NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu 1. Phương pháp điều tra
2.4.4. Nhân giống cây Chùm ngây in vitro
2.4.4.1. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng bằng NaClO đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro từ hạt giống Chùm ngây Ninh Thuận
- Phương pháp khử trùng:
Khử trùng ngoài tủ cấy: hạt Chùm ngây chín thu hoạch được rửa sạch sơ bộ bằng dung dịch nước xà phòng loãng để loại bỏ chất bẩn bám trên bề mặt. Sau đó rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy sao cho hết xà phòng, tráng lại mẫu bằng nước cất sạch.
Khử trùng trong tủ cấy vô trùng: hạt được rửa bằng nước cất vô trùng, lắc mạnh trong 3 phút để tiếp tục loại bỏ các chất bẩn còn bám trên bề mặt (lặp lại 3 lần). Sau đó tiến hành sát khuẩn bề mặt quả bằng dung dịch cồn 70% bổ sung Tween 20 (4 giọt/100 mL dung dịch) trong 2 – 3 phút (lắc mạnh) rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng (3 lần). Tiếp theo, khử trùng hạt bằng dung dịch 0,1%
(w/v) HgCl2 trong 2 phút, sau đó khử trùng tiếp bằng dung dịch 20% (v/v) NaClO trong 10 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần rồi loại bỏ vỏ hạt.
Sử dụng hoá chất NaClO nồng độ 20%, 30% với thời gian khử trùng khác nhau, sau đó rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng để loại bỏ hoá chất bám trên bề mặt tránh gây độc cho phôi hạt.
- Cấy mẫu vào môi trường và nuôi cấy:
Cấy mẫu vào môi trường: hạt sau khi khử trùng được đặt lên đĩa inox vô trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước trên bề mặt hạt, sau đó dùng panh
cấy gắp từng hạt và cấy lên môi trường nuôi cấy khởi động: MS + 7 g agar/L + 30 g sucrose/L, pH = 5,8.
Điều kiện nuôi cấy: Trong tuần đầu các bình mẫu được nuôi trong điều kiện tối, sau đó mới chuyển ra nuôi dưới ánh sáng giàn đèn huỳnh quang trắng, cường độ chiếu sáng 35 µE/m2/s, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày.
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm hai yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (RCD), 3 lần lặp lại. Yếu tố A là 2 nồng độ NaClO (A1: 20% và A2:
30%) và yếu tố B là 2 khoảng thời gian khử trùng (B1: 5 phút và B2: 10 phút).
Quy mô thí nghiệm: Số nghiệm thức thí nghiệm: 2 x 2 = 4 nghiệm thức; số ô cơ sở: 4 x 3 = 12 ô cơ sở; mỗi ô cơ sở gồm 40 mẫu.
- Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi: Các chỉ tiêu được theo dõi ở thời điểm sau 2 tuần nuôi cấy.
+ Tỷ lệ mẫu sạch (%): số mẫu sạch/tổng số mẫu cấy x 100.
+ Tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm (%): số mẫu sạch nảy mầm/tổng số mẫu sạch x 100.
2.4.4.2. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro từ đoạn chồi giống Chùm ngây Ninh Thuận
- Phương pháp khử trùng:
Khử trùng ngoài tủ cấy: chồi Chùm ngây bánh tẻ (kích thước 10 – 15 cm chứa mắt ngủ) được cắt bỏ phần lá, rửa sạch sơ bộ bằng dung dịch nước xà phòng loãng để loại bỏ chất bẩn bám trên bề mặt (dùng chổi rửa nhẹ nhàng). Sau đó rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy sao cho hết xà phòng, tráng lại mẫu bằng nước cất sạch (tráng 3 lần).
Khử trùng trong tủ cấy vô trùng: chồi được rửa bằng nước cất vô trùng, lắc mạnh trong 3 phút để tiếp tục loại bỏ các chất bẩn còn bám trên bề mặt (lặp lại 3 lần). Sau đó tiến hành sát khuẩn bề mặt quả bằng dung dịch cồn 70 % bổ sung Tween 20 (4 giọt/100 mL dung dịch) trong 1 phút (lắc nhẹ) rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng (3 lần). Sử dụng hoá chất HgCl2 nồng độ 0,1% với thời gian khử trùng khác nhau, sau đó rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng.
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát về quy trình vi nhân giống Chùm ngây Mẫu cấy: Hạt/chồi bánh
tẻ
Môi trường nuôi cấy thích hợp
Khử trùng mẫu Chuẩn bị môi trường
đúng cách
Nuôi cấy khởi động (Môi trường vào mẫu)
Nhân nhanh chồi (Môi trường nhân
nhanh)
Ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh (Môi trường ra rễ)
Huấn luyện cây con
Đưa cây ra trồng trong Nhà lưới
Đánh giá tỉ lệ sống, sinh trưởng
- Cấy mẫu vào môi trường và nuôi cấy:
Cấy mẫu vào môi trường: chồi sau khi khử trùng được đặt lên đĩa inox vô trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước trên bề mặt chồi, sau đó dùng mũi dao cấy cắt chồi thành các đoạn chồi có chiều dài (2 – 2,5 cm) chứa ít nhất một mắt ngủ. Các đoạn chồi sau đó được cấy lên môi trường nuôi cấy khởi động:
MS + 7 g agar/L + 30 g sucrose/L + 0,5 mg BAP/L, pH = 5,8.
Điều kiện nuôi cấy: bình mẫu được nuôi dưới ánh sáng giàn đèn huỳnh quang trắng, cường độ chiếu sáng 35 µE/m2/s, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày.
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 4 nghiệm thức là 4 thời gian xử lý HgCl2 0,1% khác nhau (5 phút, 8 phút, 10 phút, 12 phút), 3 lần lặp lại.
Quy mô thí nghiệm: Số ô cơ sở: 4 x 3 = 12 ô cơ sở; mỗi ô cơ sở gồm 40 mẫu.
- Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi: thực hiện như thí nghiệm 3.
2.4.4.3. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng tạo cụm chồi Chùm ngây in vitro
- Các chồi Chùm ngây in vitro nuôi cấy 2 tuần trên môi trường MS từ Thí nghiệm 3, 4 được cắt thành các đoạn có kích thước 1,0 – 1,5 cm và cấy chuyển sang môi trường tái sinh tạo cụm chồi (MS + 30 g sucrose/L + 7 g agar/L) bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP với hàm lượng khác nhau.
- Điều kiện nuôi cấy: bình mẫu được nuôi dưới ánh sáng giàn đèn huỳnh quang trắng, cường độ chiếu sáng 35 µE/m2/s, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày.
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 7 nghiệm thức là 7 hàm lượng BAP khác nhau (0 mg/L; 0,5 mg/L; 1,0 mg/L; 1,5 mg/L; 2,0 mg/L; 2,5 mg/L; và 3,0 mg/L), 3 lần lặp lại, mỗi ô cơ sở gồm 40 mẫu cấy.
- Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi:
+ Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%): tổng số mẫu tái sinh chồi/tổng số mẫu cấy x 100.
+ Hệ số nhân chồi/lần: tổng số chồi mới tạo thành/tổng mẫu cấy ban đầu.
+ Chiều cao chồi (cm): tổng chiều cao các chồi/tổng số chồi.
Các chỉ tiêu được theo dõi ở thời điểm sau 2 tuần nuôi cấy.
2.4.4.4. Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP, TDZ và NAA đến khả năng tạo cụm chồi Chùm ngây in vitro
- Tham khảo một số tài liệu đã nghiên cứu về nhân giống cây Chùm ngây (Saini và ctv, 2012; Mylene và Evalour, 2011; Lalida và ctv, 2013; Priscila và Cathrine, 2014), trong nghiên cứu này xác định ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ và NAA đến khả năng tái sinh tạo cụm chồi Chùm ngây in- vitro. Hàm lượng BAP phù hợp được xác định ở thí nghiệm 5.
- Các chồi Chùm ngây in vitro nuôi cấy 2 tuần trên môi trường MS từ Thí nghiệm 3, 4 được cắt thành các đoạn có kích thước 1,0 – 1,5 cm và cấy chuyển sang môi trường tái sinh tạo cụm chồi (MS + 30 g sucrose/L + 7 g agar/L) bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP (1,5 mg/L), TDZ và NAA với hàm lượng khác nhau.
- Điều kiện nuôi cấy: bình mẫu được nuôi dưới ánh sáng giàn đèn huỳnh quang trắng, cường độ chiếu sáng 35 µE/m2/s, thời gian chiếu sáng 14 giờ/ngày.
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), 6 nghiệm thức [(0,2 g TDZ/L + 0 g NAA/L), (0,5 g TDZ/L + 0 g NAA/L), (1,0 g TDZ/L + 0 g NAA/L), (0 g TDZ/L + 0,2 g NAA/L), (0 g TDZ/L + 0,5 g NAA/L) và (0 g TDZ/L + 1,0 g NAA/L)], 3 lần lặp lại, mỗi ô cơ sở gồm 40 mẫu cấy.
- Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi: như thí nghiệm 5.
2.4.4.5. Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và hàm lượng sucrose