TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây Chùm ngây 1. Sơ lược về cây Chùm ngây
1.2.2. Một số phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 1. Phương pháp chỉ thị hình thái
Sự đa dạng di truyền có thể được phát hiện dựa vào các biểu hiện hình thái.
Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo đếm được – gen đó có thể được xem là gen chỉ thị. Chỉ thị hình thái là một trong những phương pháp sơ khai trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền.
Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái hiện diện trong tự nhiên cũng rất ít, không thỏa mãn yêu cầu của nhiều chương trình chọn giống và chỉ có quy mô hình thái (cơ quan) hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt của cá thể. Hình thái (kiểu hình) là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gen với môi trường, chỉ thị hình thái của cây trồng bị tác động mạnh bởi điều kiện tự nhiên và canh tác. Do vậy, để hạn chế sự tác động này, trong công tác chọn tạo giống cần sưu tầm các giống cây trồng ở các điều kiện sinh thái khác nhau và trồng trong cùng một điều kiện canh tác như nhau sẽ giảm tác động không mong muốn của điều kiện môi trường (Đỗ Quang Huy và ctv, 2009).
1.2.2.2. Phương pháp chỉ thị isozyme
Isozyme là các dạng protein có cùng phản ứng enzyme nhưng có sự khác nhau khi chạy điện di. Kỹ thuật điện di được dùng để đo sự di động của phân tử protein trong một khoảng thời gian nhất định, trên điện trường đồng nhất. Các protein đột biến khác nhau về điện tích sẽ có sự di chuyển khác nhau nên có thể phát hiện sự khác nhau giữa chúng bằng kỹ thuật điện di. Sự khác nhau này phản ánh sự khác nhau trong kích thước và cấu trúc của phân tử protein. Trong nhiều trường hợp, còn liên quan tới sự thay thế bởi một axít amin trong phân tử protein do đột biến từ alen này sang alen khác.
Nhờ kỹ thuật điện di, cùng lúc có thể phân tích nhiều cá thể của một quần thể nào đó để đánh giá chính xác số phần trăm dị hợp tử của một gen nhất định. Nó cho
biết sự đa dạng giữa các nhóm sinh vật theo các protein được quan sát. Tuy việc áp dụng chỉ thị isozyme đã làm thay đổi việc nghiên cứu đa dạng di truyền theo chiều hướng thuận lợi hơn, nhưng số chỉ thị cũng quá ít, không thỏa mãn cho nhu cầu nghiên cứu (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005).
1.2.2.3. Phương pháp chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử đã chứng minh có tầm quan trọng hơn về lâu dài so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme, do số lượng của nó gấp hơn nhiều lần so với chỉ thị isozyme (Tanksley và ctv, 1991). Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể được xem là một chỉ thị phân tử. Các chỉ thị phân tử có thể chia làm hai nhóm như sau:
- Chỉ thị dựa vào phương pháp lai DNA (DNA – DNA hydridization based):
RFLP (Restriction Fragment Length Polymophism), minisatellite.
- Chỉ thị dựa vào phương pháp PCR: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymophism), Microsatellite (ISSR, SSR), SNP.
Sau đây là một số chỉ thị phân tử được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền cây Chùm ngây:
* Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
AFLP được định nghĩa là sự đa hình chiều dài các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR.
AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự primer, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt. Thông thường, enzyme cắt giới hạn sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thường xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thường xuyên (nhằm hạn chế số lượng các đoạn cắt). Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI - MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn
adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Primer của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích.
AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các primer sử dụng không cần đặc hiệu loài (các primer thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài). Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005).
* Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
RAPD được định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên. PCR RAPD thực hiện dựa trên cơ sở sự bắt cặp ngẫu nhiên của các primer đơn ngắn (10 nucleotide) với mạch khuôn. Các đoạn primer oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách có thể khuếch đại được (dưới 3000 bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước khác nhau sau khi khuyếch đại.
Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã có một sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và primer. Các primer dùng trong RAPD thường ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA bộ gen. Do đó tính đa dạng thu được nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một base nitơ nào đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa primer và DNA mạch khuôn. Sự mất đoạn nhiễm sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn primer cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại.
Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng như nguyên tắc phản ứng PCR thông thường. Tuy nhiên, vì sử dụng primer ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của primer
thấp để tạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt. Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 300C – 360C. Chính vì yếu tố đặc hiệu thấp nên kết quả RAPD thường có độ lặp lại không cao và khó tối ưu phản ứng. Đây chính là trở ngại lớn nhất của RAPD vì kết quả phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thành phần phản ứng PCR (đặc biệt là thành phần Mg2+ và chất lượng DNA bản mẫu), các thiết bị cũng như thao tác thí nghiệm.
Ngoài ra RAPD là một marker trội do đó những gen điều khiển tính trạng lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trong điện di (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005).