Pembentukan kalus pada antera dimulai dengan membesarnya ukuran antera, diikuti dengan pecahnya kotak antera di daerah stomium (Gambar 11). Selain itu juga terjadi perubahan warna antera menjadi coklat (Gambar 11A) atau ungu (Gambar 11B). Pada kondisi antera berada pada jalur terbentuknya polen yang masak, pada umumnya berubah menjadi warna ungu. Perubahan warna antera diduga karena aktifitas etilen. Selanjutnya pada stomium akan terjadi
diferensiasi akibat respon terhadap komponen media dan hormon (Gambar 11C). Sel kompeten ini akan berubah menjadi meristematik yang aktif membelah. Antera yang tidak mampu membelah akan berwarna coklat tua sampai kehitaman (Gambar 11D).
Gambar 11. Perkembangan pembentukan kalus pada antera Dianthus chinensis.
(A) Antera membesar dan dinding antera merekah, (B) dinding antera warna ungu yang merekah, (C) rekahan dinding antera mulai membentuk kalus pada minggu ke 3, (D) antera yang tidak responsif akan kisut berwarna coklat kehitaman, (E) kalus 30 hari setelah inisiasi, (F) kalus 45 hari setelah inisiasi, (G) kalus 3 bulan setelah inisiasi. Panah merah = antera yang tidak respon, panah putih = antera yang merekah, panah hijau = antera mati berwarna coklat kehitaman. Bar = 1 mm
Komposisi media dan genotipe memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap pertumbuhan antera, namun interaksi antara media dan genotipe tidak berpengaruh nyata. Respon pertumbuhan yang baik umumnya ditandai dengan kondisi antera yang tetap segar dan inisiasi kalus pada daerah belahan antera, meskipun sebagian besar mati akibat pencoklatan (Gambar 10D). Antera yang tetap segar memiliki peluang terinduksi membentuk kalus, meskipun tidak setiap antera yang segar dapat membentuk kalus. Kalus terus tumbuh dan berkembang dan terlihat jelas 1 bulan setelah inisiasi (Gambar 10E) dan 3 bulan setelah inisiasi (Gambar 10G).
Hasil analisis data tidak terdapat interaksi antara genotipe dengan media. Persentase pembentukan kalus genotipe Dchi-13 lebih tinggi, tetapi lebih lambat dalam membentuk kalus dibandingkan genotipe Dchi-11 (Tabel 6). Dchi-13
➴
➷
diferensiasi akibat respon terhadap komponen media dan hormon (Gambar 11C). Sel kompeten ini akan berubah menjadi meristematik yang aktif membelah. Antera yang tidak mampu membelah akan berwarna coklat tua sampai kehitaman (Gambar 11D).
Gambar 11. Perkembangan pembentukan kalus pada antera Dianthus chinensis.
(A) Antera membesar dan dinding antera merekah, (B) dinding antera warna ungu yang merekah, (C) rekahan dinding antera mulai membentuk kalus pada minggu ke 3, (D) antera yang tidak responsif akan kisut berwarna coklat kehitaman, (E) kalus 30 hari setelah inisiasi, (F) kalus 45 hari setelah inisiasi, (G) kalus 3 bulan setelah inisiasi. Panah merah = antera yang tidak respon, panah putih = antera yang merekah, panah hijau = antera mati berwarna coklat kehitaman. Bar = 1 mm
Komposisi media dan genotipe memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap pertumbuhan antera, namun interaksi antara media dan genotipe tidak berpengaruh nyata. Respon pertumbuhan yang baik umumnya ditandai dengan kondisi antera yang tetap segar dan inisiasi kalus pada daerah belahan antera, meskipun sebagian besar mati akibat pencoklatan (Gambar 10D). Antera yang tetap segar memiliki peluang terinduksi membentuk kalus, meskipun tidak setiap antera yang segar dapat membentuk kalus. Kalus terus tumbuh dan berkembang dan terlihat jelas 1 bulan setelah inisiasi (Gambar 10E) dan 3 bulan setelah inisiasi (Gambar 10G).
Hasil analisis data tidak terdapat interaksi antara genotipe dengan media. Persentase pembentukan kalus genotipe Dchi-13 lebih tinggi, tetapi lebih lambat dalam membentuk kalus dibandingkan genotipe Dchi-11 (Tabel 6). Dchi-13
➬ ➮
➱ ✃
diferensiasi akibat respon terhadap komponen media dan hormon (Gambar 11C). Sel kompeten ini akan berubah menjadi meristematik yang aktif membelah. Antera yang tidak mampu membelah akan berwarna coklat tua sampai kehitaman (Gambar 11D).
Gambar 11. Perkembangan pembentukan kalus pada antera Dianthus chinensis.
(A) Antera membesar dan dinding antera merekah, (B) dinding antera warna ungu yang merekah, (C) rekahan dinding antera mulai membentuk kalus pada minggu ke 3, (D) antera yang tidak responsif akan kisut berwarna coklat kehitaman, (E) kalus 30 hari setelah inisiasi, (F) kalus 45 hari setelah inisiasi, (G) kalus 3 bulan setelah inisiasi. Panah merah = antera yang tidak respon, panah putih = antera yang merekah, panah hijau = antera mati berwarna coklat kehitaman. Bar = 1 mm
Komposisi media dan genotipe memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap pertumbuhan antera, namun interaksi antara media dan genotipe tidak berpengaruh nyata. Respon pertumbuhan yang baik umumnya ditandai dengan kondisi antera yang tetap segar dan inisiasi kalus pada daerah belahan antera, meskipun sebagian besar mati akibat pencoklatan (Gambar 10D). Antera yang tetap segar memiliki peluang terinduksi membentuk kalus, meskipun tidak setiap antera yang segar dapat membentuk kalus. Kalus terus tumbuh dan berkembang dan terlihat jelas 1 bulan setelah inisiasi (Gambar 10E) dan 3 bulan setelah inisiasi (Gambar 10G).
Hasil analisis data tidak terdapat interaksi antara genotipe dengan media. Persentase pembentukan kalus genotipe Dchi-13 lebih tinggi, tetapi lebih lambat dalam membentuk kalus dibandingkan genotipe Dchi-11 (Tabel 6). Dchi-13
menghasilkan kalus lebih banyak dan berbeda secara signifikan (P<0.05) dibandingkan dengan Dchi-11. Dari Tabel 7 tersebut jelas terlihat bahwa genotipe donor merupakan faktor kunci keberhasilan pembentukan kalus.
Table 7. Respon dua genotipeD. chinensis(rataan persentase terbentuknya kalus
dan waktu terbentuknya kalus) pada media induksi kalus
Genotipe Persentase antera
membentuk kalus (%)
Waktu terbentuknya kalus (hari)
Dchi-11 2,50 b 19,50
Dchi-13 18,75 a 31,88
Keterangan: Angka rataan yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang
sama menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji wilayah berganda Duncan pada taraf kepercayaan 5%.
Media AD4 merupakan media dasar yang paling potensial untuk kultur
antera Dianthus chinensis. Komposisi media tersebut mampu menginduksi
persentase antera tertinggi membentuk kalus (17,50%) dibandingkan media yang lain walaupun dengan media AD1 dan AD3 tidak berbeda nyata (Tabel 8). Kesesuaian kombinasi dan konsentrasi hormon diduga juga mempengaruhi komposisi media dasar dalam pembentukan kalus. Kombinasi antara 9,04 µM 2,4- D+ 2,27 µM TDZ + 5,71 µM NAA pada media dasar WT (AD4) sesuai untuk
pembentukan kalus D. chinensis. Kombinasi antara 2,26 µM 2,4-D+ 4,54 µM
TDZ + 2,22 µM BAP + 5,71 µM NAA pada media dasar WT (AD2) paling sedikit membentuk kalus.
Tabel 8. Pengaruh media terhadap persentase antera membentuk kalus dan waktu
terbentuknya kalus pada genotypeD. chinensis
Media Persentase antera
membentuk kalus (%)
Waktu mulai terbentuknya kalus (hari)
AD1 10,0 ab 36,0
AD2 5,0 b 38,0
AD3 10,0 ab 25,0
AD4 17,5 a 28,5
Keterangan: Angka rataan yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan uji wilayah berganda Duncan pada taraf kepercayaan 5%. AD1 = WT + 1,13 µM 2,4-D+ 2,85 µM NAA + 4,54 µM TDZ + 2,22 µM BAP, AD2 = WT + 2,26 µM 2,4-D+ 5,71 µM NAA + 4,54 µM TDZ + 2,22 µM BAP, AD3 = WT + 4,52 µM 2,4-D+ 5,71 µM NAA + 2,27 µM TDZ + 2,22 µM BAP dan AD4 = WT + 9,04 µM 2,4-D+ 5,71 µM NAA + 2,27 µM TDZ
Waktu mulai terbentuknya kalus pada semua media berkisar antara 25 sampai 38 hari setelah induksi (Tabel 7). Waktu terbentuknya kalus tercepat adalah genotipe yang di tanaman pada media AD4 yaitu 25 hari setelah induksi.
Media AD4 yang merupakan media terbaik selanjutnya digunakan untuk
verifikasi dan diaplikasikan pada genotipe lain (Dianthus barbatus, Dianthus
chinensis Dchi-12 dan Dchi-15). Verifikasi media dilakukan pada genotipe-
genotipe ini karena pada saat perlakuan genotipe-genotipe ini belum berbunga. Hasil yang diperoleh hanya genotipe Dchi-12 dan Dchi-15 yang dapat membentuk kalus (Gambar 12). Hasil ini menunjukkan bahwa setiap genotipe membutuhkan media yang spesifik. Pada umumnya kalus terbentuk 3 - 4 minggu setelah kultur.
Gambar 12. Verifikasi media AD4 kultur antera (A) Dianthus barbatus, (B)
Dianthus chinensis Dchi-12 dan (C) Dianthus chinensis Dchi-15.
Bar = 1 mm
❒ercobaan 2. Pertumbuhan dan regenerasi kalus hasil kultur antera
Dianthussp.
Regenerasi kalus menggunakan media dasar yang sama dengan media induksi kalus, tetapi dengan mengurangi konsentrasi auksin dan sitokinin. Dari delapan media regenerasi yang diuji hanya media R7 dan R11 yang sesuai untuk regenerasi (Tabel 9). Eksplan Dchi-13-148-3 dengan media induksi awal AD3 (Gambar 13A), eksplan mampu beregenerasi pada media R7, sedangkan eksplan Dchi-11-171-4 dengan media induksi awal AD4 (Gambar 13B), eksplan mampu beregenerasi pada media R11. Pada pembentukan kalus dan regenerasi genotipe Dchi-13 lebih tinggi dibandingkan dengan Dchi-11. Media regenerasi lain seperti R6, R8, R9, R10, R12 dan R13 menghambat diferensiasi tunas (Gambar 13C). Pemberian 0,285 µM NAA dan 2,22 µM BAP pada media R11 mampu meningkatkan persentase kalus yang beregenerasi dibandingkan media R7 yang hanya berisi 2,22 µM BAP.
Kalus yang mampu beregenerasi, satu bulan berikutnya disubkultur ke media MS tanpa zat pengatur tumbuh. Pertumbuhan selanjutnya regeneran mampu memperbanyak diri pada media tersebut, tetapi semua kalus terinduksi
bunga prematur. Bentuk kuncup bunga juga tidak normal, petal tidak
berkembang, tanpa daun, dan ukuran kecil (1 1,5 cm) (Gambar 13D dan E).
A B C
Media AD4 yang merupakan media terbaik selanjutnya digunakan untuk
verifikasi dan diaplikasikan pada genotipe lain (Dianthus barbatus, Dianthus
chinensis Dchi-12 dan Dchi-15). Verifikasi media dilakukan pada genotipe-
genotipe ini karena pada saat perlakuan genotipe-genotipe ini belum berbunga. Hasil yang diperoleh hanya genotipe Dchi-12 dan Dchi-15 yang dapat membentuk kalus (Gambar 12). Hasil ini menunjukkan bahwa setiap genotipe membutuhkan media yang spesifik. Pada umumnya kalus terbentuk 3 - 4 minggu setelah kultur.
Gambar 12. Verifikasi media AD4 kultur antera (A) Dianthus barbatus, (B)
Dianthus chinensis Dchi-12 dan (C) Dianthus chinensis Dchi-15.
Bar = 1 mm