市川総合病院角膜センター

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市川総合病院角膜センター

プロフィール

1. 教室員と主研究テーマ

助教比嘉一成 1) メチルセルロースを用いた角膜輪部上皮オルガノイドの長期培養法の確立 2) 口腔粘膜由来間葉系幹細胞の眼表面疾患モデルにおける効果

3) 羊膜由来間葉系幹細胞の眼表面疾患モデルにおける効果 4) 結膜上皮モデルの作成とジクアホソルナトリウムの影響 6) 羊膜バンクにおける保存管理システムの開発

コーディネーター青木大 5) 当院におけるRoutine Referral Systemの運用分析 6) 羊膜バンクにおける保存管理システムの開発 7) DSAEK術における人工前房内圧とカット方式の比較

佐々木千秋 5）当院におけるRoutine Referral Systemの運用分析 6）羊膜バンクにおける保存管理システムの開発 7）DSAEK術における人工前房内圧とカット方式の比較

西迫宗大 5）当院におけるRoutine Referral Systemの運用分析 6) 羊膜バンクにおける保存管理システムの開発 7）DSAEK術における人工前房内圧とカット方式の比較

2. 成果の概要

１）メチルセルロースを用いた角膜輪部上皮オルガノイドの長期培養法の確立

我々はこれまでに角膜上皮の幹細胞と幹細胞を維持する環境であるニッシェを分離し、オルガノイド培養法を用いることで長期培養を可能としてきた。これにより、輪部機能不全を伴った難治性の疾患に対する適応の拡大が期待される。本研究ではさらに再生医療として現実性を高めるため、すでに化粧品や医薬としても利用されているメチルセルロースを用いて、オルガノイドのさらなる長期維持培養法の確立を目指している。培養１ヶ月後においてメチルセルロースを用いても比較的小さいが、オルガノイドを形成し、mRNA レベル並びにタンパクレベルでの発現において、角膜輪部上皮のフェノタイプである K15 並びに p63 の発現を維持していることがわかってきた。また、形成したオルガノイドの増殖能を調べるため、コロニー形成能についても検討したとろ、増殖能を示すコロニーを形成することがわかった。今後はオルガノイドの保存法並びに移植法についても検討する予定である。

比嘉一成輪部機能不全モデルウサギへの角膜輪部オルガノイド移植角膜カンファランス 2019 学会雑誌. 一般演題（口演）P.52, 2019

比嘉一成角膜輪部オルガノイドの輪部機能不全モデルへの移植

第 18 回日本再生医療学会プログラム一般演題（ポスター）1 日目 P227, 2019

2) 口腔粘膜由来間葉系幹細胞の眼表面疾患モデルにおける効果

間葉系に属する細胞へ分化する能力を持つ間葉系幹細胞は様々な組織でもその存在の報告がなされており、近年、再生医療でも注目されている。我々はこれまでに、口腔粘膜の上皮下組織から間葉系細胞を分離・培養し、解析を行ってきた。今回我々は眼表面疾患モデルにおける細胞治療の効果を調べるため、口腔粘膜由来間葉系幹細胞の眼表面疾患モデルへの移植を検討した。移植後の細胞を追跡するため、まず MRI コントラスト造影剤として使われている SPION(Supper Paramagnetic Iron Oxide Nanoparticles (Fe3O4：四酸化三鉄))でラベルした。眼表面疾患モデルはウサギ角膜上皮に上皮欠損を作成し、結膜下に 5.0 x10⁵ cells/eye で投与を行なった。投与後の観察において、口腔粘膜由来間葉系幹細胞を投与した群では創傷治癒促進効果がある傾向を観察することができた。投与後回収した組織において移植した細胞が存在し、生着していること確認することができた。

3) 羊膜由来間葉系幹細胞の眼表面疾患モデルにおける効果

我々は羊膜由来間葉系細胞が羊膜の持つ効果にどのように影響を与えているか明らかにするため、 i n vitro 上皮創傷治癒モデルへの影響を観察し、羊膜由来間葉系細胞にも創傷治癒促進効果があることを報告

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した。今回は、さらに羊膜から分離培養した間葉系細胞(AMMCs)を解析し、ウサギ角膜上皮欠損モデルに対する羊膜由来間葉系細胞培養上清の効果を観察した。フローサイトメトリーにおいて、AMMCs はいわゆる間葉系幹細胞と少し異なる発現パターンを示し、炎症性物質分解酵素である CD10 や神経堤由来関連因子(CD49d、

PDGFRa)、線維芽細胞マーカー(FSP-1)の発現が観察された。AMMCs の培養上清を点眼または結膜下注射することにより、ウサギ創傷治癒モデルにおける上皮化が促進されることを観察した。以上のことから羊膜の持つ創傷治癒促進効果は羊膜に存在する間葉系細胞が一部役割を担っている可能性が考えられた。

Kazunari Higa. Effects of amniotic membrane mesenchymal stem cells for the corneal epithelial proliferation and differentiation. ARVO 2018 Annual Meeting, Program May 2 P.286, 2018

4) 結膜上皮モデルの作成とジクアホソルナトリウムの影響

角膜上皮に対するジクアホソルナトリウムの効果はこれまでに数多く報告されているが、in vitro における結膜上皮に対する影響はあまり報告されていない。そこで杯細胞を伴った結膜上皮シートを作成し、P 2 Y2

受容体を介したムチン分泌促進作用を持つジクアホソルナトリウムによる結膜上皮シートへの影響を観察した。結膜上皮モデル作成において、数層に重層化した結膜上皮シートを作成することができた。また、血清を添加することによって、杯細胞を誘導することが可能であり、P2Y2受容体並びに MUC5AC を発現した結膜上皮シートできることがわかった。さらに、UTP 添加によって杯細胞が増加する傾向を観察することができた。

今回作成した結膜上皮シートは杯細胞を伴った結膜上皮モデルとして有用である可能性が考えられた。現在、

さらに有用な培養条件を検討中である。

5）当院におけるRoutine Referral System の運用分析

11年半の期間中、死亡退院連絡6594例に対し、4444例（67.4%）の意思確認を実施し、389人（8.8%）が献眼に至った。献眼者の特徴として、性比は男性227人（58.4%）・女性162人（41.6%）であり、男性が多い結果となった。年齢組成は80歳代が最も多く119人（30.6%）次いで70歳代103人（26.5%）・60歳代72人（18.5％）となった。死因は悪性新生物が最も多く169人（43.3%）・心疾患58人（14.9％）・その他の疾患56人（18.5%）

となった。各項目の全体に占める割合は、60歳代、悪性新生物、脳血管障害において献眼者群が死亡退院群より有意（P<0.05）に高い値となった。提供承諾の内訳は意思表示カード等あり20人（5.1%）・本人の提供意思あり54人（13.9%）・家族の希望による承諾315人（81.0%）であった。

西迫宗大東京歯科大学市川総合病院における Routine Referral System の運用分析日本組織移植学会雑誌 (一般口演)第 17 号 No.1 P,51. 2018

6) 羊膜バンクにおける保存管理システムの開発

認定バンクを取得後、院内を経て院外シッピングも軌道に乗り、さらに組織の保存管理、その後のトレーサビリティまで一連の工程の質の担保が重要になっている。そのため、提供から保存、供給、移植情報まで管理する羊膜保存管理システムを開発、導入した。このシステムにより、データの管理、入出庫管理、廃棄処理、

羊膜の保存場所の管理、すべての履歴の記録、管理を行う事が可能となった。

佐々木千秋羊膜眼ンクのおける保存管理システムの開発と導入日本組織移植学会雑誌(一般口演) 第 17 号 No.1 P,52. 2018

7) DSAEK術における人工前房内圧とカット方式の比較

高品質な内皮移植術用角膜組織片（DSAEKグラフト）の作製は、アイバンクに課せられた重要な使命である。

本研究ではDSAEKグラフト作製法の至適条件を定める事を目的とした。30眼の研究用ヒト角膜を5つの異なる条件下でカットし、カットの深さ・厚みの均一性・内皮細胞ダメージ・切断面を評価した。カット深度・グラフト厚の均一性は、人工前房内圧200 mm Hgでカットした場合100 mm Hg群と比較して、厚みの差が統計学的に有意に少なく観察された。内皮細胞の密度・生存率は、全ての実験系間で統計学的有意差を認めなかった。カット断面の観察において、200 mm Hgで作製されたグラフトのSEM画像は粗く観察されたが、同時に粗さを示すスコアーはカット深度と正の相関を認めた。以上の結果より、DSAEKグラフト作製において、人工前

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3. 学外共同研究

担当者研究課題

学外研究施設

研究施設所在地責任者

比嘉一成羽藤晋

ヒト iPS 細胞由来角膜内皮様細胞のウサギ角膜への移植

慶應義塾大学医学部眼科学教室

東京都

新宿区榛村重人

4. 科学研究費補助金・各種補助金

研究代表者研究課題研究費科研費の場合は種別も記載

比嘉一成

メチルセルロースを用いた角膜輪部上皮オルガノイドの長期

培養法の確立

日本学術振興会科学研究費助成事業基盤研究(C)

島崎潤羊膜由来間葉系幹細胞の眼表面疾患モデルにおける効果

佐竹良之口腔粘膜由来間葉系幹細胞の眼表面疾患モデルにおける効果

島﨑潤羊膜の保存方法と容器の開発日本アルコン株式会社

研究助成

5. 研究活動の特記すべき事項

学会招待講演・特別講演・教育講演

講演者年月日演題学会名開催地

青木大 2018. 2.17 手続きと関連ガイドライン

【羊膜移植講習会】

第 42 回日本角膜学会総会・

第 34 回日本角膜移植学会広島市

佐々木千秋 2018.10.14 手続きと関連ガイドライン

【羊膜移植講習会】第 72 回日本臨床眼科学会東京都千代田区

佐々木千秋 2019. 2. 9 手続きと関連ガイドライン

【羊膜移植講習会】

第 35 回日本角膜移植学会京都市

西迫宗大 2019. 2. 9

DSAEK グラフト作製における人工前房内圧設定およびカット法の至適条件を探る

【モーニングセミナー】

第 35 回日本角膜移植学会京都市

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学術学会に相当しない団体が開催するセミナー・研究会・カンファレンス等における発表・講演

講演者年月日演題会合の名称開催地

青木大 2018.11.

2- 4 組織提供について

第 17 回日本移植コーディネーター協議会(JATOCO) 総合研修会

東京都大田区

6. 教育に関する業績、活動

教育に関する講演（医学・歯学における教育をテーマとするものに限る）

講演者年月日演題学会・研究会・会議名開催地

青木大 2018. 7. 9 眼科学「アイバンク」東京歯科大学第 4 学年東京都千代田区

比嘉一成 2018. 7. 9 眼科学「角膜の再生」東京歯科大学第 4 学年東京都千代田区

教育ワークショップ・FD 研修

講演者年月日ワークショップ名役割開催地

青木大 2018. 2.

10-11

病院開発〜ターゲット病院戦略〜2017 年度第 2 回 JOTNWCo・都道府県 Co・院内 Co・

組織移植 Co・アイバンク Co・合同セミナー

講師福岡市

佐々木千秋 2018. 4.19

角膜センター紹介アイバンクと角膜移植.

東京歯科大学市川総合病院新人看護師オリエンテーション

講師市川市

青木大 2019. 4.25

組織バンクと組織移植コーディネーターの役割 (公社)日本臓器移植ネットワーク

新人コーディネーター研修会

講師東京都港区

青木大 2018. 5.23 角膜センター紹介

読売光と愛の事業団アイバンク見学会講師市川市

佐々木千秋 2018. 5.23 ダミーヘッドを用いての摘出術

西迫宗大 2018. 5.23 アイバンクと角膜移植

青木大 2018. 6. 9

角膜センター紹介アイバンクと角膜移植

東邦大学医療センター大森病院眼科アイバンク見学実習会

講師市川市

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講演者年月日ワークショップ名役割開催地

青木大 2018. 6.30

角膜センター紹介

移植医療における感染制御

杏林大学保健学部バイオセーフティ学

講師市川市

佐々木千秋 2018. 6.30 アイバンクと角膜移植

杏林大学保健学部バイオセーフティ学講師市川市

佐々木千秋 2018. 8.23 アイバンクとコーディネーターの仕事

(公社)千葉県看護協会主催ふれあい看護体験講師市川市

青木大 2018. 8.26

組織移植各論

2018 年度第 1 回 JOTNWCo・都道府県 Co・院内 Co・

組織移植 Co・アイバンク Co・合同セミナー

講師千葉市

佐々木千秋 2018. 9.13

角膜センター紹介アイバンクと角膜移植.

東京歯科大学市川総合病院薬剤部学生研修

講師市川市

佐々木千秋 2018.10.25 アイバンクコーディネーターの仕事

職場体験学習(市川市市立第二中学校) 講師市川市

佐々木千秋 2018.11.15 アイバンクコーディネーターの仕事

職場体験学習(昭和学院中学校) 講師市川市

佐々木千秋 2019. 1.22

角膜センター紹介アイバンクと角膜移植

東京歯科大学市川総合病院薬剤部学生研修

講師市川市

他の大学・研究機関等における大学生・大学院生を対象とする講義・実習

担当者名年月日テーマ・演題大学・機関所在地

青木大

2018. 4.23

角膜移植とアイバンク

東邦大学医学部第 3 学年眼科学

東京都大田区

市川総合病院 角膜センター