1
راتخاس یکیتامروفناویب هعلاطم mRNA
DMC 1 نژ نژ نیا یشوماخ تهج
رد لفلف هایگ
هملد Capsicum annuum L. ( یا
)
یماکوچ دوجرف ارهز دمحم ،1
تباث قداص
2
و*
یجان دمحمریما
3
1 دشرا یسانشراک یوجشناد- هب و کیتنژ هورگ
سردم تیبرت هاگشناد ،یزرواشک هدکشناد ،یهایگ یداژن .
2 - هب و کیتنژ هورگ رایداتسا سردم تیبرت هاگشناد ،یهایگ یداژن
.
3 - حلاصا و تعارز هورگ رایداتسا .دهاش هاگشناد ،یزرواشک هدکشناد ،تاتابن
:لوئسم هدنسیون*
هدیکچ
هبRNAi
ناونع نیرتدیدج و
نیرتدماراک رازبا
ندرک شوماخ یصاصتخا
نایب نژ اه سپ و یسیونور حطس رد یسیونور زا
هتخانش
تسا هدش .
آرف رد ی دن ب ی ژولو ی ک ی لوکلوم ،RNAi
رط زاRNA
ی ق راهم فده نژmRNA
ب عنام ، ی نا ونور زا سپ حطس رد نژ ی
س ی و هدش
ط ی ا ی ن آرف ی دن لوکلوم هتشر ودRNA
ا ی ب زا ی نا عم نژ ی ن ی گولج ی ر ی م ی دنک ا . ی ن لاوت رظن زا نژ ی
اب هتشر ودRNA
ا ی تسا گولومه
رط زا راهم و ی
ق زجت ی ه ص فده نژmRNA
ترو م ی گ ی در زا نیا ور ا ی ن شوماخ ناونع هب ،راکوزاس ی
ونور زا سپ ی
س ی .تسا هدش حرطم
راتخاس فدهmRNA
ی ک ی رتمهم زا ی ن ثأت لماوع ی ر آراک رب راذگ یی
شوماخ ی م بوسحم ی
دوش حان راتخاس . ی
ه رد فده وق رثاmRNA
ی
رخت رب ی ب دراد فده نژ تشونور .
هزورما نکت زا هدافتسا ی
ک شوماخ روظنم هب RNAi
ی نژ اه یی ظن ری
DMC1 هتفرگ رارق هجوت دروم
تسا . اسانش تهج ی
ی رتهب ی ن اج ی هاگ شوماخ ی ا ی ن نژ لفلف هایگ رد هملد
یا حان زا ی ه درگ هدافتسا نآORF
ی د دب و ی ن ترت ی ب هزاب اه ی
200 توئلکون ی د ی هلصاف هب 10
توئلکون ی د هت ی ه عومجم رد هک دش 83
لاوت ی 200 nt
نژ زا
DMC1 هب لاوت .دمآ تسد ی
اه روظنم هب
سرت ی م مود راتخاس مرن هب mRNA
تحت رازفا و
ب
mfold
دراو هزاب تفه اهتنا رد و 200 nt
ساسارب صخاش دش باختنا پول هزادنا .
سررب تهج ی
siRNA
دصرد رظن زا اه چمه وGC
ن ی ن سررب ی تارثا
off-target
مرن زا بو تحت رازفا
siRNA Scan
درگ هدافتسا ی
د . لاوت ی
ای ن نژ زا بختنم هزاب تفه
DMC1 هب تروص یتنآ _سنس ای نورتن سنس_ انک ب زا هاگنآ و تفرگ رارق مه ر ی
ن نآ اه
، هزاب یاه 10nt
-
210 و 20nt
- 220 دادعت اب
siRNA
تارثا نتشاد اب و رتمک
off-target
لاوت ناونع هب رتمک ی
یاه دش باختنا بختنم .
سپس رادقم
∆G
ای ن لاوت ی اه سررب ی هک دش صخشم و دش هزاب
10nt
- 210 راد ا ی اپ حطس ی راد ی لااب یی م ی شاب د . د ر تیاهن هزاب 10nt
- 210 دادعت اب
siRNA
و رتمک تارثا
off-target
اپ نتشاد و رتمک ی
راد ی ب ی رتش رتهب ناونع هب ی
ن حان ی ه شوماخ تهج ی
نژ
DMC1 یفرعم دش .
هژاو یاه :یدیلک
نژ ،نژ یشوماخ
DMC1
، راتخاس فدهmRNA
، رثا
off-target
2
همدقم
RNAi1
ی ک شوماخ شور ی
ثؤم لماع هک تسا نژ نآ رد ر
ی ک تنآ ی سنس 24RNA
- 21 توئلکون ی د ی تسا . راکوزاس رد
RNAi
ی ک هتشر ود RNA
ا ی اتبسن نلب د زنآ زا هدافتسا اب ی
م لولس ی اد ی رس هب اهRNA
ی کچوک 24 - 21 توئلکون ی د ی دبت ی ل م ی نآ هب هک دوش اه
هلخادم کچوکRNA 2رگ
م ی وگ ی
(دن
2010 Smagghe, and
Huvenne
) . زا دربراک رظن ی
siRNA
رازبا ی ارب دنمتردق و مهم ی
شوماخ ی
صاصتخا ی ب ی نا نژ تسا اه .
siRNA
عقوم اه ی ت اه ی م رارق فده ار نژ فلتخم ی
دنهد اربانب . ی ن ی ک ی لماوع زا ی راک رب هک ییا شوماخ ی نژ
ثأت ی ر لاوت تسا راذگ ی
siRNA
م ی دشاب (
Luo and Chang, 2004 .)
siRNA
ارب ی اسانش یی فدهRNA
، نی دنمزا ا لاوت هب لاصت ی
RNA
م فده ی دشاب اربانب ی ن مود راتخاس مRNA
ی دناوت ثات لماع ی راذگر رب راک ییا شوماخ راکوزاس ی
ماگنه .دشابRNA
ی راتخاس هک
RNA
ارب ی گرارق ی ر ی
siRNA
ن زاب ی تس کشت و ی ل هب ،دشاب هداد هقاس مود راتخاس روط
ی ه هک ی چ ی سرتسد رد اهزاب زا ک
siRNA
ارب ی
کشت ی ل دناب ه ی نژورد ی گن رارق ی
،در
siRNA
اسانش هب رداق یی
دوب دهاوخن فدهRNA
(
Gredell et al., 2008 .)
کینکت زا هدافتسا هزورما
نژ یشوماخ روظنم هب RNAi
ریظن ییاه
DMC1 و
SPO11 ( تسا هتفرگ رارق هجوت دروم
2015 .,
Yi-Xin et al
.) لحم رد لاعف
ی ت
ئتورپ ی ن اه ی ریظن ی 1 م بلغاDMC
ی ناز ک سار ی گن روا ب ی رتش ( تسا 2007
., et al Mezard
) لیکشت اب یزویم یبیکرتون .
DSB3
اه زاغآ
یم دوش نیا و یارب اهDSB
داجیا گنیسارک روا
یم هدرب راکب دنوش
(
Crismani et al., 2012 .)
ب تاعلاطم ی
شو ی م ی ا یی راتخاس و ی ناشن
م ی دهد هک
DMC1 و
RAD51 تهباشم
اه یی ندش تفج رد لاعف وDNA
ی ت اه ی دنراد هتشر لدابت و
رد هک تسا هداد ناشن تاعلاطم
بارآ ی سپود ی س لات ی
،انا
DMC1 معت هب ی ر تاعطق هتشر ودDNA
ا ی نیب تامورک ی د اه ی غ ی رهاوخر ی م ی دزادرپ (
Da Ines et al., 2013 ).
شور و داوم
شیپ تهج ینیب
یلاوت نژ
DMC1 گ رد هملد لفلف های یا
(
Capsicum annuum
) یلاوت ، نژ نیا هملد لفلف هایگ رد یا
هارمه هب
نآ یلاوت ناهایگ رد
مه ریظن نآ هداوناخ ( یگنرف هجوگ
Solanum lycopersicum
بیس ،) ( ینیمز
Solanum tuberosum
) نوتوت و
(
Nicotiana tabacum
هداوناخ زج یگمه هک )
Solanaceae
دنتسه زا هاگیاپ هداد
NCBI ) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
تفایرد(
دش . یلاوت یاه یتفایرد مرن زا هدافتسا اب رازفا
Megaline ver 5 مه
.دش فیدر یلاوت
مه زا لصاح هاگیاپ هب یفیدر
سرتسد لباقSRA
زا
هاگیاپ و دش هدادNCBI
یلاوت
contig
هب یلامتحا یاه لفلف هایگ زا هدمآ تسد
ملد ه مرن طسوت یا رازفا
Seqman ver 5 مهرس
.دش یدنب
نش کرتشمریغ و کرتشم یحاون ییاسا هدافتسا اب
مرن زا رازفا
Megaline ver 5 تفرگ تروص
نژ یلاوت تیاهن رد و
DMC1 لفلف هایگ رد
هملد شیپ یا .دش ینیب تهج
یشوماخ هاگیاج نیرتهب ییاسانش نیا
هیحان زا نژ
ORF4
دیدرگ هدافتسا نآ .
یلاوت هب اه روظنم میسرت
مود راتخاس هبmRNA
بو تحت رازفا مرن
mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)
.دش هداد یسررب تهج
siRNA
زا اه
1 RNA interference; RNAi
2 short interference RNA; siRNA
3 Double Strand Breaks; DSB
4 Open Reading Frame; ORF
3
دصرد رظن یاوتحم
چمه وGC
یسررب نین تارثا
off-target
مرن زا رازفا تحت بو
siRNA Scan http://bioinfo.noble.org/RNAiScan
)htm)
هدافتسا .دیدرگ
ثحب و جیاتن
تهج تسد یشوماخ هیحان نیرتهب هب یبای نژ
DMC1 ب هزا یاه 200 ن هلصاف هب یدیتوئلکو ره
10 دیتوئلکون رد هک دش هیهت
عومجم 83 یلاوت 200nt
زا نیا هب نژ لودج ( دمآ تسد 1
.) یلاوت بو تحت رازفا مرن هب اه
mfold
دش هداد ا رب اهتنا رد و صخاش ساس
یلاوت پول هزادنا نآ پول هزادنا هک ییاه
زا رتگرزب اه 90nt
یسررب تهج دوب ا یدعب یاه
دش باختن دن
.
لودج 1 - یسررب هزاب یاه 200nt
هیحان زا یلاوتORF
نژ
DMC1 هملد لفلف هایگ یا
پول هزادنا ساسا رب
فیدر یلاوت
(5′ 3′) (nt)پول هزادنا فیدر یلاوت
(5′ 3′) (nt)پول هزادنا فیدر یلاوت
(5′ 3′) (nt)پول هزادنا
1 1-200 80 31 300-500 74 61 600-800 63
2* 10-210 97 32 310-510 87 62 610-810 63
3* 20-220 92 33 320-520 89 63 620-820 80
4 30-230 80 34 330-530 65 64 630-830 73
5* 40-240 91 35 340-540 79 65 640-840 55
6* 50-250 90 36 350-550 89 66 650-850 57
7* 60-260 105 37 360-560 76 67 660-860 61
8* 70-270 94 38 370-570 75 68 670-870 77
9 80-280 76 39 380-580 68 69 680-880 74
10 90-290 76 40 390-590 67 70 690-890 82
11 100-300 67 41 400-600 64 71 700-900 81
12 110-310 73 42 410-610 81 72 710-910 86
13 120-320 81 43 420-620 84 73 720-920 83
14 130-330 85 44 430-630 75 74 730-930 76
15 140-340 86 45 440-640 85 75 740-940 86
16 150-350 80 46 450-650 83 76 750-950 76
17 160-360 74 47 460-660 88 77 760-960 77
18 170-370 83 48 470-670 76 78 770-970 81
19* 180-380 107 49 480-680 79 79 780-980 83
20 190-390 84 50 490-690 80 80 790-990 89
21 200-400 85 51 500-700 76 81 800-1000 82
4
22 210-410 88 52 510-710 75 82 810-1010 89
23 220-420 82 53 520-720 80 83 820-1020 85
24 230-430 80 54 530-730 75
25 240-440 81 55 540-740 74
26 250-450 79 56 550-750 81
27 260-460 86 57 560-760 67
28 270-470 86 58 570-770 82
29 280-480 79 59 580-780 84
30 290-490 76 60 590-790 65
*
2 ، 3 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 و 19 یم رتگرزب پول هزادنا رظن زا بختنم هزاب تفه .دنشاب
یسررب جیاتن
Luo and Chang
( 2004 راتخاس هک یماگنه داد ناشن ) یشوماخ هاگیاج
بختنم زا فدهmRNA
، پول لکش هب
شیازفا نژ یشوماخ ییاراک ،دشاب یم
نیاربانب دبای نیا نیب زا
3 8
،هدش یسررب یلاوت هدش رکذ هزاب تفه
لودج رد 1
، یاراد لاامتحا
نژ قطانم ریاس هب تبسن یرتشیب یشوماخ ییاراک
1
یمDMC
نشاب .د بختنم هزاب تفه نیا مود راتخاس لکش رد
1 هدش هداد ناشن
.تسا جیاتن اب یسررب نیا
Gredell
( ناراکمه و پول راتخاس باختنا رب ینبم )2008
اخ ییاراک شیازفا تهجرد mRNA
نژ یشوم
دراد تقباطم .
5
ب
ج
ه د ب
ز فلا
د
و ه
6
لکش 1 - مود راتخاس نژmRNA
DMC1 . هملد لفلف هایگ یا
فلا ) هزاب 10nt
- 210 ب ) هزاب 20nt
- 220 ج ) هزاب 40nt
- 240
د ) هزاب 50nt
- 250 ه )
ntهزاب 60 - 260 و )
ntهزاب 70 - 270 ز ) هزاب 180nt
- 380
ساسارب یسررب جیاتن
Saravanan
و
Shanmughavel
( 2008 ) مرن رازفا
siRNA Scan
یحارط تهج قیقد یرازبا
siRNA
یاه
یلاصتا هب
mRNA
یم فده دشاب نیاربانب تارثا یسررب تهج
off-target
مرن زا تحت رازفا بو
siRNA Scan
فتسا .دیدرگ هدا دادعت
مک
siRNA
یم دناوت یلاوت ییآراک فدهmRNA
یشوماخ لیسناتپ شهاک ببس و دهد رارق ریثأت تحت ار دوش فده یلاوت
رگید یوس زا
تظلغ یاه یلااب نآ یم اوت دن ا رث
off-target
هتساوخان رب
هک یهاگیاج
siRNA
زا ریغ ینژ راهم ببس و دراذگب تسا هداد رارق فده دروم
فده نژ دوش
رپ هب میقتسم لاصتا اب ای و نیئتو
نآ درکلمع ،اه یلااب تظلغ زا هدافتسا .دهد رارق ریثأت تحت ار اه
siRNA
نکمم یتح
یتنآ یلاوت رد بسانمان دلوف کی داجیا ببس تسا یلاوت اب دناوتن هتساوخان روط هب هدش لیکشت پیتونف و دوش سنس
هک یفدهmRNA
رد نآ یارب دوش لصتم نآ هب و دنک رارقرب طابترا هدش هتفرگ رظن
(
Watts and Corey, 2012 )
نیدب . نیا فادها یاتسار رد بیترت
قیقحت نژ زا بختنم هزاب تفه نیا یلاوت
DMC1 تروص هب یتنآ
_سنس نورتنیا سنس_
رد رگ رارق مه رانک نآ نیب زا هاگنآ و تف
اه
وت یلا دادعت اب ییاه
siRNA
رتمک لیلد هب تارثا نتشاد
off-target
رتمک .دش باختنا بختنم یلاوت ناونع هب هاگنآ
رادقم
∆G
یلاوت یاه
رثا یاراد
off-target
رتمک و یسررب نژ یشوماخ تهج هاگیاج نیرتهب ،لااب یرادیاپ رادقم ساسارب اهتنا رد
DMC1 صخشم دش لودج(
2 سا نیا رب هک ) هداد سا
هب ریز لودج یاه دمآ تسد
:
لودج 2 - یلاوت تفه یسررب نژ
DMC1 رظن زا بختنم نازیم
off-target
هزاب یاه 200nt
نژ زا siRNAدادعت )سنس-نورتنیا-سنسیتنآ( ∆G
210 -
10 7 -511/50
220 -
20 7 -508/80
240 -
40 12 -509/10
250 -
50 11 -512/60
260 -
60 11 -512
270 -
70 9 -511/80
380 -
180 10 -200/20
7
لکش 2 - مود راتخاس (mRNA
یتنآ
-سنس ای نورتن - سنس شوماخ هعطق ) ی
DMC1 نژ هزاب رد 10nt
- 210
یلاوت اهتنا رد 200nt
هزاب اب 10nt
- 210 دادعت اب
siRNA
و رتمک تارثا ندوب اراد
off-target
نتشاد و رتمک ناونع هب رتشیب یرادیاپ
نژ یشوماخ تهج هیحان نیرتهب
DMC1
لکش( دش باختنا 2
.)
هجیتن گ یری
یسررب قبط هتفرگ تروص یاه
siRNA
ییاسانش یارب یلاوت هب لاصتا دنمزاین فده mRNA
نآ یم مود راتخاس نیاربانب دشاب
یمmRNA
راذگریثات لماع دناوت رب مهم
راتخاس هک یماگنه .دشاب یشوماخ راکوزاس ییآراک یریگرارق یاربmRNA
siRNA
تسین زاب
ب هداد هقاس مود راتخاس لیکشت و سرتسد رد اهزاب زا کی چیه هک یروط هب ،دشا
siRNA
،دریگن رارق ینژوردیه دناب لیکشت یارب
siRNA
ییاسانش هب رداق فدهmRNA
تسین یم شهاک یشوماخ ییاراک و اذل .دبای
داد ناشن هدش ماجنا یسررب نژ یلاوت
DMC1
8
هملد لفلف هایگ یا
هزاب رد 10nt
- 210 رتگرزب پول هزادنا نتشاد اب دادعت و
siRNA
تارثا شهاک هب رجنم هک رتمک
off-target
دهاوخ
نژ نیا یشوماخ تهج ادیدناک نیرتهب دش راتخاس تروص هب
یتنآ سنس - نورتنیا - سنس .دوب دهاوخ
عجارم
Crismani, W., Girard, C., Froger, N., Pradillo, M., Santos, J. L., Chelysheva, L., Copenhaver, G.P., Horlow, C., and Mercier, R. (2012). FANCM limits meiotic crossovers. Science, 336(6088): 1588-1590.
Da Ines, O., Degroote, F., Goubely, C., Amiard, S., Gallego, M. E., and White, C. I. (2013). Meiotic recombination in Arabidopsis is catalysed by DMC1, with RAD51 playing a supporting role. PLoS Genetics, 9(9), e1003787.
Gredell, J. A., Berger, A. K., and Walton, S. P. (2008). Impact of target mRNA structure on siRNA silencing efficiency: a large‐ scale study. Biotechnology and Bioengineering, 100(4): 744-755.
Huvenne, H., and Smagghe, G. (2010). Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. Journal of Insect physiology, 56(3): 227-235.
Luo, K. Q., and Chang, D. C. (2004). The gene-silencing efficiency of siRNA is strongly dependent on the local structure of mRNA at the targeted region. Biochemical and Biophysical Research Communications, 318(1): 303- 310.
Mezard, C., Vignard, J., Drouaud, J., and Mercier, R. (2007). The road to crossovers: plants have their say. TRENDS in Genetics, 23(2): 91-99.
Saravanan, V., and Shanmughavel, P. (2008). SiRNA scanner-A fuzzy logic based tool for small interference RNA design.The Journal Proteomics Bioinformat, 1(1): 154-160.
Watts, J. K., and Corey, D. R. (2012). Silencing disease genes in the laboratory and the clinic. The Journal of Pathology, 226(2): 365-379.
Yi-Xin, G. U. A. N., Wang, B. H., Yan, F. E. N. G., and Ping, L. I. (2015). Development and application of marker- assisted reverse breeding using hybrid maize germplasm. Journal of Integrative Agriculture, 14(12): 2538-2546.
9
Bioinformatics study of DMC 1 gene mRNA structure to silence this gene in Bell pepper (Capsicum annuum L.)
Farjood Chokami Zahra1, Sabet Mohammad Sadegh2 and Naji Amirmohammad3
1,2- Department Plant Genetics and Breeding. Tarbiat Modares University. Tehran. Iran [email protected]
3- Departement Agronomy and Plant Breeding. Shahed University. Tehran. Iran
Abstract
RNAi is known as the newest and most effective tool of proprietary gene silencing at the transcriptional and post-transcriptional levels. In the biological process of RNAi, the RNA molecule restrain the gene expression in post-transcriptional levels by inhibiting the target gene mRNA.
During this process, the double-stranded RNA molecule prevents a specific gene expression. This gene is homologous to the double-stranded RNA in terms of sequence and the inhibition is accomplished through the decomposition of target gene mRNA. Hence, this mechanism is presented as a post-transcriptional silencing. The structure of target mRNA is one of the most important factors affecting the efficiency of silencing. The structure of target site in mRNA has a strong effect on the destruction of target gene transcription. Nowadays, the use of RNA techniques for silencing genes such as DMC1 has been considered. The ORF region was used to determine the best silence position of this gene in a sweet pepper plant. Thus, 200 nucleotide bands were prepared at a distance of 10 nucleotides, with a total of 83 sequences of 200 nt from the DMC1 gene. The sequences were
10
entered into the mfold web application to map the second structure of the mRNA; at the end, seven bands of 200 nt were selected based on the loop size indicator. The siRNA Scan software was used to investigate siRNAs in terms of GC percentage, as well as to evaluate off-target effects. The sequence of these seven selectable bands of the DMC1 gene put together in the form of antisense- intron-sense. Then, the bands of 10-210 nt and 20-220 nt with less siRNA and less off-target effects were selected as selected sequences. Then the values of ΔG of these sequences were examined. It was found that the band of 10-210 nt has a high stability level. Finally, the band of 10-210 nt with a less siRNA and less off-target effects, and having high stability, introduced as the best area for DMC1 gene silencing.
Keywords: Gene silencing, DMC1 gene, Target gene structure mRNA, Effect of off-target
