Kultur irisan ovari diaplikasikan pada dua genotipe yaitu Dchi-11 dan Dchi-13 pada tahap T7 (Gambar 14F). Kuncup bunga diberi perlakuan
penyimpanan pada suhu 4 oC selama 1 hari, kemudian ovari dipotong menjadi
empat bagian dan di tanam pada 3 macam media induksi M6 =1,13 µM 2,4-D +
9,04 µM 2,4-D + 4,44 µM BAP + 30 g L-1 sukrosa (Fu et al. 2008) dan M10 =
MS + 4,52 µM 2,4-D + 4,44 µM BAP + 20 g L-1sukrosa (Mosqueraet al. 1999).
Kultur diinkubasi dalam kondisi gelap pada suhu 4 oC selama 1 minggu kemudian
dilanjutkan pada dengan inkubasi terang pada suhu 25oC.
Percobaan faktorial disusun dalam rancangan acak kelompok 4 ulangan. Faktor pertama ialah genotipe dan faktor kedua ialah media induksi. Setiap unit percobaan terdiri atas satu cawan petri berisi 4 potongan eksplan. Pengamatan kalus dilakukan pada 1 bulan setelah tanam. Pengamatan dilakukan pada persentase terbentuknya kalus. Data yang diperoleh dalam bentuk persen ditransformasi ke dalam Arcsin. Untuk nilai 0% sebelum ditransformasi diganti dengan 1/4n, di mana n ialah jumlah satuan percobaan dari data persentase diperoleh. Regenerasi eksplan yang membentuk kalus diseleksi kemudian
disubkultur pada media WT + 0,06 µM NAA + 2,22 µM BAP + 30 g L-1sukrosa.
Setelah planlet terbentuk, planlet dipindahkan ke media MS tanpa ZPT.
Analisis ragam dilakukan menggunakan program SAS Release Window 9.1 untuk melihat pengaruh nyata/tidak nyata dari perlakuan. Jika terdapat perbedaan nilai rata-rata perlakuan maka dilakukan uji lanjutan menggunakan uji wilayah berganda Duncan 5%.
☎n✆✝✞✟✞s ploidi
Evaluasi awal level ploidi planlet dilakukan pada planlet dengan mengamati jumlah kloroplas dalam sel penjaga stomata pada daun ke 3-4. Hasil analisis jumlah kloroplas dalam sel penjaga stomata di verifikasi melalui pengamatan langsung pada kromosom yang dilakukan di Puslitbang Biologi LIPI menggunakan potongan meristem pucuk berdasarkan metode Darnaedi (1991).
Potongan tersebut direndam dalam larutan 0,002 M 8-Hydroxyquinolinselama 3-5
jam pada suhu 4 oC, kemudian dibilas dengan akuades, dan difiksasi dalam 45%
asam asetat selama 10 menit. Potongan pucuk (meristem) dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi campuran larutan1 N HCl dan 45% asam asetat dengan
perbandingan 1:3, kemudian diinkubasi ke dalam air dengan suhu 60oC selama 1-
5 menit, dan diwarnai dengan aceto-orcein 2%. Setelah itu potongan meristem
ditekan pada object glass, kemudian diamati dibawah mikroskop dengan
pembesaran 1000 x untuk perhitungan jumlah kromosom.
Selain mengamati jumlah kloroplas pada sel penjaga stomata dan jumlah
ini dilakukan di Pusat Penelitian Biologi LIPI, Cibinong menggunakan alat
CyFlow® space (Partec GmbH) yang dilengkapi dengan diode pumped solid-
state laser 920 mW) pada panjang gelombang 488 nm and laser diode pada
panjang gelombang 638 nm (25 mW).
Potongan daun (0.5 cm2) dicacah menggunakan silet di dalam cawan petri
yang berisi 250 µl buffer ekstraksi. Setelah 30 90 detik buffer ekstraksi disaring menggunakan Partec 30 µl CellTrics filter. Pewarnaan menggunakan PI (Propidium Iodide) dan Rnase (1 ml), selanjutunya diinkubasi selama 30 menit
sebelum dianalisis dalam flow cytometer. Sebagai kontrol digunakan tanaman yang telah diketahui ploidinya.
✠n✡☛☞✌☞s ☞sozim
Bahan tanaman menggunakan daun yang masih segar (1 g). Daun tersebut digunting halus dimasukkan ke dalam mortar yang telah diberi pasir kuarsa dengan menambahkan buffer pengekstrak sebanyak 0,5 ml, kemudian digerus sampai halus. Selanjutnya kertas saring yang ukurannya disesuaikan dengan kebutuhan dimasukkan dalam mortar untuk menyerap cairan sel daun yang telah hancur. Kertas saring yang telah menyerap cairan sel dari setiap sampel dibersihkan untuk kemudian disisipkan pada gel yang telah dilubangi.
Elektroforesis dilakukan dalam ruangan atau lemari es pada suhu antara 5
10 oC. Elektroforesis awal selama 30 menit pada 100 volt dan dielektroforesis
tetap pada 150 atau 200 watt selama 3 sampai 4 jam. Setelah selesai elektroforesis gel dibelah menjadi dua atau tiga (sesuai ketebalan) pada posisi horizontal. Kertas saring sebelumnya dikeluarkan dari lubang-lubang. Lembaran gel dimasukkan dalam nampan, kemudian diberi pewarna esterase (EST) dan peroksidase (PER). Nampan selanjutnya ditutup dengan aluminium foil diinkubasi pada suhu ruang sampai muncul pita-pita pada gel yang cukup jelas.
Pewarna esterase (EST) mengandung 100 m Sodium fosfat pH 7 (100 ml), 1-Naftil asetat (50 mg), 2-Naftil asetat (5 mg), dan Aseton (100 mg). Pewarna peroksidase (PER) mengandung 50 mM Natrium asetat pH 5(100 ml), CaCl2 (50 mg), H2O2 3% (0,5 ml), 3-Amino-9etilkarbason(50 mg), Aseton/N,N- Dimethylformamid (5 ml). Setelah pewarnaan gel dicuci dengan air mengalir sampai bersih, kemudian difiksasi dengan 50% gliserol ; 50% etanol. Kemudian gel didokumentasi.
l
ercobaan 1. Induksi Ginogenesis melalui Kultur Irisan Multi Ovul
Eksplan irisan multi ovul ialah poros bunga yang berisi ovul, yang dipotong menjadi empat bagian. Eksplan yang berwarna putih tersebut langsung ditanam dalam media inisiasi. Tahap inisiasi awal, ovul akan membesar dan sampai pada minggu ke dua inisiasi, bila ovul dan poros bunga berubah menjadi berwarna hijau menunjukkan bahwa eksplan tersebut berespon terhadap komponen media dan hormon. Kemudian setelah tiga minggu ovul atau poros bunga akan mengalami dediferensiasi membentuk kalus. Persentase kalus dihitung berdasarkan banyaknya kalus yang terbentuk pada setiap eksplan. Eksplan yang tidak berespon terhadap media induksi, maka jaringan ovul akan mati dan berwarna coklat kehitaman (Gambar 16A dan B). Eksplan yang responsif pada media, ovul maupun poros bunga akan tetap berwarna hijau dan terlihat adanya inisiasi kalus (Gambar 16C dan D).
Gambar 16. Pembentukan kalus pada eksplan irisan multi ovul A. ovul dan poros bunga tidak membentuk kalus, poros bunga dan ovul mati, B. kalus terbentuk pada poros bunga, ovul mati C. kalus terbentuk pada ovul. D kalus pada poros bunga dan ovul.
Hasil penelitian pada kultur irisan multi ovul menunjukkan bahwa setiap genotipe memberikan respon yang berbeda. Persentase rata-rata terbentuknya
kalus pada irisan multi ovul berkisar 0 29,17% (Tabel 10). Hasil analisis
varians diperoleh bahwa interaksi antara media induksi dengan genotipe berpengaruh nyata. Pengaruh interaksi media dengan genotipe ini menunjukkan bahwa genotipe berespon spesifik terhadap media tertentu (Tabel 10). Genotipe Dchi-11 membentuk kalus pada media M6 (WT + 1,13 µM 2,4-D + 0,06 µM
NAA + 2,27 µM TDZ + 30 g L-1sukrosa), Dchi-13 dan Dchi-16 pada media M10
(MS + 4,52 µM 2,4-D + 4,44 µM BAP + 20 g L-1 sukrosa), serta Dchi-14 dan
Dchi-15 pada M7 (MS + 9,04 µM 2,4-D + 4,44 µM BAP + 30 g L-1 sukrosa).
Berbeda dengan media M6, M7 dan M10, kedua media tersebut tidak mengandung auksin dalam bentuk 2,4-D. Hasil ini sama dengan kultur antera pada media padat, dimana kalus terbentuk pada antera yang ditanam pada media inisiasi kalus yang mengandung 2,4-D. Persentase terbentuknya kalus tertinggi dicapai oleh genotipe Dchi-11 pada media M6. Media M6 terdiri atas media dasar WT dengan penambahan 1,13 µm 2,4-D+ 0.06 µm NAA + 2,27 µm TDZ.
Tabel 10. Interaksi media dengan genotipe terhadap persen hasil pembentukan kalus pada kultur irisan multi ovul pada umur 4 MSI (minggu setelah inisiasi).
Media Persen terbentuknya kalus pada berbagai genotipe Rata-rata
Dchi-11 Dchi-13 Dchi-14 Dchi-15 Dchi-16
M6 29,17 D 16,67 B 4,17 A 4,17 A 0,00 A 10.83 A d c ab b a M7 14,58 C 12,50 B 27,08 C 25,69 d 12,5 B 18.47 B b a c cd a M8 0,00 A 0,00 A 10,42 AB 4,17 A 2,08 A 3.33 A a a b ab a M9 2,08 AB 6,25 B 4,17 A 12,5 BC 2,08 A 5.42 A a ab ab b a M10 8,33 BC 25,00 C 12,5 B 18,75 C 27,08 C 18.33 B a bc a ab c Rata-rata 10.83 a 12.08 a 11.67 a 13.06 a 8.75 a
Keterangan: Angka rataan yang diikuti oleh huruf latin yang sama dalam baris yang sama, huruf kapital pada kolom yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata menurut uji wilayah berganda Duncan pada taraf kepercayaan 5%. M6 = WT + 1,13 µM 2,4-D+ 0,06 µM
NAA + 2,27 µM TDZ + 30 g L-1sukrosa, M7 = MS + 9,04 µM 2,4-
D+ 4,44 µM BAP + 30 g L-1 sukrosa, M8 = MS + 1,9 µM NAA +
4,44 µM BAP + 60 g L-1sukrosa, M9 = MS + 0,57 µM NAA + 4,54
µM TDZ + 20 g L-1sukrosa dan M10 = MS + 4,52 µM 2,4-D+ 4,44
µM BAP + 20 g L-1sukrosa
Regenerasi
Kalus hasil kultur irisan multi ovul diseleksi dan dipilih kalus yang dominan berasal dari bagian ovul. Bagian dan diregenerasikan pada dua media regenerasi (Tabel 11).
Media R11 (WT + 0,06 µM NAA + 2,22 µM BAP) lebih baik dibandingkan dengan media R7 (WT + 2.22 µM BAP) untuk regenerasi kalus ginogenik. Sebagian besar kalus dari semua jenis eksplan beregenerasi menghasilkan pembungaan lebih awal yang langsung keluar dari kalus atau
melalui terbentuknya daun dengan batang atauinternode yang pendek, dan bunga
keluar setelah buku ke 1 3. Kuncup bunga dan organ-organ lain keluar tidak
Hasil pengamatan menunjukkan bahwa saat munculnya tunas dari eksplan yang berasal dari irisan multi ovul beragam. Apabila bunga muncul langsung dari kalus menghasilkan bunga yang abnormal yang memiliki variasi susunan bagian- bagian bunga yaitu mahkota bunga + kelopak (Gambar 17A); Kelopak + antera (Gambar 17B); Kelopak saja (Gambar 17C) dan kelopak + putik (Gambar 17D).
Tabel 11. Regenerasi kalus empat genotipe hasil kultur irisan multi ovul
Jenis eksplan
Genotipe Media asal (inisiasi kalus) Media regenerasi Jumlah massa kalus/ embrio Jumlah kalus yang ber organogenesis Saat muncul tunas (MSI) Irisan multi ovul Dchi-11 M10 R7 6 2 12 - 32 Dchi-11 M10 R11 7 4 Dchi-13 M10 R7 3 0 Dchi-13 M10 R11 3 1 11 Dchi-14 M10 R7 1 0 - Dchi-14 M7 R11 1 0 - Dchi-15 M7 R7 2 0 - Dchi-15 M7 R11 1 1 28 Dchi-15 M10 R7 3 0 - Dchi-15 M10 R11 4 3 14 - 28
Keterangan: MSI = minggu setelah inisiasi. R7 (WT + 2,22 µM BAP + 30 g L-1
sukrosa); R8 (WT + 0,44 µM BAP + 30 gL-1sukrosa) dan R11 (WT
+ 0,06 µM NAA + 2,22 µM BAP + 30 g L-1sukrosa)
Gambar 17. Hasil regenerasi dari kalus yang terinduksi membentuk bunga tidak lengkap (A) petal dan kelopak saja, (B) antera dan kelopak saja, (C) kelopak saja dan (D) kelopak dan putik saja. (E dan F) pemanjangan batang genotipe Dchi- 11-42 pada media WT + 0,5 mg L-1Gibberelin + 15 g L-1 sukrosa, bunga
masih keluar dari ujung tunas, (G) hasil aklimatisasi regeneran dengan bagian bunga sepal dan petal, (H) sepal dan antera, (I) sepal saja.
Upaya untuk mendapatkan regeneran yang tumbuh menjadi planlet yang
WT + 15 g L-1 sukrosa. Sampai saat ini upaya ini berhasil hanya pada Dchi-11 hasil kultur irisan multi ovul (Dchi-11-42 dan Dchi-11-134) tetapi bunga masih tetap muncul pada tunas baru (Gambar 17E dan F) bahkan bunga masih keluar setelah aklimatisasi (Gambar 17G, H dan I).
Aklimatisasi
Hasil aklimatisasi regeneran Dchi-11-42 dan Dchi-11-134 hasil kultur irisan multi ovul yang terinduksi bunga prematur mampu tumbuh di lapang dan
regeneran tetap memiliki bagian-bagian bunga yang sama seperti pada saat in
vitro. Hasil kultur irisan multi ovul hanya satu regeneran yang tumbuh menjadi
tanaman normal yaitu Dchi-11-34. Dchi-11-34 berjumlah 13 tanaman yang bervariasi pada bentuk dan ukuran tanaman serta bentuk petal (Gambar 18A). Untuk melihat regeneran tersebut apakah berasal dari jaringan vegetatif atau
generatif dari maternal maka sampel Dchi-11-34-1 dilakukan selfing (Gambar
18C) dan di analisis dengan isozim (Gambar 19).
Gambar 18. Morfologi tanaman dan bunga hasil kultur irisan multi ovul. (A) variasi
bentuk petal diantara Dchi-11-34, (B) tanaman Dchi-11-34-1, (C) keseragaman tanaman hasilselfingDchi-11-34-1.
Gambar 19. Hasil analisis isozim dengan enzim (A) peroksidase,(B) esterase pada tanaman hasil kultur irisan multi ovul. 11 = tanaman donor Dchi-11; 34 = regeneran hasil kultur irisan multi ovul Dchi-11-34.
✍
WT + 15 g L-1 sukrosa. Sampai saat ini upaya ini berhasil hanya pada Dchi-11
hasil kultur irisan multi ovul (Dchi-11-42 dan Dchi-11-134) tetapi bunga masih tetap muncul pada tunas baru (Gambar 17E dan F) bahkan bunga masih keluar setelah aklimatisasi (Gambar 17G, H dan I).
Aklimatisasi
Hasil aklimatisasi regeneran Dchi-11-42 dan Dchi-11-134 hasil kultur irisan multi ovul yang terinduksi bunga prematur mampu tumbuh di lapang dan
regeneran tetap memiliki bagian-bagian bunga yang sama seperti pada saat in
vitro. Hasil kultur irisan multi ovul hanya satu regeneran yang tumbuh menjadi
tanaman normal yaitu Dchi-11-34. Dchi-11-34 berjumlah 13 tanaman yang bervariasi pada bentuk dan ukuran tanaman serta bentuk petal (Gambar 18A). Untuk melihat regeneran tersebut apakah berasal dari jaringan vegetatif atau
generatif dari maternal maka sampel Dchi-11-34-1 dilakukan selfing (Gambar
18C) dan di analisis dengan isozim (Gambar 19).
Gambar 18. Morfologi tanaman dan bunga hasil kultur irisan multi ovul. (A) variasi
bentuk petal diantara Dchi-11-34, (B) tanaman Dchi-11-34-1, (C) keseragaman tanaman hasilselfingDchi-11-34-1.
Gambar 19. Hasil analisis isozim dengan enzim (A) peroksidase,(B) esterase pada tanaman hasil kultur irisan multi ovul. 11 = tanaman donor Dchi-11; 34 = regeneran hasil kultur irisan multi ovul Dchi-11-34.
✎
WT + 15 g L-1 sukrosa. Sampai saat ini upaya ini berhasil hanya pada Dchi-11
hasil kultur irisan multi ovul (Dchi-11-42 dan Dchi-11-134) tetapi bunga masih tetap muncul pada tunas baru (Gambar 17E dan F) bahkan bunga masih keluar setelah aklimatisasi (Gambar 17G, H dan I).
Aklimatisasi
Hasil aklimatisasi regeneran Dchi-11-42 dan Dchi-11-134 hasil kultur irisan multi ovul yang terinduksi bunga prematur mampu tumbuh di lapang dan
regeneran tetap memiliki bagian-bagian bunga yang sama seperti pada saat in
vitro. Hasil kultur irisan multi ovul hanya satu regeneran yang tumbuh menjadi
tanaman normal yaitu Dchi-11-34. Dchi-11-34 berjumlah 13 tanaman yang bervariasi pada bentuk dan ukuran tanaman serta bentuk petal (Gambar 18A). Untuk melihat regeneran tersebut apakah berasal dari jaringan vegetatif atau
generatif dari maternal maka sampel Dchi-11-34-1 dilakukan selfing (Gambar
18C) dan di analisis dengan isozim (Gambar 19).
Gambar 18. Morfologi tanaman dan bunga hasil kultur irisan multi ovul. (A) variasi
bentuk petal diantara Dchi-11-34, (B) tanaman Dchi-11-34-1, (C) keseragaman tanaman hasilselfingDchi-11-34-1.
Gambar 19. Hasil analisis isozim dengan enzim (A) peroksidase,(B) esterase pada tanaman hasil kultur irisan multi ovul. 11 = tanaman donor Dchi-11; 34 = regeneran hasil kultur irisan multi ovul Dchi-11-34.
Hasil analisis isozim diperoleh bahwa sampel tanaman Dchi-11-34-1 memiliki jumlah pita berbeda satu pita dibanding kontrol (tanaman donor Dchi- 11) berdasarkan enzim peroksidase, sedangkan sistem enzim esterase memperlihatkan posisi pita yang sama dengan tanaman donor, namun memiliki
ketebalan yang berbeda. Hasil sellfing Dchi-11-34-1 dan diperoleh progeni yang
seragam pada fase generatif (Gambar 19C) sehingga terdapat indikasi kemungkinan Dchi-34-1 adalah haploid ganda.