Chicken/West java/Smi-Endl/2009

A /Chicken/Indo nesia/Gunung Kidul1631-33/

A /M usco vy duck/Jakarta/Sum106/2006

A /Duck/Jakarta/Slmt306/2006

A /B ird cucak wilis/Jakarta/Walko t 4/2007

A /Chicken/Jakarta/DKI-Nurs/2007

A /Ck/Jakarta/Jakbar-o nh/2007

A /Ck/Jakarta/Walko t 1/2007

A /Chicken/West Java/Smi-Hj18/2007

A /Chicken/West Java/Smi-Sud1/2007

A /Chicken/West Java/Smi-B io t/2008

A /Go o se/Guangdo ng/1/96

A /Ho ng Ko ng/483/1997

A /Ho ng Ko ng/514/97

A /Ho ng Ko ng/542/97

63

99

90

99

93

75

65

90

93

99

90

87

91

74

75

81

84

96

69

70

96

89

79

77

69

0.2

Virus AI H5N1

th 2009

Virus antigenic drift

th. 2007-2008

Gambar 4

. Filogenetika virus AI subtipe H5N1 pada aras gen NA

Keterangan:

Virus yang berhasil diisolasi pada penelitian ditandai dengan warna biru. Nukleotida yang dianalisis pada aras gen NA

adalah posisi 1-1157.

Tabel 2

. Posisi asam amino yang bertanggung jawab terhadap sensitivitas amantadin pada protein M2

Posisi asam amino pada protein M2

Virus

26 27 30 31 34

A/Chicken/West Java/Bgr-Cmgg/2009

L A A S G

A/Chicken/West Java/Smi-Dmn/2009

L A A S G

A/Chicken/West Java/Smi-Endo/2009

L A A S G

A/Chicken/West Java/Smi-Mgg/2009 L A A S G

A/Chicken/West Java/Indramayu-Indr/2009

L A A S G

A/Chicken/West Java/Smi-Emn/2009 L A A S G

(8)

bahwa dari 147 data sekuen asam amino M2 virus

influenza asal Indonesia yang dianalisis, diketahui

bahwa sebanyak 62,58%

a

tau 92 isolat virus influenza

H5N1 di Indonesia telah mengalami resistensi terhadap

amantadin, bahkan 10 virus diantaranya mempunyai

mutasi ganda yaitu pada posisi V27A dan S31N. Data

penelitian pada studi ini memperkuat penelitian

D

HARMAYANTI

et al

(2009) yaitu virus AI subtipe

H5N1 di Indonesia mengindikasikan terdapatnya

peningkatan resistensi terhadap amantadin.

KESIMPULAN

Hasil penelitian menunjukkan bahwa virus AI

subtipe H5N1 yang dianalisis pada penelitian ini

menunjukkan bahwa virus AI di Indonesia terus

bermutasi terutama pada protein membran virus. Mutasi

yang terjadi adalah spesifik pada virus AI tahun 2009

yaitu pada gen HA dan pada gen NA, virus AI tahun

2009 memilki mutasi yang spesifik seperti yang

dimiliki oleh virus AI tahun 2008 asal ayam buras.

Virus yang dianalisis menunjukkan bahwa mutasi yang

terjadi bersifat non sinonim dan tidak disebabkan

karena tekanan vaksinasi. Enam virus tahun 2009 yang

dianalisis juga menunjukkan resisten terhadap

amantadin yang ditunjukkan oleh adanya mutasi pada

protein M2. Meskipun wabah avian influenza subtipe

H5N1 pada unggas telah berkurang, namun virus ini

terus bermutasi sehingga monitoring sirkulasi virus ini

masih harus terus dilakukan untuk mengetahui

kemungkinan peningkatan keganasan virus serta

memperbaharui seed vaksin yang sesuai dengan virus

yang bersirkulasi di lapangan.

UCAPAN TERIMA KASIH

Terima kasih kepada Bapak Nana Suryana, SE dan

Teguh Suyatno, Amd atas bantuan teknisnya. Terima

kasih juga diucapkan kepada Drh Endri Baharianto atas

kontribusinya. Penelitian ini didanai oleh APBN-2009,

Badan LitBang Pertanian, Kementrian Pertanian.

DAFTAR PUSTAKA

C

OLMAN

,

P.M. 1989. Neuraminidase: Enzyme and antigen. In:

The Influenza Viruses. R.M. Krug (ed). Plenum Press.

New York. pp. 175-218.

D

ESSELBERGER

,

U.,

V.R.

R

ACAINELLO

,

J.J. Z

AZRA

and P.

P

ALASE

.

1980. The 3’ and 5’ terminal sequences of

influenza A,B and C virus RNA segments are highly

concerved and show partial inverted complementary.

Gene

. 8: 315-328.

D

HARMAYANTI

,

N.L.P.I. 2009. Perubahan Genom Dan

Karakter Virus Avian Influenza Subtipe H5N1 Pada

Unggas di Indonesia. Disertasi Program Doktor Ilmu

Biomedik. Fakultas Kedokteran. Universitas Indonesia.

Jakarta.

D

HARMAYANTI

,

N.L.P.I.,

F.

I

BRAHIM

and A. S

OEBANDRIO

.

2010. Amantadine resistant of Indonesian influenza

H5N1 subtype virus during 2003-2008.

Microbiol.

Indones.

5. 1: 11-16.

H

AY

,

A.J.,

A.J.

W

OLSTENHOLME

,

J.J. S

KEHEL

and M.H. S

MITH

.

1985. The molecular basis of the specific anti-influenza

action of amantadine.

EMBO J

. 4: 3021-3024.

H

OFFMANN

,

E.,

J.

S

TECH

,

Y.

G

UAN

,

R.G.

W

EBSTER

and D.R.

P

EREZ

. 2001. Universal primer set for the full-length

amplification of all influenza A viruses.

Arch. Virol.

146: 2275-2289.

K

ATES

,

M.,

A.C.A

LLISON

,

D.A.T

YRELL

, and A.T. J

AMES

.

1962. Origin of lipids in influenza virus.

Cold Sping

Harbor Symp Quant Biol

. 27: 293-301.

K

OMADINA

,

N. 2007. WHO Collaborating Centre for

Reference and Research on Influenza Centre, 45 Poplar

Rd., Parkville, Vic 3052, Australia.

L

UO

,

G.,

J.

C

HUNG

and P. P

ALESE

.

1993. Alterations of the

stalk of the influenza virus neuraminidase: deletions and

insertions.

Virus Res.

29: 141-153.

M

ATROSOVICH

,

M.,

N.

Z

HOU

,

Y.

K

AWAOKA

and R. W

EBSTER

.

1999. The surface glycoprotein of H5 influenza viruses

isolated from human, chickens and wild aquatic birds

have distinguishable properties.

J. Virol.

73: 1146-115.

M

CGEOCH

,

D.,

P. F

ELLNER

and C. N

EWTON

.

1976. Influenza

virus genome consists of eight distinct RNA species.

Proc. Natl. Acad. Sci.

73: 3045-3049.

P

INTO

,

L.H.,

L.J. H

OLSINGER

and R.A. L

AMB

.

1992. Influenza

virus M2 protein has ion chennel activity.

Cell

. 69:

517-528.

S

CHULZE

,

I.T. 1997. Effect of glycosilation on the properties

and functions of influenza virus hemagglutinin.

J. Infec.

Dis

. 176: S24-28.

S

TEVENS

,

A.,

O.

B

LIXT

,

T.M.

T

UMPEY

,

J.K.

T

AUBENBERGER

,

J.C. P

AULSON

and I.A. W

ILSON

.

2006. Structure and

receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1

influenza virus.

Science

. 312: 404-410.

S

UGRUE

,

R.J. and A.J. H

AY

.

1991. Structural characterics of

M2 protein of influenza A viruses: evidence that it

forms a tetrameric chennel.

Virology

. 180: 617-24.

S

UZUKI

,

H.,

R.

S

AITO

,

H.

M

ASUDA

,

H.

O

SHITANI

,

M. S

AITO

and

I. S

ATO

.

2003. Emergence of amantadine-resitstant

influenza a viruses: Epidemiological study.

J. Infect.

Chemother

9: 195-200.

W

EBSTER

,

R.G.,

W.J.

B

EAN

,

O.T.

G

ORMAN

,

T.M. C

HAMBERS

and Y. K

AWAOKA

.

1992. Evolution and Ecology of

influenza A viruses

. Microbiol. Rev.

56: 152-179.

W

HARTON

,

S.A.,

J.A.

H

AY

,

R.J.

S

UGRUE

,

J.J.

S

KEHEL

,

W.I.

W

EIS

and D.C. W

ILEY

.

1990. Membrane fusion by

influenza viruses and mechanism of action of

(9)

of X-ray Crystallography in the design of antivirus

agents. Academic Press. Orlando. pp. 1-12.

Z

EBEDEE

protein: monoclonal antibody restriction of virus growth

,

S.L.

and R.A. L

AMB

.

1988. Influenza virus M2