Efek Kombinasi Ekstrak Aktif Daun Poguntano (Picria Fel-Terrae Lour.) Dengan Doxorubicin Terhadap Sel Kanker Payudara Secara In Vitro

(1)

(2)

Lampiran 2. Gambar daun poguntano (Picria Fel-terrae Lour.)

a

b Keterangan:

a. Gambar daun poguntano poguntano

(3)

Lampiran 3. Hasil Pemeriksaan Mikroskopik Serbuk Simplisia Daun

Poguntano

Keterangan : Perbesaran 10 x 40

a. Trikoma b. Sel epidermis

c. Kristal kalsium oksalat bentuk prisma d. Stomata tipe diasitik

e. Stomata tipe anomositik

f. Berkas pembuluh angkut bentuk spiral g. Sel tetangga

a b

d

g e

c

(4)

Lampiran 4. Bagan skrining fitokimia, karakterisasi simplisia dan ekstrak

Dicuci Ditiriskan

Dikeringkan (diangin-anginkan)

Dihaluskan Daun poguntano

S i m p l i s i a

Serbuk Simplisia

Skrining Fitokimia

Pembuatan Ekstrak Karakterisasi

Simplisia

-Alkaloid -Flavonoid -Saponin -Tanin -Glikosida -Antrakuinon

-Steroid/Triterpenoid

-Pemeriksaan mikroskopik -Pemeriksaan makroskopik -Penetapan kadar air

-Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol -Penetapan kadar sari yang larut dalam air -Penetapan kadar abu total

-Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam

(5)

Lampiran 5. Bagan ekstraksi serbuk simplisia secara maserasi bertingkat

di maserasi dengan n-heksana

di maserasi dengan etilasetat dipekatkan

di maserasi dengan etanol dipekatkan di skrining

dipekatkan

di skrining

Serbuk simplisia

Ampas Maserat

Ampas Maserat Ekstrak kering n-heksana*

Ampas Maserat

Ekstrak kering etilasetat* Hasil

Ekstrak kental etanol*

Hasil

(6)

Keterangan : * = Uji Sitotoksik

Lampiran 6. Perhitungan kadar air simplisia daun poguntano (Picria Fel-terrae Lour.)

(7)

Lampiran 7. Perhitungan kadar sari larut air simplisia daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(8)

Lampiran 8. Perhitungan kadar sari larut etanol simplisia daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(9)

Lampiran 9. Perhitungan kadar abu total simplisia daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(10)

Lampiran 10. Perhitungan kadar abu tidak larut asam simplisia daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(11)

Lampiran 11. Perhitungan kadar air ekstrak n-heksana daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(12)

Lampiran 12. Perhitungan kadar sari larut air ekstrak n-heksana daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(13)

Lampiran 13. Perhitungan kadar sari larut etanol ekstrak n-heksana daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(14)

Lampiran 14. Perhitungan kadar abu total ekstrak n-heksana daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(15)

Lampiran 15. Perhitungan kadar abu tidak larut asam ekstrak n-heksana daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

% Kadar abu tidak larut dalam asam = x100%

% Rata-rata kadar abu tidak larut dalam asam =

(16)

Lampiran 16. Perhitungan kadar air ekstrak etilasetat daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(17)

Lampiran 17. Perhitungan kadar sari larut air ekstrak etilasetat daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(18)

Lampiran 18. Perhitungan kadar sari larut etanol ekstrak etilasetat daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

% Kadar sari larut dalam etanol = x100%

(19)

Lampiran 19. Perhitungan kadar abu total ekstrak etilasetat daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(20)

Lampiran 20. Perhitungan kadar abu tidak larut asam ekstrak etilasetat daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

% Kadar abu tidak larut dalam asam = x100%

% Rata-rata kadar abu tidak larut dalam asam =

(21)

Lampiran 21. Perhitungan kadar air ekstrak etanol daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(22)

Lampiran 22. Perhitungan kadar sari larut air ekstrak etanol daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(23)

Lampiran 23. Perhitungan kadar sari larut etanol ekstrak etanol daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(24)

Lampiran 24. Perhitungan kadar abu total ekstrak etanol daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(25)

Lampiran 25. Perhitungan kadar abu tidak larut asam ekstrak etanol daun poguntano (Picria fel-terrae Lour.)

(26)

Lampiran 26. Perhitungan persen sel hidup sel MCF-7

a. Kontrol sel dan kontrol media Absorbansi

kontrol sel

Rata-rata absorbansi kontrol sel

Absorbansi kontrol media

Rata-rata absorbansi kontrol media

Absorbansi kontrol sel dikurangi kontrol media 1.232

b. Ekstrak n-heksana daun poguntano Kadar

(27)

d. Ekstrak etanol daun poguntano

e. Doxorubicin Absorbansi

kontrol sel

(28)

Lampiran 27. Perhitungan persen sel hidup sel T47D

kontrol sel

(µg/ml) Absorbansi Absorbansi rata-rata

% sel hidup

(29)

d. Ekstrak etanol daun poguntano Kadar

(µg/ml) Absorbansi % sel hidup

(30)

Lampiran 28. Perhitungan persen sel hidup sel Vero

kontrol sel

0.502

0.071

0.065 0.437

0.498 0.063

0.528 0.06

(µg/ml) Absorbansi Absorbansi rata-rata

% sel hidup rata-rata

31.25 0.487 0.51 0.482 0.493 98.017

62.5 0.486 0.498 0.498 0.494 98.246

125.0 0.475 0.449 0.478 0.467 92.143

250.0 0.108 0.096 0.122 0.109 10.069

(31)

Lampiran 29. Bagan pembuatan media DMEM

Dimasukkan kedalam erlenmeyer Ditambahkan 800 ml aquabidest steril

Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N) Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l

Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan Ditampung dalam botol steril

Diberi identitas pada botol media Disimpan pada suhu 2 – 80 C

DMEM Sachet _{2 g Hepes} _{2 g NaHCO3}

(32)

Lampiran 30. Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK) DMEM

Dicampur

Diberi identitas pada botol MK Disimpan pada suhu 2 – 80C

Fetal Bovine Serum (FBS)

(10%)

Penisilin- Streptomisin

(2%)

Fungizone (amphotericin

B) (0,5%)

DMEM ad 100%

(33)

Lampiran 31. Bagan penumbuhan sel

Diambil diambil dari freezer Diambil beberapa tetes

Dimasukkan kedalam konikel yg berisi DMEM Disentrifuge 6000 rpm selama 5 menit

Dibuang supernatan

Ditambahkan 4 ml MK DMEM Di resuspensi hingga homogen

Dimasukkan ke dalam flask

Ditambahkan 5 ml MK kedalam setiap flask Dihomogenkan

Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted Diberi identitas pada flask

Disimpan dalam inkubator CO2 Sel dalam freezer

Sel

Konikel

(34)

Lampiran 32. Bagan panen sel

Dipersiapkan dan dikondisikan

Diamati apakah sel telah konfluen 80% Dibuang MK dari flask dengan mikropipet

Dicuci sel 2x dengan PBS

Ditambahkan 400 µl trypsine-EDTA 0,25% Diinkubasi dalam inkubator CO2 selama 5 menit Ditambahkan 4 ml MK

Di resuspensi dengan mikropipet

Diamati sel dibawah mikroskop inverted

Di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol Ditransfer sel kedalam tabung konikel

Sel, alat, dan bahan

(35)

Lampiran 33. Bagan penghitungan sel

Diambil 10µl panenan sel

Dipipetkan kedalam hemositometer Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop

Kultur Sel

(36)

Lampiran 34. Bagan pembuatan larutan uji

Ditimbang sebanyak 50 mg Dimasukkan kedalam polytube Dilarutkan dalam 1.000 µl DMSO Di vortex

Dibuat pengenceran sampai diperoleh konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml, dan 31,25 µg/ml Ekstrak n

-heksan

Ekstrak Etilasetat

Ekstrak Etanol

(37)

Lampiran 35. Bagan pengujian sitotoksik

Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan kepadatan 1 x 104

Diinkubasi selama 24 jam Dibuang medium

Ditambahkan medium baru Ditambahkan larutan uji Diinkubasi selama 24 jam

Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam Dicuci dengan PBS

Ditambahkan 100 µl MK dan 10 µl MTT (5 mg/ml) Diinkubasi selama 4-6 jam

Ditambahkan SDS (sebagai stopper) Dibungkus dengan aluminium foil Dibiarkan selama 1 malam

Dibaca serapan dengan ELISA reader pada λ 595 nm

Dihitung % sel hidup

Dihitung IC50 dengan analisa probit menggunakan SPSS 17

Sel

Absorbansi

(38)

Lampiran 36. Sel MCF-7 dan T47D di bawah mikroskop

Keterangan: a. Sel MCF-7 sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10) b. Sel MCF-7 setelah diberi larutan uji (sel mengalami perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)

Keterangan: a. Sel T47D sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10) b. Sel T47D setelah diberi larutan uji (sel mengalami perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)

(39)

Lampiran 37. Sel Vero di bawah mikroskop

Keterangan: a. Sel Vero sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10) b. Sel Vero setelah diberi larutan uji (sel mengalami perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)

(40)

Lampiran 38. Microplate -96 sumuran dan kristal formazan

Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji Keterangan: a. Kristal Formazan (perbesaran 10 x 10)

ekstrak n-heksana

Kontrol media Kontrol

sel 500 µg/ml 250 µg/ml 125 µg/ml 62,5 µg/ml

31,25 µg/ml

a ekstrak

etilasetat

(41)

Lampiran 39. Hasil penentuan IC50 sel MCF7 dengan analisa probit SPSS 17

a. Ekstrak n-heksana daun poguntano

Confidence Limits

Probabil ity

95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak

(42)

.940 676.721 279.454 63026.633 2.830 2.446 4.800 .950 748.090 298.696 88904.222 2.874 2.475 4.949 .960 841.613 322.684 133313.51

4

2.925 2.509 5.125 .970 972.760 354.395 219643.65

1

2.988 2.549 5.342 .980 1179.26

4

400.736 427288.05 6

3.072 2.603 5.631 .990 1597.28

9

484.898 1223353.1 97

3.203 2.686 6.088 a. A heterogeneity factor is used.

b. Logarithm base = 10.

b. Ekstrak etilasetat daun poguntano

Probabilit y

95% Confidence Limits for log (konsentrasi ekstrak)a Estimate

Lower Bound

Upper

Bound Estimate

(43)

.500 119.990 104.487 137.684 2.079 2.019 2.139 .980 1100.57

8

797.787 1692.410 3.042 2.902 3.229 .990 1476.97

2

1032.146 2390.336 3.169 3.014 3.378 a. Logarithm base = 10.

c. Ekstrak etanol daun poguntano

Probabili ty

95% Confidence Limits for log (konsentrasi ekstrak)b Estimate

Lower Bound

Upper

Bound Estimate

(44)

.090 55.041 18.081 90.782 1.741 1.257 1.958 .990 6096.662 1882.339 135127.39

3

3.785 3.275 5.131

a. A heterogeneity factor is used. b. Logarithm base = 10.

d. Doxorubicin

(45)

Estimate

Lower Bound

Upper

Bound Estimate

Lower

.020 6115.25 0

. . 3.786 . .

.030 4827.11 5

. . 3.684 . .

.040 4040.27 1

. . 3.606 . .

.050 3495.83 9

. . 3.544 . .

.060 3090.64 1

. . 3.490 . .

.070 2774.19 5

. . 3.443 . .

.080 2518.45 0

. . 3.401 . .

.090 2306.38 9

. . 3.363 . .

.100 2127.00 6

. . 3.328 . .

.150 1521.18 2

. . 3.182 . .

(46)

.900 63.888 . . 1.805 . .

Lampiran 40. Hasil penentuan IC50 sel T47D dengan analisa probit SPSS 17

a. Ekstrak n-heksan daun poguntano

Probab ility

95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)a Estimate

Lower Bound

Upper

Bound Estimate

Lower

.010 125061.18 7

14273.985 2.918E7 5.097 4.155 7.465 .020 64746.770 8999.177 9161910.65

1

4.811 3.954 6.962

.030 42640.364 6714.397 4394429.53 9

4.630 3.827 6.643

.040 31143.173 5386.029 2528845.22 1

4.493 3.731 6.403

.050 24119.303 4501.454 1613455.49 1

4.382 3.653 6.208

(47)

.200 3466.784 1148.188 53518.436 3.540 3.060 4.729

b. Ekstrak etilasetat daun poguntano

Proba bility

95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)b Estimate

Lower Bound

Upper

Bound Estimate

(48)

.040 1115.009 492.491 9792.180 3.047 2.692 3.991

(49)

Probab ility

Lower Bound

Upper

Bound Estimate

(50)

.960 82.875 17.986 136.018 1.918 1.255 2.134 .970 75.200 14.438 126.776 1.876 1.160 2.103 .980 66.087 10.762 115.662 1.820 1.032 2.063

.990 53.912 6.751 100.398 1.732 .829 2.002

(51)

Lampiran 41. Combination Index

I= (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2 I = CI

Dx = konsentrasi dari satu senyawa tunggal (IC50)

(D)1 dan (D)2 = besarnya konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan efek yang sama absorbansi tunggal

ug/ml ENDP uM Doxorubicin tunggal

15.0 0.731 0.825 0.783 25.0 0.836 0.749 0.982 kontrol sel

30.0 0.681 0.781 0.74 50.0 0.767 0.799 0.819 1.189 1.025 1.012 1.075333

45.0 0.663 0.728 0.708 100.0 0.694 0.728 0.723 kontrol media

60.0 0.559 0.588 0.592 200.0 0.625 0.702 0.617 0.14 0.15 0.159 0.150

cell viability tunggal

ug/ml ENDP rata-rata uM Doxorubicin tunggal rata-rata

(52)

absorbansi kombinasi

doxo 25

doxo

50 doxo100 doxo 200

ENDP 15.0 0.918 0.88 0.885 0.769 0.856 0.857 0.726 0.807 0.826 0.706 0.733 0.744 ug/ml 30.0 0.834 0.855 0.857 0.765 0.824 0.826 0.757 0.728 0.779 0.701 0.754 0.665 45.0 0.807 0.759 0.739 0.803 0.788 0.767 0.75 0.723 0.738 0.632 0.632 0.662 60.0 0.708 0.735 0.747 0.739 0.772 0.757 0.69 0.652 0.715 0.443 0.473 0.443

cell viability kombinasi

dox 25 dox 50 dox 100 dox 200

ENDP 15.0 83.00 78.90 79.44 66.91 76.31 76.41 62.26 71.01 73.06 60.10 63.02 64.21 ug/ml 30.0 73.93 76.20 76.41 66.47 72.85 73.06 65.61 62.48 67.99 59.56 65.29 55.67 45.0 71.01 65.83 63.67 70.58 68.96 66.69 64.85 61.94 63.56 52.11 52.11 55.35 60.0 60.32 63.23 64.53 63.67 67.23 65.61 58.37 54.27 61.07 31.69 34.93 31.69

EADP

y = -0.1682x +

81.93 Doxorubicin y = -0.1524x + 101.99

R² = 0.8752 R² = 0.9393

IC 50 = 120 µg/ml IC50 = 369 nM

Doxo

ENDP 0 25 50 100 200

0 100 76.27 69.72 61.07 53.84

15.0 68.06 80.45 73.21 68.78 62.44

30.0 63.13 75.51 70.80 65.36 60.17

(53)

60.0 46.45 62.69 65.50 57.90 32.77 doxo tunggal y = -0.1524x + 101.99

25 50 100 200

15.0 141.361 188.855 217.918 259.505 30.0 173.733 204.686 240.365 274.391 45.0 230.678 218.155 252.889 320.230 60.0 257.851 239.420 289.277 454.205

ENDP y = -0.1682x + 81.93

25 50 100 200

15.0 8.820 51.852 78.185 115.865

30.0 38.150 66.196 98.524 129.353 45.0 89.746 78.399 109.871 170.886 60.0 114.367 97.667 142.841 292.276

CI

Doxo

ENDP 25 50 100 200

15.0 1.88 0.55 0.65 0.90

30.0 0.93 0.70 0.72 0.96

45.0 0.61 0.80 0.81 0.89

(54)

Lampiran 42. Hasil penentuan IC50 sel vero dengan analisa probit SPSS 17

Probab ility

Lower Bound

Upper

Bound Estimate

(55)

.940 82.795 . . 1.918 . .

.950 79.225 . . 1.899 . .

.960 75.227 . . 1.876 . .

.970 70.586 . . 1.849 . .

.980 64.858 . . 1.812 . .

.990 56.759 . . 1.754 . .

Lampiran 43. Mikroskop inverted, elisa reader dan inkubator CO2

Keterangan : Elisa reader

(56)

Keterangan : Inkubator CO2

(57)