KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Xây dựng qui trình nhân giống in vitro cây Chùm ngây 1. Tạo mẫu sạch in vitro cây Chùm ngây
3.4.2. Tái sinh tạo cụm chồi in vitro
3.4.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng tạo cụm chồi
BAP là chất điều hoà sinh trưởng tổng hợp nhân tạo thuộc nhóm cytokinin, có tác dụng tích cực trong việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của mô phân sinh và làm hạn chế sự hoá già của tế bào. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, BAP có vai trò rất quan trọng trong việc kích thích mạnh mẽ sự hình thành các chồi non, quyết định hệ số nhân và chất lượng chồi. Theo báo cáo của Joarder và ctv (1993), BAP thuộc nhóm cytokinin rất tốt cho việc phát sinh chồi cây Neem. BAP tốt hơn các cytokinin khác trong việc cảm ứng phát sinh chồi ở cây thân gỗ (Thakur và ctv, 1997; Zamam và ctv, 1992). Sử dụng BAP trong cảm ứng tạo chồi cây Chùm ngây in vitro cũng đã được nhiều tác giả báo cáo (Eufrocinio, 2010; Thidarat và ctv 2011; Saini và ctv, 2012). Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu của các tác giả đều cho thấy sử dụng cùng nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP, nhưng giống Chùm ngây khác nhau cho tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi và số chồi tái sinh
khác nhau. Trong nghiên cứu này, khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP giao động từ (0,5 – 3,0 mg/L) đến khả năng tái sinh chồi giống Chùm ngây Ninh Thuận. Các chồi Chùm ngây tái sinh từ Thí nghiệm 3, 4 sau hai tuần nuôi cấy trên môi trường khởi động. Đoạn thân cây được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước 1,0 – 1,5 cm cấy lên các công thức môi trường cảm ứng tạo cụm chồi. Kết quả thí nghiệm thu thập sau 2 tuần nuôi cấy và được trình bày ở Bảng 3.16.
Số liệu ở Bảng 3.16 cho thấy trong môi trường không bổ sung BAP, mẫu cấy vẫn tái sinh chồi với tỉ lệ 65,0% và số chồi trung bình/mẫu là 1,2. Trong khi đó, môi trường bổ sung BAP nồng độ 0,5 – 3,0 mg/L cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi ≥ 70,3% và số chồi trung bình/mẫu ≥ 2,3 cao hơn so với môi trường không bổ sung BAP. Chất điều hòa sinh trưởng BAP có ảnh hưởng rõ rệt đến tỉ lệ mẫu Chùm ngây tái sinh chồi khi nuôi cấy in vitro.
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng tạo cụm chồi sau 2 tuần nuôi cấy
BAP (mg/L)
Tỉ lệ mẫu tái sinh chồi (%)
Số chồi/mẫu (chồi)
Chiều cao chồi (cm)
0,0 (Đ/C) 65,0 e 1,2 f 2,5 d
0,5 74,3 c 2,3 e 2,7 c
1,0 90,3 b 5,8 b 4,5 a
1,5 95,3 a 8,4 a 4,2 b
2,0 90,0 b 4,5 c 2,1 e
2,5 70,3 d 3,3 d 2,2 e
3,0 72,7 cd 2,5 e 1,7 f
CV%
P
2,7
<0,01
5,2
<0,01
4,3
<0,01
Trong cùng một nhóm trung bình, các giá trị có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa thống kê mức P < 0,01.
Nghiệm thức môi trường dinh dưỡng MS bổ sung BAP nồng độ từ 1,0 – 2,0 mg/L cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao > 90%, số chồi trung bình/mẫu dao động từ 4,5 – 8,4 chồi. Sử dụng BAP nồng độ thấp 0,5 mg/L hoặc nồng độ cao 2,5 – 3,0 mg/L cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi chỉ dao động từ 70 đến 74%, số chồi trung bình/mẫu thấp dao động từ 2,3 đến 3,3 chồi và chiều cao chồi cũng thấp. Trong 7 nghiệm thức thí nghiệm, nghiệm thức môi trường bổ sung 1,5 mg BAP/L cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất (95,3%), số chồi trung bình/mẫu (hệ số nhân chồi) cũng cao nhất 8,4 chồi và chiều dài trung bình của chồi đạt 4,2 cm. Kết quả nghiên cứu thu được cũng tương tự như các tác giả đã công bố. Thidarat và ctv (2011) nghiên cứu nhân giống Chùm ngây in vitro có nguồn gốc từ tỉnh Chiang Rai, Thái Lan, sử dụng nồng độ 1 – 2 mg BA/L cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi 100%, số chồi trung bình/mẫu dao động từ 5,2 – 10,8 chồi cao hơn khi sử dụng BA ở các nồng độ khác. Vi nhân giống Chùm ngây (Variety-PKM1) có nguồn gốc từ Đại học khoa học Nông nghiệp Ấn độ, khi sử dụng BAP nồng độ 1,0 – 2,0 mg/L giai đoạn tái sinh chồi cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất từ 90 – 94% và số chồi trung bình/mẫu là 8,3 – 9,0 chồi (Saini và ctv, 2012). Như vậy, từ kết quả nghiên cứu này và kết quả nghiên cứu của các tác giả nêu trên cho thấy sử dụng BAP hoặc BA ở nồng độ từ 1,0 – 2,0 mg/L cho giai đoạn tái sinh chồi Chùm ngây là phù hợp; xuất xứ Chùm ngây khác nhau ảnh hưởng rõ rệt đến tỉ lệ mẫu tái sinh và số chồi/mẫu.
Vi nhân giống Chùm ngây xuất xứ tỉnh Ninh Thuận giai đoạn tái sinh chồi (tạo cụm chồi), mẫu nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng MS + 30g sucrose/L + 7g agar/L bổ sung 1,5mg BAP/L là nghiệm thức môi trường tốt nhất trong số các nghiệm thức môi trường thí nghiệm.
3.4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, TDZ và NAA đến khả năng tạo cụm chồi Nhằm xác định tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng (ĐHST) với nồng độ thích hợp cho giai đoạn nuôi cấy tái sinh cụm chồi Chùm ngây, trong môi trường nuôi cấy ngoài bổ sung chất ĐHST là BAP 1,5 mg/L, trong thí nghiệm này còn bổ sung thêm TDZ và NAA ở các nồng độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.17.
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, TDZ và NAA đến khả năng tạo cụm chồi sau 2 tuần nuôi cấy
BAP (mg/L)
TDZ (mg/L)
NAA (mg/L)
Tỉ lệ % mẫu tái sinh chồi
Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm)
1,5
0,2 0 85,7 a 6,2 a 3,7 a
0,5 0 72,5 bc 5,3 b 4,0 a
1,0 0 60,5 d 5,0 c 2,7 b
0 0,2 75,0 b 3,4 d 2,5 b
0 0,5 68,8 c 2,2 e 2,0 c
0 1,0 63,0 d 2,1 e 1,4 d
CV%
P
3,7
<0,01
1,4
<0,01
4,9
<0,01 Trong cùng một nhóm trung bình, các giá trị có cùng ký tự đi kèm khác biệt không có ý nghĩa thống kê mức P < 0,01.
Kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.17 cho thấy khi sử dụng chất ĐHST BAP hàm lượng 1,5 mg/L kết hợp với các chất ĐHST TDZ và NAA hàm lượng từ 0,2 – 1,0 mg/L cho tỉ lệ mẫu tái sinh chồi dao động từ 60,5 – 85,7% và số chồi/mẫu dao động từ 2,1 – 6,2 chồi, thấp hơn so với nghiệm thức môi trường nuôi cấy tái sinh chồi chỉ bổ sung BAP đơn lẻ 1,5 mg/L (tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi 95,5%, số chồi/mẫu là 8,4 chồi). Các báo cáo của nhiều tác giả cũng cho thấy khi nhân giống Chùm ngây in vitro ở giai đoạn tái sinh tạo cụm chồi sử dụng BAP đơn lẻ là tốt nhất, còn khi kết hợp với các chất khác (TDZ, NAA, IBA) thì tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi và số chồi hữu hiệu/mẫu thấp (Eufrocinio, 2010; Mylene và Evalour, 2011;
Thidarat, 2011).
Trong các nghiệm thức nghiên cứu cho thấy nghiệm thức môi trường bổ sung BAP hàm lượng 1,5 mg/L và TDZ hàm lượng 0,2 mg/L cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 85,7% và số chồi/mẫu là 6,2 chồi, cao nhất trong các nghiệm thức thí nghiệm. Nghiệm thức môi trường bổ sung BAP hàm lượng 1,5 mg/L và NAA hàm
lượng 1,0 mg/L cho tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi, số chồi/mẫu và chiều cao chồi thấp nhất.