Minyak Atsiri Tanaman Ocimum L. Sebagai Bioherbisida Alami

Pendahuluan

• Minyak atsiri tumbuhan umumnya mengandung metabolit golongan terpen dan/atau fenilpropanoid. Kandungan tersebut dipengaruhi oleh beberapa faktor lingkungan/ekologis.

• Beberapa minyak atsiri diketahui mempunyai aktivitas biologis seperti aktivitas alelopati.

• Alelopati merupakan fenomena biologis ketika suatu organisme mensekresi suatu senyawa akibat adanya stimulus sebagai

mekanisme pertahanan diri terhadap organisme lain atau tanda komunikasi dalam proses pembenihan.

• Oleh karena itu, beberapa minyak atsiri dapat digunakan sebagai

bioherbisida bagi gulma.

• Genus Ocimum L. Merupakan salah satu genus penting dalam famili Lamiaceae. Tumbuhan ini banyak ditemui di wilayah tropis dan subtropis Afrika, Asia, dan Amerika.

• Spesies ocimum terkenal dengan aroma khas dan penggunaan tradisional dalam mengatasi penyakit ringan.

• Spesies O. Forskolei Benth. telah dilaporkan mempunyai beragam bioaktivitas seperti

antioksidan, antibakteri, dan antinematoda / anticacing. Minyak atsiri O. Forskolei Benth. Yang berasal dari Yaman dilaporkan mempunyai senyawa mayor endo-fenchol, fenchone, τ-cadinol, and methyl (E)-cinnamate.

• O. Forskaolii Benth. yang banyak tumbuh di wilayah Afrika dan Asia khususnya semenanjung Arab sayangnya belum banyak dilaporkan terkait komposisi kimia dan bioaktivitasnya.

• O. Americanum L. yang lebih dikenal dari spesies sebelumnya dilaporkan mempunyai bioaktivitas sebagai antimikroba, antiserangga, antioksidan, antiinflamasi, dan aktivitas sitotoksik. Beberapa penelitian telah melaporkan komposisi senyawa dan bioaktivitas minyak atsiri O. Ameericanum L.

Dari wilayah India, Brazil, dan Djibouti. Namun, belum ada laporan terkait komposisi dan bioaktivitas minyak atsiri O. Americanum L. yang berasal dari Arab Saudi.

• Tujuan dalam penelitian ini adalah mengekstraksi minyak atsiri dari 2 spesies tersebut yang berasal dari Saudi dan menganalisis komposisi senyawa

penyusunnya, selanjutnya mengevaluasi aktivitas bioherbisida minyak atsiri

tersebut terhadap gulma Dactyloctenium aegyptium (L.) Willd. dan Chenopodium murale.

• Dactyloctenium aegyptium (L.) Willd. Mewakili gulma yang tumbuh di masa

panen musim panas dan Chenopodium murale. Mewakili gulma yang tumbuh di masa panen musim dingin.

• Dactyloctenium aegyptium (L.) Willd. Atau rumput gagak mesir merupakan

gulma yang sering ditemui di wilayah tadah hujan seperti Asia selatan, barat, dan afrika utara, dan timur tengah. Gulma satu ini diketahui mempunyai siklus hidup yang cepat dan tahan terhadap herbisida. Sedangkan Chenopodium murale atau bayam australia merupakan gulma yang merugikan karena merupakan

kompetitor bagi tanaman karena adaptivitasnya yang tinggi.

Material and Methods - Preparasi

• O. forskaolii and O. Americanum diperoleh dari Provinsi Fayfa, Kota Jazan, Saudi Arabia bagian Barat Laut. Keduanya diidentifikasi dan diautentikasi berdasarkan Buku Flora Saudi Arabia oleh Prof. Dr.

Ahmed M. Abd-ElGawad (selaku co-author) yang merupakan Profesor Ekologi Tanaman, Mansoura University and King Saud University.

• Voucher spesimen O. Forskaolii : MUZ-20230 (KACST)

• Voucher spesimen O. Americanum : MUZ 20232 (KACST)

• Sample dikeringanginkan dalam ruangan teduh pada suhu 25+3C

selama 1 pekan. Selanjutnya dihaluskan dan disimpan dalam tas

kertas hingga proses berikutnya.

Ekstraksi

• 200g serbuk kering sampel didistilasi secara terpisah dengan metode distilasi air menggunakan Cleavenger apparatus dalam labu 2L selama 3 jam. Kemudian didekantasi dan dikeringkan dengan Na2SO4 (0,5g).

Persen yield minyak atsiri (v/m %) dihitung dengan persamaan :

•

• Ekstraksi diulang 3 kali dengan langkah serupa untuk tiap tumbuhan.

Minyak hasil ekstraksi disimpan dalam 3 botol vial berbeda dan

disimpan pada 4C.

Analisis GC-FID (asesmen aktivitas alelopati)

• Instrumen : HP5890 series II equipment (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)

• 2 kolom kapiler silika (30 m x 0,25 mm, ketebalan film 0,25 mikrometer)

• HP-Wax

• DB-5 (Agilent, Santa Clara, CA, USA))

• Temperatur oven diatur pada rentang 60-220C dengan derajat kenaikan 5C per menit

• Gas pembawa N2 dengan laju 2mL/menit, Penyuntikan tanpa

pemisahan (splitless injection), temperatur detektor 250C.

Analisis - GCMS

• Instrumen : TRACE GC Ultra Gas Chromatograph (ThermoFisher Scientific in Waltham, Massachusetts)

• Detektor : ISQTM Single Quadrupole Mass Spectrometer

• Kolom : A TR-5 MS column (30 m x 0.32 mm inner diameter, 0.25 μm film thickness)

• Gas pembawa : He (laju 1,0 mL/menit, split rasio 1:10 dengan rentang 60-240C dengan derajat kenaikan 4C/menit selama 1 menit, injektor dan detektor dipertahankan pada 210C)

• Sampel dilarutkan dalam n-heksana (1:10), diinjeksikan sebanyak 1μl.

• Dengan mengadopsi rentang spektra dan EI pada 70 eV, spektra massa diperoleh.

• Software : AMDIS (Automated Mass spectral Deconvolution and Identification)

• Database NIST, koleksi spektra Wiley dan retensi n-alkana standar (C8-C22).

• camphene, α-pinene, β-pinene, D-limonene, geraniol, linalool, α-terpineol, citral, α-copaene, α- elemene, β-caryophyllene, germacrene D, spathulenol, cubedol, and α-eudesmol.

Uji Aktivitas Alelopati – Persiapan Target

• Biji yang telah matang dari D. aegyptium and C. Murale dikumpulkan dari lahan pertanian yang terinfeksi gulma tersebut.

• Dipilih ukuran biji yang seragam dan disimpan dalam kantong kertas pada suhu ruang.

• Biji yang telah disiapkan, selanjutnya disterilkan permukaannya

dengan Natrium Hipoklorit (0,3%) selama 3 menit, dibilas dengan air

suling 3x, dan dikeringkan dalam kondisi steril.

Uji Aktivitas Alelopati

• Siapkan cawan petri (90mm) lalu beri masing-masing 4mL larutan minyak atsiri dengan variasi konsentrasi 0, 25, 50, 75, dan 100 µL/L surfaktan Tween 80®

(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Jerman). Untuk setiap variasi konsentrasi disiapkan 3 cawan petri.

• Letakkan kertas saring (Whatman Grade 1) dalam cawan petri, distribusikan 20 biji gulma steril di atasnya. Bungkus dengan parafilm (Sigma, St. Louis, MO, USA) untuk menghindari kebocoran. Selanjutnya cawan petri diinkubasi dalam ruang pertumbuhan yang dikondisikan (25 ± 2°C dan siklus 12 jam cahaya / 12 jam gelap).

• Eksperimen ini diulang sebanyak tiga kali dengan total piring sebanyak 90 [5 perlakuan (4 konsentrasi EO + 1 kontrol) × 3 piring replikasi × 3 replika

eksperimental × 2 spesies tanaman).

• Biji yang berkecambah dengan panjang radikula 2 mm dihitung setiap hari,

sementara panjang akar dan tunas bibit diukur pada hari kesepuluh inkubasi.

Perhitungan

• Inhibisi pembenihan/ pertumbuhan kecambah dihitung menggunakan persamaan berikut :

Inhibition % = 100 x [{(Germination/lenght (root/shoot)control) -

(Germination/lenght (root/ shoot)treatment)} / (Germination/lenght (root/shoot)control

• IC50 dihitung sebagai konsentrasi minyak atsiri yang dibutuhkan

untuk menghambat 50% pertumbuhan kecambah

Analisis Statistika

• Data eksperimen aktivitas alelopati dengan triplo dianalisis dengan ANOVA dua arah dengan spesies dan konsentrasi sebagai faktor pada P < 0,05 menggunakan program perangkat lunak CoStat, versi 6.311 (CoHort Software, Monterey, CA, USA).

• Uji Tukey’s Honest Significant Difference (HSD) digunakan sebagai uji lanjutan untuk mengukur signifikansi perbedaan rata-rata kelompok.

• IC50 dihitung secara eksponensial menggunakanms.excel

• Principal Component Analysis (PCA) (JMP® Pro 16.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) digunakan untuk menguji kesamaan atau

perbedaan antara kedua spesies tanaman berdasarkan kumpulan

data konsentrasi minyak atsiri dari kedua spesies tersebut

Hasil dan Diskusi – Identifikasi Komponen

• Minyak yang dihasilkan berwarna kuning pucat dengan rendemen 0.62 ± 0.01 and 0.79 ± 0.02 (v/b %).

• Rendemen ini telah diprediksi sesuai hasil riset-riset sebelumnya terkait kandungan minyak atsiri dalam genus Ocimum. Secara spesifik, rendemen minyak atsiri O. Americanum dalam penelitian ini lebih tinggi

dibandingkan dengan minyak atsiri O. Americanum asal Brazil (0,67%) >

minyak atsiri O. Americanum asal India.

• Hasil karakterisasi GCMS dan GC-FID ditampilkan pada gambar dan tabel.

Terdapat 51 komponen (Total 96,82%) untuk O. Forskaolii. mono- (40.49%) and sesquiterpenes (55.15%) along with traces of non-terpenoids (1.18%).

• Terdapat 61 komponen (Total 94,22%) untuk O. Americanum dengan

rincian sesquiterpenes (81.24%) in addition to monoterpenes (12.87%) and

minors of non-terpenoids (0.11%).

O. forskaolii

• Senyawa golongan seskuiterpen merupakan komponen yang dominan dalam

minyak atsiri O. Forskaolii. Seskuiterpen teroksigenasi menjadi komponen utama (42,03%) dibanding hidrokarbon seskuiterpen (13,12%).

• Seskuiterpen teroksigenasi utama : β-atlantol (10.54%) dan τ-cadinol (11.42%).

Hidrokarbon Seskuiterpen : e β-curcumene (2.70%) dan γ-cadinene (2.60%).

• Monoterpen teroksigenasi 37,21% (endo-fenchol (18.15%), α-terpineol (6.94%), and endoborneol (4.96%), hidrokarbon monoterpen 3,28% (o-cymene 1,16%).

• Data ini agak bertolak belakang dengan data minyak atsiri O. forskolei asal Yaman dimana senyawa monoterpen mendominasi komponen penyusunnya. Pada

minyak atsiri O. forskolei tidak ditemukan β-atlantol and β-curcumene.Namun, secara general komponen penyusun minyak atsiri O. Forskaolii juga ditemukan dalam spesies ocimum lain seperti O. Basilicum L. dan O. Gratissimum L.

• Senyawa non terpenoid : (E)-α-ionone and methyl linoleate --- trace

O. americanum

• seskuiterpen teroksigenasi (35.69%) : Elemol (5.45%), isoshyobunone (5.37%), dan γ-eudesmol (5.31%) .

• Hidrokarbon seskuiterpen (45.55%) : α-bulnesene (10.17%), germacrene B (7.72%), dan α-calacorene (3.02%).

• Monoterpen teroksigenasi (12,34%) : The endo-borneol (5.51%) and α- terpineol (1.44%)

• Hidrokarbon monoterpen (0,53%) : sabinene, D-limonene, γ-terpinene, and p-mentha-1,4(8)-diene.

• Senyawa non terpenoid : methyl linoleate.

• Data komponen penyusun minyak atsiri tersebut cukup sesuai dengan data

yang dilaporkan pada riset-riset terdahulu terkait tumbuhan genus ocimum

lainnya.

Analisis Kemometri minyak atsiri O. Forskaolii dan O. americanum

• Korelasi antara O. forskaolii dan O. americanum terkait dengan senyawa-senyawa dari EO mereka dievaluasi berdasarkan Analisis Komponen Utama (PCA). Analisis menunjukkan variasi yang

signifikan antara kedua spesies Ocimum tersebut (Gambar 3).

• O. forskaolii terpisah di sisi kanan positif PCA, sementara sebaliknya, O. americanum terpisah di sisi kiri PCA menunjukkan variasi yang tinggi dalam komposisi EO mereka.

• O. forskaolii menunjukkan korelasi yang erat dengan endo-fenchol, τ-cadinol, β-atlantol, α-

terpineol, dan α-eudesmol. Di sisi lain, O. americanum menunjukkan korelasi yang erat dengan α- bulnesene, germacrene B, elemol, dan endo-borneol.

• Sisa senyawa tidak menunjukkan korelasi yang jelas dengan spesies tertentu. Ada banyak variabel yang memengaruhi hasil dan komposisi minyak atsiri. Karena saling ketergantungan dan saling pengaruh, komponen-komponen ini kadang-kadang sulit dipisahkan satu sama lain.

• Faktor : fluktuasi musim, bagian tumbuhan, umur tumbuhan, asal ekologis, dan genetik.

• Faktor yang mempengaruhi ragam komponen minyak atsiri : kematangan tumbuhan, senyawa internal tumbuhan, dan interaksi dengan lingkungan eksternal ( tipe tanah, cuaca)

Aktivitas Alelopati (grafik)

• Tidak ditemukan perbedaan signifikan dalam aktivitas alelopati terkait dengan D. aegyptium antara O. forskaolii dan O. americanum untuk perkecambahan biji dan pertumbuhan bibit, sementara variasi yang signifikan terdeteksi secara berdasar dosis.

• Pada konsentrasi terendah EO (25 µL L-1), O. forskaolii dan O. americanum mengurangi perkecambahan biji D. aegyptium sebesar masing-masing 24,0% dan 28,0%.

• Sementara pada konsentrasi tertinggi (100 µL L-1), perkecambahan biji berkurang sebesar 64,05%

dan 72,0%, masing-masingnya (Gambar 4a).

• Di sisi lain, konsentrasi tertinggi dari EO O. forskaolii dan O. americanum (100 µL L-1) menghambat pertumbuhan tunas bibit D. aegyptium sebesar 55,5% dan 57,5%, masing- masingnya (Gambar 4b)

• Namun, pertumbuhan akar bibit D. aegyptium lebih sensitif terhadap EO, di mana

pertumbuhannya menurun sebesar 81,9% dan 82,7% ketika diolah dengan konsentrasi 100 µL L-1 dari O. forskaolii dan O. americanum, masing-masingnya (Gambar 4c). Akar telah dilaporkan lebih sensitif terhadap alelokimia dibandingkan dengan tunas5,6,51 karena akar bersentuhan langsung dengan alelokimia dalam medium dan memiliki membran sel yang lebih permeabel

IC50

•

Berdasarkan nilai IC50, O. forskaolii dan O. americanum menunjukkan aktivitas alelopati tertinggi terhadap perkembangan akar D. aegyptium dengan nilai IC50 masing-masing 35,3 dan 31,3 µL L-1. Selain itu, EO O. forskaolii dan O. americanum menunjukkan nilai IC50 masing-masing 77,5 dan 61,3 µL L-1, untuk perkecambahan biji D. aegyptium.

Akhirnya, pertumbuhan tunas bibit paling tahan, di mana EO O. forskaolii dan O.

americanum mencapai nilai IC50 masing-masing 90,8 dan 88,2 µL L-1 terhadap pertumbuhan tunas.

•

Di sisi lain, untuk aktivitas alelopati terhadap C. murale, variasi signifikan dalam perkecambahan diamati antara kedua spesies yang diteliti (O. forskaolii dan O.

americanum), sementara tidak ada perbedaan signifikan yang ditentukan terkait

pertumbuhan tunas atau akar (Gambar 5). Pada konsentrasi tertinggi dari EO (100 µL L- 1), perkecambahan C. murale berkurang sebesar 94,3% dan 60,7% untuk O. forskaolii dan O. americanum, masing-masingnya (Gambar 5a). Pada konsentrasi yang sama, EO O.

forskaolii dan O. americanum mengurangi pertumbuhan tunas C. murale sebesar 71,4%

dan 50,7%, masing-masingnya (Gambar 5b), sementara pertumbuhan akar dihambat

sebesar 84,5% dan 56,2%, masing-masingnya (Gambar 5c).

IC50

• Berdasarkan nilai IC50, EO O. forskaolii menunjukkan aktivitas alelopati yang lebih tinggi terhadap C. murale dibandingkan dengan O. americanum.

• Terkait perkecambahan C. murale, EO O. forskaolii mencapai nilai IC50 sebesar 58,3 µL L-1, sedangkan O. americanum mencapai nilai IC50 sebesar 76,0 µL L-1.

• Di sisi lain, pertumbuhan tunas C. murale memiliki nilai IC50 sebesar 64,7 dan 95,3 µL L-1 untuk O. forskaolii dan O. americanum, masing-masingnya.

• Sementara pertumbuhan akar memiliki nilai IC50 sebesar 57,3 dan 92,0 µL L-1.

Secara keseluruhan, aktivitas alelopati EO O. forskaolii terhadap kedua gulma (D.

aegyptium dan C. murale) lebih tinggi dibandingkan dengan O. americanum.

Selain itu, akar terpengaruh lebih banyak daripada tunas karena kontak langsung

dengan EO di medium.

•

Aktivitas alelopati yang diamati dari EO O. forskaolii dan O. americanum dapat

diatribusikan pada aktivitas senyawa utama seperti endo-fenchol, τ-cadinol, β-atlantol, α- bulnesene, germacrene B, α-eudesmol, α-terpineol, endo-borneol, isoshyobunone, dan

γ-eudesmol. Semua senyawa ini adalah

senyawa teroksigenasi, kecuali

α-bulnesene yang

merupakan hidrokarbon seskuiterpena.

•

Telah dilaporkan bahwa senyawa teroksigenasi lebih reaktif daripada yang tidak

teroksigenasi, sedangkan senyawa teroksigenasi memiliki lebih banyak kelompok reaktif seperti gugus hidroksil yang bereaksi dan memberikan senyawa dengan lebih banyak reaktivitas.

•

Oleh karena itu, EO yang kaya akan senyawa teroksigenasi biasanya memiliki aktivitas biologis yang lebih tinggi, seperti alelopati dibandingkan dengan EO dengan kandungan senyawa teroksigenasi yang rendah.

•

EO yang kaya akan beberapa senyawa utama yang diidentifikasi ini yang diekstraksi dari

berbagai tanaman telah dilaporkan memiliki aktivitas alelopati yang substansial. EO yang

kaya akan eudesmol dari Launaea spinosa (Forsk.) Sch. Bip. ex Kuntze54 dan Xanthium

strumarium L.55 telah menunjukkan aktivitas alelopati terhadap gulma.

• Juga, telah dilaporkan bahwa EO yang kaya akan germakren dari Xanthium

italicum Moretti dan Symphyotrichum squamatum (Spreng.) G.L.Nesom memiliki aktivitas alelopati yang signifikan terhadap gulma.

• EO yang kaya akan τ-cadinol telah didokumentasikan memiliki efek alelopati yang signifikan seperti EO dari Cullen plicata (Delile) C.H.Stirt. dan Ipomoea carnea

Jacq.

• Senyawa EO dengan kandungan senyawa teroksigenasi tinggi memberikan mode aksi oksidatif di dalam sel yang menyebabkan aksi destruktif bagi komponen vital dalam sel. Senyawa teroksigenasi ini sangat reaktif dan berinteraksi dengan radikal aktif protein, asam nukleat, serta enzim. Senyawa EO juga dapat

mengganggu dinding sel dan mengubah permeabilitas membran sel dengan meningkatkan kebocoran elektrolit. Selain itu, senyawa teroksigenasi dapat

mengubah sistem enzimatik dalam sel tanaman dan mengoksidasi fosfolipid serta

mengubah translokasi, fotosintesis, dan respirasi.

• Senyawa utama dalam studi ini dapat bertindak secara sinergis atau sendiri sebagai alelokimia, namun, hal ini memerlukan klarifikasi lebih lanjut

dengan memeriksa aktivitas alelopati dari bahan otentik dari masing-

masing senyawa dan/atau kombinasi mereka terhadap sekelompok gulma.

• Profil kimia dari EO O. forskaolii dan O. americanum mengungkapkan bahwa senyawa teroksigenasi merupakan konstituen aktif utama dari kedua tanaman meskipun ada variasi kimia di antara mereka.

• Aktivitas alelopati EO O. forskaolii dan O. americanum terhadap gulma D.

aegyptium dalam studi ini sebanding dengan aktivitas berbagai EO yang diekstraksi dari tanaman yang berbeda terhadap gulma ini, seperti

Calotropis procera (Aiton) W.T.Aiton dan Cleome amblyocarpa Barratte &

Murb. Namun, EO tanaman lain menunjukkan aktivitas alelopati yang lebih tinggi terhadap D. aegyptium daripada studi ini, seperti Ochradenus

arabicus Chaudhary, Hillc. & A.G.Mill dan Pulicaria somalensis O. Hoffm.

Kesimpulan

• Untuk pertama kalinya, karakterisasi kimia dari EO Ocimum forskaolii mengungkapkan bahwa ia memiliki 51 senyawa, terutama terpena. Selain itu, karakterisasi kimia dari ekospesies Arab Saudi dari O. americanum menunjukkan keberadaan 61 senyawa kimia. Endo-fenchol, τ-cadinol, β-

atlantol, α-eudesmol, dan α-terpineol melimpah di O. forskaolii, sementara α-bulnesene, germacrene B, endo-borneol, isoshyobunone, dan α-eudesmol melimpah di O. americanum.

• Analisis kemometrik dari kedua EO menunjukkan variasi yang cukup signifikan dalam komposisi kimia yang dapat diatribusikan pada perbedaan genetik mereka.

• EO yang diekstraksi dari O. forskaolii dan O. americanum menunjukkan aktivitas alelopati yang cukup besar terhadap gulma D. aegyptiumi dan C. murale, tanpa adanya variasi spesies-spesifik, meskipun terdapat variasi yang dinilai dalam komposisi kimia dari kedua spesies Ocimum

tersebut.

• Senyawa utama yang teridentifikasi dapat menjadi agen potensial untuk aktivitas alelopati yang ditentukan, di mana mereka dapat bekerja secara tunggal atau dalam sinergi. Studi lebih lanjut direkomendasikan untuk penentuan aktivitas alelopati dari bahan otentik dari senyawa utama sendiri atau dalam kombinasi terhadap berbagai gulma. Selain itu, penelitian kami menunjukkan kesamaan yang erat dalam profil kimia dari O. forskaolii dan yang dilaporkan untuk O. forskolei, oleh karena itu, studi lebih lanjut diperlukan untuk revisi klasifikasi/taksonomi mereka

berdasarkan teknik tinggi seperti alat molekuler.