INTISARI
Tumbuhan dalam dunia kesehatan dapat digunakan sebagai salah satu pendekatan terapi bahan alam yang ampuh untuk pengobatan berbagai penyakit.Pengobatan menggunakan tumbuhan Scurrula ferruginea (Jack) Danser dapat diterapkan untuk mengobati beberapa gangguan kesehatan pada tubuh manusia yang disebabkan oleh radikal bebas. Scurrula ferruginea (Jack) Danser tersebut mengandung kuersetin yang merupakan salah satu senyawa antioksidan.Penelitian ini bertujuan untukmengetahui aktivitas antioksidanmenggunakan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidazil)berdasarkan nilai IC50dan jugamelakukan penetapan kadar fenolik total menggunakan metode reagen Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dengan milligram (mg) ekuivalen asam galat per gram (g) fraksi. Penentuan aktivitas antioksidan dan penetapan kadar fenolik total tersebut menggunakan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang tumbuh pada tanaman (Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore).
Penentuan aktivitas antioksidan menggunakan spetrofotometer Uv-Vis pada panjang gelombang maksimum 515 nm dan penetapan kadar fenolik total dari fraksi etil asetat menggunakan spektrofotometer Uv-Vis pada panjang gelombang maksimum 739 nm.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S.ferruginea(Jack) Danser pada tanaman (Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore) memilik nilai IC50 sebesar(60,44 ± 2,16) µg/mL dan tergolong memiliki aktivitas antioksidan aktif atau kuat. Kemudian kadar fenolik total sebesar (49,87 ± 0,1838)mg ekuivalen asam galat per gram fraksi.
ABSTRACT
The plants in the world of health can using as one therapeutic approach potent natural ingredients for the treatment of various diseases. Treatment using Scurrula ferruginea (Jack) Danser plants can be applied to treat some health problems in the human body caused by free radicals. Scurrula ferruginea (Jack) Danser contains quercetin which is one antioxidant compound.This study aims to determine antioxidant activity using DPPH (1,1-diphenyl-2-pikrilhidazil) method based on IC50 values and also determination of total phenolic content using the Folin-Ciocalteu reagent method to expressed by milligrams (mg) of gallic acid equivalents per gram (g) fraction.Determination of antioxidant activity and total phenolic assay using ethyl acetate fraction of ethanol extract of leaves mistletoes S. ferruginea (Jack) Danserthat grows on theTabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore.
The determination of antioxidant activity using spetrofotometer Uv-Vis at maximum wavelength 515 nm and the assay of the total phenolic fraction of ethyl acetate using Uv-Vis spectrophotometer at a wavelength of 739 nm maximum.
The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanol extract of the leaves on the plant mistletoes S. ferruginea (Jack) Danser of Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore having an IC50 value of (60.44 ± 2.16) mg/mL and classified as having active or strong antioxidant activity. Then the total phenolic content was (49.87 ± 0.1838) mg gallic acid equivalents per gram fractions.
UJI AKITIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE RADIKAL DPPH (1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL) DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN BENALU Scurrula ferruginea (Jack) Danser pada TANAMAN Tabebuia aurea
(Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Yonathan Pura Hama Nganggu NIM : 118114024 FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
UJI AKITIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE RADIKAL DPPH (1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL) DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN BENALU Scurrula ferruginea (Jack) Danser pada TANAMAN Tabebuia aurea
(Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Yonathan Pura Hama Nganggu NIM : 118114024 FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2016
HALAMAN PERSEMBAHAN
Kasih adalah sebuah kata sifat dan juga sebuah kata kerja…… Kasih adalah pengorbanan tanpa syarat………
Kasih adalah segenap hati, segenap jiwa, dan segenap kekuatan…
Kasih adalah bukan sebuah pengetahuan namun kenyataan……. Kasih adalah lebih banyak bertindak dari pada berkata-kata…….
Jika dunia hilang kasih maka dunia akan seperti kuburan…. Jika hidup tanpa kasih, maka kebahagianmu akan hilang….
Jika kasih itu hilang maka hancurlah dunia……….
Jika kasih itu hidup maka damai itu mulai timbul…………..
Kasih itu harus di pelihara agar semakin lama damai itu..
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI AKITIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE RADIKAL DPPH (1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL) DAN PENETAPAN KADAR FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL DAUN BENALU Scurrula ferruginea (Jack) Danser pada TANAMAN Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore”sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam proses penelitian dan penyususnan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Yohanes Dwiatmaka M.Si. sebagai Dosen Pembimbing yang telah memberikan bimbingan, pengarahan serta ilmu dalam penelitian dan penyususnan skripsi ini. 2. Prof. Dr. CJ. Soegihardjo sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan
5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt sebagai Dosen Pembimbing Akademik Farmasi Universitas Santa Dharma
6. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
7. Segenap laboran Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma khususnya laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan Biokimia.
8. Teman-teman Farmasi Angkatan 2011 dan khususnya FKK 2011, atas semangat, canda tawa, kebersamaan, dan perhatiannya.
9. Yonas Sinseng sebagai teman skripsi DPPH atas bantuan dan kejasamanya untuk menyelesaikan skripsi ini.
10. Semua pihak yang telah memberi dukungan dan bantuan yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini banyak kekurangan dan jauh sempurna, untuk itu dengan segala kerendahan hati penulis mengharapkan saran dan kritik guna perbaikan dan penyempurnaan skripsi ini. Harapan penulis semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi
Yogyakarta, 20 November 2015
Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ……….. i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……….. ii
HALAMAN PENGESAHAN………. iii
HALAMAN PERSEMBAHAN……….. iv
PRAKATA……….. v
PERYATAAN KEASLIHAN KARYA………. vii
LEMBAR PERYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA……. viii
D. Antioksidan………... 11
BAB III METODE PENELITIAN……… 16
A. Jenis Rancangan Penelitian………... 16
A.Hasil Determinasi Tumbuhan……… 26
B.Hasil Pengumpulan Bahan………... 26
C. Hasil Preparasi………... 27
D.Hasil Ekstraksi………... 27
E. Hasil Fraksinasi Ekstrak……….. 29
F.Hasil Uji Pendahuluan………. 30
1.Uji pendahuluan aktivitas antioksidan………... 30
2.Uji keberadaan senyawa fenolik………... 32
G. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total………... 34
1. Penentuan operating time………... 34
2. Penentuan panjang gelombang maksimum……….. 36
H. Estimasi Kandungan Fenolik Total………. 36
I. Validasi Metode Analisis Penetapan Kandungan Fenolik Total…….... 38
1. Presisi………... 38
2. Linearitas……….. 39
J. Hasil Optimasi Metode Uji Antioksidan……….. 40
1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( mak )…. 40
2. Penentuan operating time………. 41
K. Estimasi Akitivitas Antioksidan dengan Radikal Bebas DPPH……….. 43
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………... 50
A. Kesimpulan ………... 50
B. Saran ………... 50
DAFTAR PUSTAKA ………... 51
LAMPIRAN………. 56
BIOGRAFI PENULIS……….. 81
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat
yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu…………... 36 Tabel II. Hasil penetuan jumlah kandungan fenolik total fraksi etil
asetat ekstrak etanolik daun benalu ………... 38 Tabel III. Nilai presisi seri kurva baku asam galat dalam penetapan
kandungan fenolik total……….. 39 Tabel IV. Hasil scanningpanjang gelombang serapan maksimum
pada berbagai konsentrasi………... 41 Tabel V. Hasil uji aktivitas antioksdan kuersetin dengan metode
DPPH... 45 Tabel VI. Hasil uji aktivitas antioksdian fraksi daun benalu dengan
metode DPPH………... 47
Tabel VII. Hasil Perhitungan IC50 Kuersetin dan Fraksi etil asetat daun
benalu………... 48
Tabel VIII . Kekuatan antioksidan dengan metode DPPH……….. 48
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Hasil Uji Pendahuluan Aktivitas Antioksidan (A= DPPH +
Metanol; B = DPPH+Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu Scurrula ferruginea + Metanol; C = DPPH + Kuersetin + Metanol; D = Metanol + Fraksi etil asetat ekstrak etanolik benaluScurrula ferruginea; E = Kuersetin +
Metanol)………... 31 Gambar 2. Hasil Uji Pendahuluan Keberadaan Senyawa Fenolik dalam fraksietil
asetat ekstrak etanolik daun benalu Scurrula ferruginea(A = kontrol positif [asam galat+reagen
Folin-Ciocalteu+ Na2CO3 +metanol]; B = larutan uji fraksi+reagen Folin-Ciocalteu+ Na2CO3 +metanol; C = Asam galat+
Metanol; D = Larutan blangko[air+metanol+reagen Folin
Ciocalteu+Na2CO3], E = Fraksi +metanol) .……... 33 Gambar 3. Grafik penentuan operating timeasam galat..………... 35 Gambar 4. Grafik penentuan operating time fraksi etil asetat... ... 35 Gambar 5. Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total……….. 37 Gambar 6. Grafik penentuan operating time kuersetin……… 42 Gambar 7. Grafik penentuan operating time fraksi etil asetat…………... 42 Gambar 8. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan
Kuersetin ………... 46 Gambar 9. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi
daun benalu………... 46
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Hasil determinasi tumbuhan benalu……… 56
Lampiran 2. Gambar (foto) tumbuhan benalu dan tanaman T. aurea... 57
Lampiran 3. Perhitungan penimbangan dan rendemen ekstrak dan fraksi Daun benalu………. 58
Lampiran 4. Penetapan kandungan kandungan fenolik total…………... 59
a. Asam galat……… 59
b. Fraksi etil asetat……… 60
Lampiran 5. Optimasi penentuan kandungan fenolik total……….. 62
a. Penentuan operating time asam galat……….. 62
b. Penentuan operating time fraksi……….. 63
c. Penentuan maksimun asam galat……….. 64
Lampiran 6. Penimbangan DPPH uji aktivitas antioksidan……… 66
Lampiran 7. Uji aktivitas antioksidan kuersetin………... 67
1. Penimbangan Kuersetin ……….. 67
2. Konsentrasi larutan induk……… 67
3. Perhitungan nilai IC50kuersetin ……….. 69
4. Penentuan operating time Kuersetin……….... 70
Lampiran 8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan………... 73
Lampiran 9. Uji aktivitas antioksidan fraksi………... 75
1. Penimbangan fraksi etil asetal………. 75
2. Konsentrasi fraksi etil asetat……… 75
3. Perhitungan nilai IC50 fraksi etil asetat………... 77
4. Penentuan Opertating time fraksi etil asetat……… 78
INTISARI
Tumbuhan dalam dunia kesehatan dapat digunakan sebagai salah satu pendekatan terapi bahan alam yang ampuh untuk pengobatan berbagai penyakit.Pengobatan menggunakan tumbuhan Scurrula ferruginea (Jack) Danser dapat diterapkan untuk mengobati beberapa gangguan kesehatan pada tubuh manusia yang disebabkan oleh radikal bebas. Scurrula ferruginea (Jack) Danser tersebut mengandung kuersetin yang merupakan salah satu senyawa antioksidan.Penelitian ini bertujuan untukmengetahui aktivitas antioksidanmenggunakan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidazil)berdasarkan nilai IC50dan jugamelakukan penetapan kadar fenolik total menggunakan metode reagen Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dengan milligram (mg) ekuivalen asam galat per gram (g) fraksi. Penentuan aktivitas antioksidan dan penetapan kadar fenolik total tersebut menggunakan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang tumbuh pada tanaman (Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore).
Penentuan aktivitas antioksidan menggunakan spetrofotometer Uv-Vis pada panjang gelombang maksimum 515 nm dan penetapan kadar fenolik total dari fraksi etil asetat menggunakan spektrofotometer Uv-Vis pada panjang gelombang maksimum 739 nm.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S.ferruginea(Jack) Danser pada tanaman (Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore) memilik nilai IC50 sebesar(60,44 ± 2,16) µg/mL dan tergolong memiliki aktivitas antioksidan aktif atau kuat. Kemudian kadar fenolik total sebesar (49,87 ± 0,1838)mg ekuivalen asam galat per gram fraksi.
Kata kunci: Scurrula ferruginea (Jack) Danser, Tabebuia aurea Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore, DPPH, IC50, antioksidan, fenolik, spetrofotometri Uv-Vis, Folin-Ciocalte, ekstraksi dan fraksinasi.
ABSTRACT
The plants in the world of health can using as one therapeutic approach potent natural ingredients for the treatment of various diseases. Treatment using Scurrula ferruginea (Jack) Danser plants can be applied to treat some health problems in the human body caused by free radicals. Scurrula ferruginea (Jack) Danser contains quercetin which is one antioxidant compound.This study aims to determine antioxidant activity using DPPH (1,1-diphenyl-2-pikrilhidazil) method based on IC50 values and also determination of total phenolic content using the Folin-Ciocalteu reagent method to expressed by milligrams (mg) of gallic acid equivalents per gram (g) fraction.Determination of antioxidant activity and total phenolic assay using ethyl acetate fraction of ethanol extract of leaves mistletoes S. ferruginea (Jack) Danserthat grows on theTabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore.
The determination of antioxidant activity using spetrofotometer Uv-Vis at maximum wavelength 515 nm and the assay of the total phenolic fraction of ethyl acetate using Uv-Vis spectrophotometer at a wavelength of 739 nm maximum.
The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanol extract of the leaves on the plant mistletoes S. ferruginea (Jack) Danser of Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore having an IC50 value of (60.44 ± 2.16) mg/mL and classified as having active or strong antioxidant activity. Then the total phenolic content was (49.87 ± 0.1838) mg gallic acid equivalents per gram fractions.
Keywords: Scurrula ferruginea (Jack) Danser, Tabebuia aurea (Manso) Benth. & Hook. f. Ex S. Moore, DPPH, IC50, antioxidants, phenolic, spetrofotometri Uv-Vis, Folin-Ciocalte, extraction and fractionation.
BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang
Antioksidan adalah senyawa pemberi elektron (elektron donor) atau reduktan yang mampu menangkap senyawa asing yang bersifat sebagai radikal bebas (senyawa yang memiliki elektron tidak berpasangan) (Winarsi, 2007). Antioksidan tersebut bekerja dengan mendonorkan atom hidrogen ke radikal yang memiliki gugus hidroksil sehingga terbentuk sebuah molekul yang tidak berbahaya yaitu air (Youngson, 2005).
Radikal bebas itu sendiri merupakan atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan (unpaired electron). Radikal bebas memiliki dua sifat yaitu reaktivitas tinggi, karena kecenderungan menarik elektron dan dapat mengubah suatu molekul menjadi radikal baru lagi sehingga terjadi reaksi rantai (chain reaction). Reaksi rantai tersebut baru berhenti apabila radikal bebas dapat diredam
(quenched) oleh senyawa yang bersifat antioksidan (Suryohudoyo, 1993).
Berdasarkan sumbernya antioksdan dibedakan menjadi 2 yaitu antiosidan alami dan sintetik. Antioksidan alami berasal dari tumbuhan yaitu senyawa fenolik dan polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid (golongan fenol alami terbesar), turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organil polifunsional (Suranto, 2011). Sedangkan antioksidan sintetik berupa butil
hodroksilanisol, butil hidrositoluen, propil gallat, dan etoksiquin (Rahmawati et al., cit Cahyadi, 2006).
Dewasa ini, diantara berbagai jenis tumbuhan didunia, tumbuhan benalu adalah salah satu jenis tumbuhan yang sering dilakukan penelitiannya mengeni sifat aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total. Salah satu contoh penelitian yang dilakukan oleh Marvibaigia et al., (2014) dari Malaysia tentang kandungan fenolik total, antibakterial dan aktivitas antioksidan dari benalu Scurrula ferruginea (Jack) Danser. Hasil penelitian tersebut menyatakan benalu memiliki aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik totalnya dengan hasil 144,217±0,66 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak benalu, namun tidak menyatakan inang S. ferruginea (Jack) Danser itu hidup. Karena menurut Adler (2002), setiap inang yang berbeda memilik kualitas senyawa aktif atau nutrisi yang berbeda.
Benalu dikenal sebagai tumbuhan penggangu yang kehidupannya bergantung pada inang yang masih hidup atau dikenal dengan istilah parasit dan bersifat merugikan sehingga jarang dianggap berguna oleh berbagai kalangan masyarakat, tetapi dengan berbagai penelitian yang dilakukan telah menyatakan bahwa benalu sangat bermanfaat sebagai obat. Benalu juga memiliki keunikan tersendiri yaitu benalu yang sama dapat tumbuh pada inang yang berbeda dan sebaliknya benalu yang berbeda dapat tumbuh pada inang yang sama (Soejono, 1995).
jenis senyawa maupun jumlah kadar senyawa yang ada di dalamnya, itu semua tergantung pada iklim, cuaca, dan inangnya.
Pada penelitian ini akan dilakukan uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan nilai IC50 dan penetapan kadar fenolik total dari fraksi etil asetat ekstrak etanol benalu S. ferruginea (Jack) Danser pada tanaman T. aurea (sebagai inang benalu). Scurrula ferruginea (Jack) Danser juga merupakan
salah satu tumbuhan benalu yang mengandung senyawa antioksidan terbesar yaitu fenolik (Marvibaigia et al., (2014) dan tumbuhan T. aurea mengandung sterol, alkaloid dan flavonoid (senyawa fenol) (Kambampati et al., 2015).
B. Keaslian penelitian
Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang benalu S. ferruginea (Jack) Danser pernah dilakukan oleh Marvibaigia et al., (2014) yaitu mengetahui kadar fenolik total, antioksidan dan sifat antibakterial dari ekstrak aseton bunga, daun dan batang S. ferruginea (Jack) Danser. Kapasitas antioksidan, dan kandungan total fenolik dari ekstrak dievaluasi menggunakan metode DPPH dan uji Folin Ciocalteu.
C. Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut:
1. Berapakah kadar fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser di tanaman T. aurea dinyatakan dengan berat
ekivalen asam galat?
2. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser di tanaman T. aurea menggunakan metode radikal DPPH yang dinyatakan dengan IC50?
D. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum :
Menguji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser di tanaman T. aurea dengan menggunakan metode
radikal DPPH. 2. Tujuan khusus:
a. Melakukan penetapan kadar fenolik total dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser di tanaman T. aurea menggunakan metode Folin-ciocalteu.
E. Manfaat Penelitian 1. Manfaat teoritis :
Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberi pengetahuan tentang adanya aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser pada inang T. aurea menggunakan metode radikal
DPPH yang dinyatakan dengan nilai IC50. 2. Manfaat praktis :
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Benalu Scurrula ferruginea (Jack) Danser
Scurrula ferruginea (Jack) Danser dikenal sebagai salah satu tanaman obat yang telah banyak digunakan dalam pengobatan tradisional untuk terapi herbal. Simplisia dari daun, batang dan bunga dari S. ferruginea (Jack) Danser digunakan oleh masyarakat untuk pengobatan tekanan darah tinggi, hipertensi dan kerusakan gastrointestinal (Dévéhat, 2002).
Ekstrak daun dan bunganya berdasarkan nilai IC50 memiliki aktivitas antioksidan yang terbaik dibandingkan batang. Berdasarkan aktivitas radikal DPPH semua ekstrak mentah benalu dari S. ferruginea (Jack) Danser merepresentasikan aktivitas antioksidan (Marvibaigia, 2014).
Scurrula ferruginea (Jack) Danser, termasuk anggota suku Loranthaceae dan memiliki sinonim yaitu Loranthus ferrugineus Jack, L. crysanthus DC, Dendrophthoe ferrugineus G. Don., Dendrophthoe crysanthus G. Don., Etubila ferrugineus Rafin.,
Loranthus crysanthoides Korth., Dendrophthoe crysanthoides Miq., S. chrysanthoides Danser (Scurrula ferruginea (Jack) Danser, 2003). Scurrula
ferruginea Danser memiliki nama daerah Jawa: Kemladean, pasilan, benalu,
ambai-ambai (Lemmens et al, 1999 dan Anonim, 1995).
Deskripsi tanaman; berupa terna, parasit obligat dengan batang menggantung berkayu silindris berbintik-bintik coklat. Bunganya; majemuk, berbentuk payung,
terdiri dari 4-6 bunga di ketiak daun atau di ruas batang, tangkainya pendek, kelopak berbentuk kerucut terbalik, panjangnya kurang lebih 3 mm bergigi empat, benang sarinya memilki panjang 2-3 mm, kepala putik bentuk tombol, tabung mahkota panjang 1-2 cm, tajuk mahkota melengkung ke dalam dan berwarna merah. Daun tunggal, berhadapan, lonjong, ujung agak meruncing, pangkal membulat tepi rata, panjang 5-9 cm, lebar 2-4 cm, permukaan atas hijau, permukaan bawah coklat. Buahnya; berbentuk kerucut terbalik, panjang kurang lebih 8 mm dan berwarna coklat. Bijinya berbentuk bulat kecil dan berwarna hitam. Akar; menempel pada pohon inang, berfungsi sebagai penghisap, yang berwarna kuning kecoklatan. Simplisia S. ferruginea (Jack) Danser memiliki helaian daun berwarna hijau keabu-abuan sampai hijau kecoklatan dengan permukaan bawah dipenuhi seperti rambut-rambut daun yang berwarna kecoklatan, berkerut, berbentuk bulat telur sampai lonjong, ujung meruncing, tepinya rata danmenggulung, panjang 3-6 cm, dan lebar 1-3 cm. Tangkai daunnya pendek,dan berkerut ; ranting berwarna coklat kehitaman, dan berkerut. Bau simplisianya khas, dan rasanya pahit (Scurrula ferruginea (Jack) Danser, 2003).
Tumbuhan Scurrula ferruginea (Jack) Danser diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta (Vascular plants/Piante vascolari) Division : Magnoliophyta
Superdivison : Spermatophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Rosidae Order : Santalales Family : Loranthaceae Genus : Scurrula L.
Species : Scurrula ferruginea (Jack) Danser
(China checklist of higher plants, 2015). B. Tabebuia aurea ( Pohon bunga terompet/lonceng )
Tabebuia aurea yang berasal dari Paraguay umumnya dikenal sebagai
lonceng emas (golden bell) atau pohon trompet Karibia, dan merupakan genus terbesar darikeluarga bignoniaceae dengan 293 spesies (Agarwal dan Chauhan, 2015).
Tabebuia aurea merupakan salah satu pohon berbunga yang spektakuler
diantara pohon-pohon berbunga lainnya dikarenakan bunga dari T. aurea mulai bermekaran ketika pohon mulai kehilangan daunnya atau berbunga tanpa daun. Daun T. aurea memiliki dua warna daun yang berbeda; hijau dan abu-abu keperakan
tiga setengah inci dan diameter inci. Dan memiliki buah berbentuk seperti kapsul, lonjong, warnya keabu-abuan coklat, sedikit berkayu dan panjangnya kurang lebih enam inci. Pohon T. aurea pada usia tua akan kekuatan untuk bertahan walapun diterpa angin topan dan dapat tumbuh dengan baik diberbagai tanah dan membutuhkan sedikit perawatan (Brown, 2000).
Ekstrak etanol daun T. aurea mengandung sterol, alkaloid dan flavonoid. Penggunakan metode diet lemak tinggi aterosklerosis dengan menginduksikan ekstrak etanol daun T. aurea pada tikus Wistar, menyatakan bahwa ekstrak etanol daun T. aurea berpotensi sebagai anti-aterosklerosis (Kambampati et al., 2015).
Tanaman Tabebuia aurea diklasifikasikan sebagai berikut : Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta Superdivision : Spermatophyta Divison : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Asteridae Order : Scrophulariales
Family : Bignoniaceae – Trumpet-creeper family Genus : Tabebuia Gomes ex DC, - trumpet-tree
C. Radikal Bebas
Para ahli biokimia menyebutkan bahwa radikal bebas merupakan salah satu bentuk senyawa oksigen reaktif, yang secara umum diketahui sebagai senyawa yang memiliki elektron yang tidak berpasangan. Senyawa ini terbentuk di dalam tubuh, dipicu oleh bermacam-macam faktor, misalnya ketika komponen makanan diubah menjadi bentuk energi melalui proses metabolisme. Pada proses metabolisme ini, sering kali terjadi kebocoran elektron. Dalam kondisi demikian, mudah sekali terbentuk radikal bebas, seperti anion superoksida, hidroksil dan lain-lain(Youngson, 2005).
D. Antioksidan
Konsumsi antioksidan dalam jumlah memadai dilaporkan dapat menurunkan kejadian penyakit degeneratif, seperti kardiovaskuler, kanker, aterosklerosis, osteoporosis, dan lain-lain. Konsumsi makanan yang mengandung antioksidan juga disebut-sebut dapat meningkatkan status imunologis dan menghambat timbulnya penyakit degeneratif akibat penuaan. Oleh sebab itu, kecukupan asupan antioksidan secara optimal diperlukan pada semua kelompok umur (Winarsi, 2007).
Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (elektron donor) atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu menginaktivasi atau menghambat berkembangnya reaksi oksidasi dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Akibatnya, kerusakan sel akan dihambat (Winarsi, 2011).
Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat dibedakan menjadi 2 macam yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Antioksidan alami dapat ditemukan pada tanaman seperti biji-bijian, buah dan sayur-sayuran yang diantaranya mengandung senyawa turunan fenol yaitu koumarin, hidroksdinamat, tokoferol, difenol, flavonoid, dihidroflavon, kathekin dan asam askorbat (Suranto, 2011). Sedangkan antioksidan sintetik berupa butil hodroksilanisol, butil hidrositoluen, propil gallat, dan etoksiquin (Rahmawati et al., cit Cahyadi, 2006).
E. Ekstrak
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 2014).
Ekstrak cair adalah sediaan cair simplisia nabati, yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet. Ekstrak cair yang cenderung membentuk endapan, yang didiamkan dan disaring atau bagian yang bening diendapkan (DepkesRI, 2014).
F. Etanol
Etanol dihasilkan secara biologis melalui fermentasi gula atau pati.Enzim yang ada dalam ragi atau kultur bakteri mengkatalisis reaksi dengan tanpa oksigen.
C6H12C6(aq) + H2O(aq) enzim 2CH3CH2OH (aq) + 2CO2 (g)
(etanol)
G. Senyawa Fenolik
Fenolik merupakan senyawa yang banyak ditemukan pada berbagai tumbuhan dan memiliki cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus hidroksi (OH). Senyawa ini diberi nama berdasarkan senyawa induknya yaitu fenol. Senyawa fenolik diklasifikasikan menjadi dua golongan yaitu tidak larut seperti lignin dan yang larut seperti asam fenolik, phenylpropanoids, flavonoid, dan kuinon. Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa senyawa fenolik memiliki berbagai efek biologis seperti memiliki aktivitas antioksidan (Indrawati dan Razimin, 2013).
H. Metode DPPH
DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidazil) adalah suatu radikal yang memiliki kemampuan untuk direduksi oleh suatu antioksidan dan dapat diukur dengan melihat penurunan nilai absorbansi pada panjang gelombang 517 nm sehingga DPPH dapat digunakan untuk mengukur kapasitas penangkapan senyawa radikal (Rosida et al., cit Duh, 1999). Parameter aktivitas antioksidan dilihat dari nilai IC50. IC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasi DPPH awal (Molyneux, 2004).
I. Metode Spetrofotometri
Metode pengukuran menggunakan prinsip spektrofotometri adalah berdasarkan absorpsi cahaya pada panjang gelombang tertentu melalui suatu larutan yang mengandung kontaminan yang akan ditentukan konsentrasinya. Proses ini disebut absorpsi spektrofotometri, dan jika panjang gelombang yang digunakan adalah gelombang cahaya tampak, maka disebut kolorimetri karena memberikan warna. Selain gelombang cahaya tampak, spektrofotometri juga menggunakan panjang gelombang pada gelombang ultraviolet dan inframerah. Prinsip kerja dari metode ini adalah jumlah cahaya yang diabsorpsi oleh larutan sebanding dengan konsentrasi kontaminasi dalam larutan. Prinsip ini biasanya dijabarkan dalam rumus Hukum Lambert-Beer, yang menghubungkan antara absorbansi cahaya dengan konsentrasi pada suatu bahan yang mengabsorpsi (Lestari, 2010).
J. Landasan Teori
Scurrula ferruginea (Jack) Danser merupakan benalu yang dapat tumbuh
pada berbagai tanaman inang. Inang yang berbeda dapat menyebabkan kandungan kimia pada benalu berbeda pula, khususnya kandungan senyawa yang berfungsi sebagai antioksidan yaitu fenolik. Tingginya kandungan fenolik menentukan daya aktivitas antioksidan semakin tinggi. Oleh sebab itu untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan kandungan fenoliknya dari sebuah benalu perlu dilakukan metode-metode pengujian yang sesuia.
dan penetapan kandungan fenolik totalnya adalah menggunakan metode Folin-ciocalteu. Kedua metode tersebut akan digunakan lagi dengan bantuan alat
spektrofometer UV-vis untuk mengetahui aktivitas antioksadan pada panjang gelombang 517 nm dan penetapan kadar total fenolik pada panjang gelombang 750 nm.
K. Hipotesis
Hipotesis dalam penelitian ini yaitu fraksi etil asetat dari ekstrak etanoldaun S. ferruginea (Jack) Danser pada tanaman T. aurea memiliki kandungan fenolik yang
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak sederhana.
B. Variabel
1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun S. ferruginea (Jack) Danser.
2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan (%IC) fraksi etil asetat ekstrak etanol daun S. ferruginea (Jack) Danser.
3. Variabel pengacau terkendali berupa waktu pemanenan, cara dipanen, dan jumlah (g) serbuk daun yang digunakan.
4. Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca atau musim, dan kemlembapan. C. Definisi Operasional
1. Simplisia herba S. ferruginea (Jack) Danser adalah simplisia yang dibuat dari tumbuhan S. ferruginea (Jack) Danser pada tanaman inang T. aurea yang berada di komplek Universitas Sanata Dharma Kampus III Yogyakarta.
2. Ekstrak etanol adalah ekstrak benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang diperoleh dengan cara maserasi dengan pelarut etanol : air (9:1) dan (1:1) kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.
3. Fraksi etil asaetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang telah diekstraksi cair-cair dengan air : washbensin (1:1) dan kemudian difraksinasi menggunakan etil asetat.
4. IC50 adalah persen konsentrasi fraksi etil asetat yang mampu menghambat 50% aktivitas radikal bebas menggunakan spektrofotometer Uv-vis.
D. BahanPenelitian
1. Bahan Utama : Benalu S. ferruginea (Jack) Danser dari T. aurea di lingkungan Universitas Sanata Dharma Kampus 3 Paingan, Maguoharjo, Sleman, Yogyakarta. 2. Bahan Kimia : Bahan kualitas p.a. E. Merck, yaitu metanol p.a ; bahan kualitas
p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu Larutan DPPH (1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil),
reagen Folin-Ciocalteu, asam galat dan kuarsetin ; bahan kualitas teknis Brataco Chemica di antaranya: etil asetat, etanol dan alumunium foil
E. Alat Penelitian
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah: neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160p), vacum rotary evaporator (Junke dan Kunkel), waterbath (labo-tech, Heraeus), vortex (Janke dan Kunkel), spektrofotometer UV-vis
F. Tata Pelaksanaan Penelitian 1. Determinasi tanaman
Determinasi dilakukan adalah pada benalu S. ferruginea (Jack) Danser dari inang tanaman pohon bunga terompet (Tabebuia aurea) dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta oleh Yohanes Dwiatmaka, M.Si. determinasi dilakukan dengan cara membandingkan cirri dan sifat berdasarkan Flora of China.
2. Pengumpulan bahan
Benalu S. ferruginea (Jack) Danser dari tanaman T. aurea diperoleh dari Kampus III Universitas Sanata Dharma Paingan, Maguoharjo, Sleman, Yogyakarta. Waktu panen tanaman benalu dilakukan pada musim penghujantanggal 9 bulan November 2014. Pemanenan yang dilakukan adalah memanen semua benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang tumbuh pada T. aurea.
3. Preparasi sampel
Setelah daun benalu tersebut dikeringkan kemudian dihancurkan menjadi serbuk menggunakan blender lalu diayak dan dipindahkan pada wadah tertutup yang tidak mudah mengalami kelembaban. Serbuk dari sampel ditimbang 50 gram lalu dimasukkan dalam labu Erlenmeyer 500ml dilakukan menggunakan tiga labu Erlenmeyer dengan masing-masing labu 50 gram serbuk daun benalu.
Labu Erlenmeyer yang terisi serbuk dimaserasi selama 3 hari menggunakan pelarut etanol 70% dengan bantuan shaker. Lalu maserat disaring menggunakan kertas saring melalui corong buchner sehingga menghasilkan filtrat, kemudianampas dimaserasi kembali dengan etanol selama 1hari, hingga filtrat hampir tidak berwarna.
Semua filtrat disatukan dan dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotatary evaporator sampai tidak ada lagi cairan yang menetes pada kondensor
sehingga diperoleh ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser. Ekstrak etanolik daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser dipanaskan pada waterbath hingga bobot tetap kemudian diekstraski cair-cair menggunakan air hangat + washbensin (1:1v/v). Fase air diambil lalu diekstraksi cair-cair menggunakan etil asetat dengan perbandingan fraksi air-etil asetat (1:1 v/v). Lalu dipisahkan antara fraksi air dan etil-asetat. Fraksi etil-asetat pelarutnya diuapkan menggunakan vacuum rotatary evaporator. Hasil fraksi tersebut ditampung dalam cawan porselen yang telah
4. Ujikandungan fenolik
a) Pembuatan larutan baku asam galat
Asam galat ditimbang sebanyak 10,0 mg dilarutkan dalam campuran 10 mL akuades:metanol (1:1) sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat 1000,0 µg/mL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan tersebut laluditambahkan metanol p.a sampai batas sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; 150 µg/mL.
b) Pembuatan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik
Fraksi etil asetat ditimbang sebanyak 10,0 mg, lalu ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1000,0 µg/mL. Kemudian diambil 1,0 mL larutan tersebut dan ditambahkan 10,0 mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100 µg/mL.
c) Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik
d) Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total 1. Penentuan Operating time
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnyaditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu absorbansinya dibaca menggunakan spetrofotometer Uv-vis pada panjang gelombang 750 nm setiap selang waktu 5 menit selama 30 menit. Kemudian dilakukan juga untuk larutan uji setiap selang waktu 5 menit selama 60 menit menggunakan konsentrasi 100 µg/mL 2.Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnyaditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Kemudian didiamkan selama operating time, dibaca panjang gelombang pada serapan maksimum menggunakan spektrofotometri visibel dengan range panjang gelombang 600-800 nm.
3. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; 150 µg/mL ditambahdengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah OT, absorbansinya dibaca λ max terhadap blanko yang terdiri atas aquades;metanol
p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaannya
4. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Sebanyak 0,5 mL larutan uji 100µg/mL, dimasukkan kedalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuam pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai miligram ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat, dilakukan 3 kali replikasi.
5. Uji aktivitas antioksidan 1) Pembuatan larutan DPPH
Sebanyak 15,8 mg DPPH dilarutkan dengan metanol p.a hingga 100,0 mL, sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan aluminum foil dan harus selalu dibuta baru.
2) Pembuatan larutan stok kuersetin
Kuersetin ditimbang sebanyak 10,0 mg dilarutkan dengan metanol p.a 10,0 mL hingga tanda batas.
3) Pembuatan larutan intermediet dan larutan baku pembanding (kuersetin)
4) Pembuatan larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Fraksi etil asetat ditimbang sebanyak 10,0 mg dan ditambahkan 10 mL metanol p.a sampai tanda batas sebagai stok larutan uji. Kemudian diambil 1,0 mL larutan stok larutan uji dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan intermdiet sehingga diperoleh konsentrasi 100,0 µg/mL. Lalu diambil sebanyak 6; 6,25; 6,50; 6,75; 7,0 mL larutan tersebut, kemudian masing-masing ditambahkanmetanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 60,0; 62,5; 65,0; 67,5; 70,0µg/mL.
5) Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Sebanyak 1 mL larutan DPPH masing-masing dimasukkan ke dalam tiga buah tabung reaksi. Selanjutnya masing-masing ditambah 1 mL metanol, larutan pembanding kuerstin 37,5 µg/mL, dan larutan uji 200 µg/mL. Selajutnya larutan ditambah dengan 3 mL metanol. Kemudian larutan dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik. Perubahan warna larutan menjadi kekuningan menunjukkan adanya aktivitas antioksidan.
6) Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penetuan panjang gelombang
time, lalu dilakukan scaning panjang gelombang serapan maksimum spektrofotometer Uv-visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
b. Penentuan operating time
Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing tiga labu ukur 10,0 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2,0 mL larutan pembanding kuersetin 5,0; 10,0; 15,0 µg/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas labu ukur 10,0 mL. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spetrofotometer pada panjang gelombang 515 nm selama 1 jam.Kemudian dilakukan juga untuk larutan uji 6,0 ; 65; 70µg/mL.
7) Uji aktivitas antioksidan
1. Pengukuran absobansi larutan DPPH (kontrol)
Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2 mL larutan DPPH dan larutan tersebut ditambahkan dengan metanol hingga batas. Kemudian larutan dibaca absorbansinya pada saat OT (35 menit) dan panjang gelombang serapan maskimum yaitu 515 nm. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali.
2. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan larutan uji
masing-masing ditambah dengan metanol hingga tanda batas. Masing-masing-masing larutan tersebut kemudian dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik dan didiamkan selama OT (30 menit). Larutan dibaca aborbansinya dengan spektrofotometer Uv-visibel pada panjang gelombang serapan maksimum hasil optimasi, yaitu 516 nm. Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi.
3. Estimasi aktivitas antioksidan
Data hasil pengukuran absorbansi larutan uji (fraksi etil asetat S. ferruginea senyawa pembanding larutan rutin) digunakan untuk menghitung nilai %IC dan IC50. Aktivitas penagkapan radikal DPPH (%IC) dihitung dengan rumus :
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Tumbuhan
Determinasi bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran taksonomi dari suatu tumbuhan berdasarkan struktur tumbuhan yang dilihat dari bentuk batang, daun, akar, dan bunga yang dilakukan sespesifik mungkin dan tepat sasaran karena tumbuhan mempunyai kemiripanvarietas yang terkadang membingungkan untuk berbagai penelitian. Determinasi tumbuhan benalu dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat (Lampiran 1) dengan acuan dari web efloras.org. Hasil determinasinya menunjukkan bahwa tumbuhan tersebut bernama Scurrula ferruginea (Jack) Danser.
B. Hasil Pengumpulan Bahan
Daun benalu diperoleh dari tanaman inang pohon bunga terompet yang berada dikomplek kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Pemanenan dilakukan pada tiga pohon yang sama dilokasi yang berdekatan dikarenakan jumlah daun benalu yang didapat terbatas sehingga diambil pada ketiga pohon yang ada tumbuhan benalu S. ferruginea (Jack) Danser.
Waktu pemanenan dilakukanpada pukul 10.00 pagi tanggal 9 November 2014 pada saat tanaman inang selesai berbungadan daun yang digunakan adalah daun yang tidak rusak atau tidak kering. Pemanenan dilakukan pada pagi hari untukmemperoleh kandungan metabolitsekunder yang maksimal. Sebab jika dilakukan pada siang atau
sore hari metabolit sekunder yang berperan sebagai antioksidan akan berkurang ketika sudah terpapar sinar UV dari matahari.
C. Hasil Preparasi
Preparasi sampel dilakukan untuk mendapat fraksi etil asetat dari ekstrak etanolik daun benalu yang diduga dalam fraksi tersebut mengandung senyawa fenolik. Setelah pemanenan, dilakukan sortasi basah dan pencucian dengan air mengalir bersih untuk memisahkan daun dari pengotor-pengotor seperti debu atau batu-batuan kecil yang menempel pada daun. Daun tersebut kemudian dirajang dan dikeringkan pada udara terbuka yang terlindung dari cahaya matahari langsung, agar komponen senyawa yang dinginkan terdapat didalam daun tidak mengalami kerusakan.
Pengeringan atau penjemuran dilakukan selama dua belas haridan dihentikan ketika daun benalu sudah rapuh. Kemudian daun disortasi kering untuk memisahkan lagi pengotor yang tercampur setelah pengeringan. Daun yang telah kering diserbukan menggunakan blender dan diayak untuk memperkecil ukuran partikel sehingga memperbesar luas permukaan serbuk agar mudah terbasahi oleh penyari secara merata.
D. Hasil Ekstraksi
polifenol dengan lebih banyak dalam proses ekstraksi dibandingkan dengan pelarut air saja dan juga lebih efektif menembus dinding sel untuk menarik keluar senyawa polifenol dari dalam sel.
Pada penelitian ini menggunakan etanol 70% yang bersifat polar karena antioksidan alami atau senyawa fenolik pada umumnya bersifat polar sehingga sangat efektif dalam menghasilkan jumlah bahan aktif yang optimal, danjuga bahan pengotor hanya dalam skala kecil turut dalam cairan pengekstraski. menurut Suryanto et al (2011), ekstrak dengan menggunakan pelarut etanol memiliki kandungan flavonoid lebih tinggi dibandingkan ekstrak metanol dan aseton.
Ekstraksi yang dilakukan menggunakan metode maserasi yaitu sampel direndam dalam etanol 70% dan aquadest (9:1) selama 3 hari pada temperature kamar. Maserasi dilakukan dengan bantuan shaker sebagai alat penggojokan untuk mengoptimalkan kontak antara pelarut dengan serbuk sampel agar tidak terjadi pengendapan. Setelah maserasi dilakukan remaserasi menggunakan pelarut atau larutan penyari yang sama untuk memaksimalkan proses penyarian supaya memperoleh lebih banyak senyawa fenolik. Selama proses maserasi dan remaserasi menggunakan labu erlenmeyer yang dibungkus menggunakan alumunium foil yang bertujuan untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa.
Pada proses penyaringanmenggunakan bantuan pompa vaccum dan corong buchner untuk mempercepat proses dan mendapat hasil yang lebih banyak
ekstrak etanolik pekat. Penguapan menggunakan rotary evaporator itu dikarenakan alat ini mampu menguapkan pelarut dibawah titik didih agar senyawa yang terkandung dalam ekstrak tidak mengalami kerusakan oleh suhu yang tinggi.
Ekstrak pekat tersebut di tampung dalam cawan kosong yang sudah ditimbangsebelumnya agar dapat dihitung bobot ekstrak. Kemudian ekstrak yang terdapat dalam cawan tersebut dipanaskan menggunakan waterbath untuk diuapkan lagi agar memperoleh ekstrak etanolik kering hingga mencapai bobot tetap. Bobot ekstrak kering yang diperoleh 14,33 gram dan rendemen yang didapat dari ekstrak daun benalu 9,5557%.
E. Hasil Fraksinasi Ekstrak
Menurut Devehat et a.l, 2002, daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser mengandung senyawa asam lemak; asam oleat, asam linoleat, dan asam oktadeka. Sehingga ekstrak etanolik kering tersebut diberi perlakuan ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dan berbanding air hangat, sehingga dapat dilihat pada corong pisah washbensin berada dibagian atas sedangkan air hangat berada dibagian bawah karena berat jenis air lebih besar dibandingkan washbensin. Wasbensin berfungsi menghilangkan senyawa-senyawa nonpolar yang tidak diharapkan seperti lipid dan klorofil karena washbensin juga bersifat nonpolar. Ekstraksi ini dilakukan sampai fase washbensin terlihat bersih atau tidak terlihat senyawa lipid dan klorofil. Setelah itu fase airnya diambil untuk difraksinasi cair-cair menggunakan etil asetat.
bersifat polar dan menurut Devehat et a.l, 2002, menyatakan bahwa daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser mengandung senyawa fenolik seperti ikarisid B2, avikulin,
katekin, epikatekin, epikatekin3-O-galat dan epikgalokatekin-3-0-galat.Saat pelarut etil asetat dicampurkan bersama fase air maka yang terlihat bahwa fase etil asetat berada pada bagian atas dan fase air berada pada bagian bawah dikarenakan air memiliki berat jenis lebih besar dari etil asetat. Fraksinasi dilakukan sebanyak tiga kali.
Fase etil asetat dikumpulkan untuk dilakukan penguapan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga tidak lagi terlihat tetesan etil asetat pada kondensor (pendingin) yang diembunkan tertampung pada labu alas bulat. Setelah dirotary, fraksi ditampung pada cawan porselin yang sebelumnya sudah ditimbang agar dapat dihitung berat fraksi tersebut lalu dikeringkan pada waterbath sampai memperoleh bobot tetap, kemudian ditutup menggunakan alumunium foil agar tidak terpapar sinar uv yang dapat merusak senyawa didalamnya dan disimpan dalam deksikator agar tidak lembab dan tahan lama sehingga sampel fraksi etil asetat ekstrak etanolikdaun benalu S. ferruginea (Jack) Danser untuk bisa digunakan pada rentang waktu yang lama. Bobot total fraksi yang diperoleh 1,8567 g dengan rendemen 1,2378%.
F. Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
diamati perubahan warnanya. Metode DPPH memiliki prinsip yaitu setiap senyawa yang dapat menangkap radikal bebas DPPH akan terlihat dengan mengamati perubahan warna dari warna ungu menjadi kuning akibat senyawa antioksidan bereaksi dengan DPPH.
Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dilakukan berdasarkan senyawa antioksidan mampu menghambat radikal bebas dengan mendonorkan atom-atom hidrogen kepada DPPH dan DPPH dikenal sebagai radikal bebas yang stabil pada suhu ruangan. Reaksi DPPH dengan antioksidan akan menetralkan radikal bebas dari DPPH dan membentuk DPPH tereduksi.
Gambar 1. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan
A = DPPH + Metanol;
B = DPPH+Larutan fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser+ Metanol;
C = DPPH + Kuersetin + Metanol;
D = Metanol + Larutan Fraksi etil asetat ekstrak etanolik benalu S. ferruginea (Jack) Danser;
Pengujian menggunakan fraksi etil asetat benalu ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser yang dicampur DPPH, telah menunjukkan perubahan warna
dari ungu menjadi kuning sehingga dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat benalu ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser dari inang tanaman T. aurea (Pohon bunga terompet) memiliki aktivitas antioksidan. (Gambar 1)
2. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik
Uji ini merupakan uji kualitatif yang bertujuan untuk mengetahui keberadaansenyawa fenolik dari fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser. Uji ini dilakukan dengan mencampurkan antara larutan
fraksi bersama reagen Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat. Reagen Folin-Ciocalteu digunakan karena senyawa fenolik dapat bereaksi dengan Folin yang akan membentuk larutan berwarna biru. Senyawa fenolik bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu hanya dalam suasana basa agar terjadi disosiasi proton pada senyawa
Gambar 2. Hasil Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser
A = kontrol positif [asam galat + reagen Folin-Ciocalteu+ Na2CO3 + metanol];
B = larutan uji fraksi + reagen Folin-Ciocalteu + Na2CO3+metanol;
C = Asam galat + Metanol;
D = Larutan blangko [air + metanol + reagen Folin Ciocalteu + Na2CO3] ,
E = Fraksi + metanol.
Pengujian dengan mencampurkan antara larutan fraksi dengan reagen Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat menunjukkan warna biru muda sehingga dapat
disimpulkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser mengandung senyawa fenolik. Semakin tinggi konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang mereduksi fosfomolibdat-fosfotungstat padareagen Folin-Ciocalteu menjadi kompleks molybdenum-tungsten sehingga warna biru akan semakin pekat. (Gambar 2).
G. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total
Penentuan kandungan fenolik total bertujuan untuk melihat korelasi antara aktivitas antioksidan dengan kandungan fenolik totalnya karena semakin tinggi kandunagan fenolik maka semakin kuat aktivitas antioksidan.Oleh sebab itu perlu untuk dilakukan penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol total daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser agar dapat diketahui apakah besarnya aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol total daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser sebanding dengan semakin banyak kandungan fenolik total.
1. Penentuan operating time (OT)
Penentuan operating time (OT) pada penetapan kandungan fenolik adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil yaitu saat sampel bereaksi sempurna dengan reagen warna. Reagen warna yang digunakan yaitu Folin-Ciocalteu sebagai pereaksi. Sampel yang digunakan yaitu asam galat sebagai sampel pembanding dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik total daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser sebagai sampel uji.
memilik nilai absorbansi yang stabil dan waktu mulai dihitung ketika sampel dicampurkan dengan reagen Folin-Ciocalteu. Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang teoritis 750 nm menurut Julyasih et al., (2005).
Gambar 3. Grafik penentuan OT asam galat (replikasi 2)
Gambar 4. Grafik penentuan OT larutan uji fraksi etil asetat
Hasil yang diperoleh adalah operating time asam galat adalah pada menit ke-20-35 yang cukup diwakilkan dengan replikasi dua sedangkan pada fraksi etil asetat adalah pada menit ke-35-50 (Gambar 4).
0
Penentuan ot larutan uji fraksi etil asetat
Replikasi 1
Replikasi 2
2. Penentuan panjang gelombang maksimum
Tujuan penentuan panjang gelombang maksimum adalah untuk memperoleh daerah serapan maksimum atau absorbansi maksimum antara campuran reagen dengan senyawa fenol. Panjang gelombang maksimum yang didapat akan digunakan pengukuran absorbansi kurva baku asam galat dan uji fenolik total pada laru fraksi S. ferruginea (Jack) Danser.
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan tiga konsentrasi asam galat 50; 100; dan 150 µg/mL. Tujuan menggunakan tiga konsentrasi ini adalah untuk mempresentasikan panjang gelombang maksimum dan absorbansi maksimum dengan konsentrasi rendah, sendang dan tinggi. Hasil yang diperoleh panjang gelombang maksimum rata-rata antara tiga konsentrasi asam galat yang diuji yaitu 739 nm. (Tabel I).
Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu
H. Estimasi Kandungan Fenolik Total
total, dapat menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Folin Ciocalteu digunakan sebagai pereaksi pengkompleks warna dimana reaksi yang terjadi antara senyawa uji dan Folin-Ciocalteu yang dapat membentuk kompleks yang stabil berwarna biru jika senyawa uji mengandung senyawa fenol. Semakin pekat warna biru campuran berarti semakin banyak kandungan fenolat yang terdapat dalam larutan senyawa uji.
Menurut Singleton dan Rossi (1965), bahwaprinsip metode Folin-Ciocalteu adalah oksidasi gugus fenolik hidroksil. Pereaksi ini mengoksidasi fenolat (garam alkali), mereduksi asam heteropoli menjadi suatu kompleks molidenum-tungsten (Mo-W). Folin dan Ciocalteu (1944), menyatakan bahwa reagen Folin-Ciocalteu terbuat dari air, natrium tungsten, natrium molibdat, asam fosfat, asam klorida, litium sulfat, dan bromine.
Gambar 5. Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total (replikasi 3)
Dalam menentukan kurva baku, perlu dilakukan minimal tiga replikasi untuk menentukan mana yang terbaik dari ketiga replikasi dengan memiliki persamaan regresi yang paling linier. Ternyata, dari ketiga replikasi yang memilki persamaan
regresi yang paling linier adalah replikasi ke tiga dengan y = 0,0039x + 0,0860 dan r = 0,9998 lebih mendekati angka 1 dibandingkan replikasi lainnya. (Gambar 5).
Tabel II. Hasil penentuan jumlah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun benalu
Replikasi
Fenolik total
Rata-rata (mg) SD (mg ekuivalen asam
galat)
I 49,74
49,87 0,1838
II 50,00
Berdasarkan perhitungan intrapolasi persamaan regresi linier y = 0,0039x + 0,0834; maka didapatkan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol daun benalu sebesar 49,87± 0,1838 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat (Tabel II).
I. Validasi Metode Analisis Penetapan Kandungan Fenolik Total
Tujuan dilakukan validasi metode analisis adalah untuk membuktikan bahwa karakteristik metode analisis memenuhi persyaratan sesuai dengan penggunaannya dan dapat dipercaya. Dalam penetapan kadungan fenolik total ini, parameter yang digunakan untuk validasi metode adalah presisi, dan linearitas.
1. Presisi
penyebaran hasil individual dari rata-rata jika produser diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen.
Presisi ditunjukkan dengan besarnya koefesien variansi (CV), semakin kecil CV artinya metode semakin teliti yaitu dibawah 2% (Harmita, 2004).
Tabel III. Nilai presisi seri kurva baku asam galatdalam penetapan kandungan fenolik total
Berdasarkan hasil pengukuran rata-rata SD (standar deviasi) yang diperoleh dari ketiga replikasi yaitu 0,007528 danrerata CV (koefeisen variansi) yang diperoleh adalah 1,19692 (Tabel III). Sehingga dapat disimpulkan presisinya bagus yaitu CVnya dibawah 2 %.
2. Linearitas
Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = + 1 atau – 1 bergantung pada arah garis sedangkan nilai a menunujukkan kepekaan analisis terutama instrumenyang digunakan.
Berdasarkan hasil pengukuran dan perhitungan, persamaan regresi dari ketiga replikasi yang baik adalah replikasi tiga dengan persamaan y = 0,0039x+0,0860 dengan nilai r yang paling mendekati + 1 atau – 1 yaitu r = 0,99983. (Lampiran 4 dan gambar 5).
J. Hasil optimasi metode uji aktivitas antioksidan 1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( maks )
Tujuan menentukan panjang gelombang maksimum yaitu untuk memperoleh daerah serapan maksimum dari DPPH supaya mendapat hasil yang lineritas pada kurva baku dalam pengukuran aktivitas antioksidan. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimal. Karena pada panjang gelombang tersebut perubahan serapan untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimal. Menurut Suryanto et al (2003), DPPH merupakan senyawa yang memiliki warna violet dengan memiliki
panjang gelombang teoritis 515-517 nm.
rata-rata 514,67 nm kemudian dibulatkan menjadi 515 nm untuk digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan.(Tabel IV).
Tabel IV. Hasil scanningpanjang gelombang serapan maksimum pada berbagai konsentrasi
2. Penentuan operating time (OT)
Tujuan dilakukan operating time adalah untuk mendapat waktu optimum dari reaksi antar larutan pembanding (kuersetin) dan larutan uji (fraksi etil asetat) bereaksi dengan radikal bebas (DPPH) sampai memperoleh absorbansi yang stabil dan selisih absorbansi kecil antara selang waktu lima menit selama satu jam.
Gambar 6. Grafik penentuan operating time (OT) kuersetin (replikasi 2)
Berdasarkan grafik operating time kuersetin (gambar 6) replikasi dua menunjukkan absorbansi kuersetin mulai stabil atau selisih absorbansi kecil pada rentang waktu 35-45 menit, sehingga pengukuran larutan pembanding kuersetin dapat diukur pada rentang waktu 35-45 menit untuk memperoleh hasil linier. Operating time menggunakan replikasi dua karena grafiknya lebih stabil dan linier dibandingkan
replikasi yang lainnya dilihat dari nilai R lebih mendekati angka 1.
Gambar 7. Grafik penentuan operating time fraksi etil asetat (replikasi 2)
0
Penentuan operating time fraksi etil asetat
61,2 µg/ml
66,3 µg/ml
Berdasarkan grafik operating time fraksi etil asetat (gambar 7) pada replikasi kedua menunjukkan absorbansi mulai stabil dan selisih absorbansi mulai kecil pada rentang waktu 25-50menit, sehingga pengukuran fraksi etil asetat menggunakan OT 25 menit. Digunakan dua kali replikasi disebabkan keterbatasan sampel fraksi etil asetat.
K. Estimasi Akitivitas Antioksidan dengan Radikal Bebas DPPH
Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode penangkapan radikal bebas DPPH. Akitvitas penangkapan radikal bebas DPPH berdasarkan kemampuan bahan uji dalam mereduksi atau menangkap radikal DPPH yang dapat dilihat dari berkurangnnya warna ungu pada larutan DPPH. Pengurangan intensitas warna larutan DPPH tersebut dihasilkan oleh bereaksinya molekul radikal DPPH dengansatu atom hidrogen yang dilepaskan oleh kompenen bahan uji sehingga terbentuk senyawa yang berwarna kuning. Menurut Nurani (2013), berkurangnya intensitas warna ungu dari larutan DPPH menunjukkan potensi fraksi etil asetat dalam menangkap radikal DPPH. Semakin besar konsentrasi larutan bahan uji maka absorbansi yang dihasilkan semakin kecil, berarti aktivitasnya sebagai penangkap radikal bebas semakin besar. Kovela et.al., (2002), menyatakan metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitive untuk pengujian aktivitas antioksdan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman.
persamaan garis linier. Nilai IC50 diperoleh dari perpotongan garis antara daya
hambatan dan sumbu konsentrasi, kemudian dimasukan ke dalam persamaan y = a + bx, dengan y = 50 dan nilai x menunjukan IC50. Menurut Molyneux (2004), ekstrak dinyatakan sebagai antioksidan bila nilai IC50 kurang dari 200 µg/ml. Daya hambat terhadap radikal bebas DPPH diukur secara spektrofotometri Uv-vis berdasarkan perubahan warna yang terjadi.
Penggunaan kuersetin sebagai pembanding karena kuersetin merupakan golongan flavonoid yang bersifat sebagai antioksidan (Syofyan et al, 2008) dan terkandung dalam benalu S. ferruginea (Jack) Danser serta larut dalam pelarut metanol. Dalam penelitian ini kuersetin bertujuan untuk melihat apakah potensi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat lebih kuat atau tidak jika dibandingkan dengan kuersetin. Hasil dalam penelitian menunjukkan bahwa pembanding kuersetin lebih kuat antioksidannya dibandingkan fraksi etil asetat ekstrak daun benalu.
Tabel V. Hasil uji aktivitas antioksdan kuersetin dengan metode DPPH
Gambar 8. Kurva persamaan regresi aktivitas antioksidan kuersetin (replikasi 1)
Gambar 8 menunjukkan grafik kurva antara konsentrasi kuersetin dan %IC dengan persamaan regresi linier y = 2,8896x + 16,1909 r = 0, 9973 menggunakan metode radikal bebas DPPH.
Gambar 9. Kurva persamaan regresi aktivitas antioksidan fraksi daun benalu (replikasi 3)
Gambar 9 menunjukkan grafik antara konsentrasi fraksi dan % IC dengan metode radikal bebas DPPH yang memiliki persamaan y = 0, 2606x+34,098 dan r = 0,9988. Namun dalam menggunakan larutan uji fraksi konsentrasi yang digunakan
49.5 50 50.5 51 51.5 52 52.5 53
60 62 64 66 68 70 72
%
I
C
Konsentrasi (µg/mL)
Kurva konsentrasi fraksi VS %IC
jauh lebih besar atau diatas rentang konsentrasi kuersetin dikarenakan dalam konsentrasi dalam rentang yang pada kuersetin, % IC fraksi daun benalu tidak mencapai 50% sehingga untuk mencapai dan melewati 50% (% IC) maka konsentrasi dinaikan hingga 60 µg/mL – 71,5 µg/mL. (Tabel VI).
Tabel VI. Hasil uji aktivitas antioksidan fraksi ekstrak daun benalu S. ferruguinea (Jack) Danser dengan metode DPPH
Replikasi Konsentrasi
replikasi memiliki persamaan regresi linier yang akan digunakan untuk menentukan nilai IC50.
Tabel VII. Hasil Perhitungan IC50 Kuersetin dan Fraksi etil asetat daun benalu S. ferruginea (Jack) Danser
Fraksi etil asetat daun benalu
Replikasi IC50 (µg/mL) Rerata (µg/mL) SD
1 61,39
60,44 2,16
2 57,97
3 61,97
Tabel VIII. Tingkat Kekuatan antioksidan (Blois, 1958). Intensitas Nilai IC50
Sangat kuat <50 µg/mL
Kuat 50-100 µg/mL
Sedang 101-150 µg/mL Lemah >150 µg/mL
