Pada percobaan ini dicari donor ovul dan serbuk sari yang sesuai untuk mendapatkan tanaman haploid. Bahan tanaman untuk donor ovul menggunakan
spesiesDianthus chinensisD-chi11, Dchi-14 dan D-chi15 koleksi Balai Penelitian
Tanaman Hias. Donor serbuk sari diambil dari spesiesDianthus chinensis D.chi-
13 dan D.chi14 yang telah berumur 6 bulan. Tanaman ditanam di pot ukuran 17 cm dengan media tanaman campuran humus daun bambu:arang sekam: pupuk kandang = 2:1:1.
❭rosedur Pelaksanaan
Koleksi serbuk sari, iradiasi dan penyerbukan
Serbuk sari diambil dari kuncup bunga berukuran 1,8 cm pada tahap T8 (umur 11 hari) dikumpulkan dalam cawan petri dan diiradiasi menggunakan sinar
gamma pada alat Gamma chamber 4000 A (CAIRT-BATAN, Indonesia) dengan
laju dosis 80 kRad/jam per April 2011. Dosis yang digunakan adalah dosis tunggal 100 Gy. Setelah diiradiasi, sampel serbuk sari diuji aktivitasnya dengan
menumbuhkannya pada larutan sukrosa 15% pada suhu inkubasi 25oC, selama 24
jam serta dengan pewarnaan aceto-orcein. Kemudian diamati di bawah mikroskop untuk memastikan bahwa serbuk sari tidak aktif. Serbuk sari yang tidak aktif dilihat dari ketidak mampuannya berkecambah setelah 24 jam.
Satu hari sebelum penyerbukan, bunga betina reseptif diemaskulasi kemudian ditutup dengan kertas untuk menghindari penyerbukan dari serbuk sari yang tidak diinginkan. Penyerbukan dilakukan dengan menempelkan serbuk sari yang telah diradiasi pada kepala putik dan ditutup kembali dengan kantong kertas.
Penyelamatan embrio
Buah dipetik pada umur 10 hari sampai 14 hari setelah penyerbukan. Buah dibersihkan dengan akuades steril, kemudian diikuti sterilisasi alkohol 96% selama 10 detik kemudian dilewatkan di atas api sekilas. Buah yang telah steril dibelah dan embrio muda yang membengkak ditanam pada media. Media yang
diuji ialah media M8 = MS + 1,9 µM NAA + 4,44 µM BAP + 60 g L-1 sukrosa
(Sato et al. 2000), dan M10 = MS + 4,52 µM 2,4-D+ 4,44 µM BAP + 20 g L-1
sukrosa (Mosquera et al. 1999). Dua media tersebut dimodifikasi dengan
penambahan 2,7 mM L-glutamin + 0,9 mM L-prolin. Kultur embrio muda
diinkubasi dalam ruang dengan suhu 25 oC dengan penyinaran 16 jam tiap hari
dengan intensitas cahaya 1000 1700 lux. Embrio yang tumbuh menjadi tanaman kemudian disubkultur pada media MS tanpa zat pengatur tumbuh. Pengamatan
dilakukan terhadap jumlah persilangan, jumlah ovari yang dipanen, jumlah ovari gugur, jumlah ovari yang diselamatkan, jumlah kloroplas pada sel penjaga stomata, dan jumlah kromosom yang diambil pada meristem pucuk.
❪valuasi Ploidi
Evaluasi tingkat ploidi awal tanaman dilakukan dengan menghitung jumlah kloroplas dalam sel penjaga stomata pada daun yang telah membuka
sempurna (daun ke 3 5). Lapisan daun bagian bawah dikupas dan ditempatkan
pada gelas preparat, ditambah beberapa tetes aquades, dan ditutup dengan gelas penutup, kemudian diperiksa di bawah mikroskop pada perbesaran 10 x 10 dan 10 x 40.
Penghitungan jumlah kromosom dilakukan di Puslitbang Biologi LIPI menggunakan potongan meristem. Potongan tersebut direndam dalam larutan
0,002 M 8-Hydroxyquinolin selama 3-5 jam pada suhu 4 oC, kemudian dibilas
dengan akuades, dan difiksasi dalam 45% asam asetat selama 10 menit. Potongan pucuk (meristem) dimasukkan pada campuran larutan1 N HCl dan 45% asam
asetat dengan perbandingan 1:3 pada air dengan suhu 60oC selama 1-5 menit, dan
diwarnai dengan aceto-orcein 2%, dilakukan squashing kemudian di amati di
bawah mikroskop.
Verifikasi tingkat ploidi dilakukan dengan menggunakan alat flow cytometer PARTEC CCA untuk PF35.1, PF42, dan PF79 yang dilakukan di Balai
Besar Biogen dengan membuat suspensi dari potongan daun muda sekitar 1 cm2
yang dilarutkan dengan 1 ml buffer ekstraksi. Suspensi disaring menggunakan
mikrofilter 0.2 µm, dimasukkan dalamCuvetdan diwarnai dengan4,6-diamidino-
2-phenylindole (DAPI). Cuvet dimasukkan pada alat flow cytometer yang telah
dioptimasi menggunakan suspensi kontrol diploidDianthus chinensisDchi-11.
Penentuan ploidi juga dilakukan dengan alat flow cytometer CyFlow® space di Pusat Penelitian Biologi LIPI, menggunakan buffer PI, untuk PF35.1 dan PF89. Penentuan plodi PF69.1 dan PF69.2 dilakukan di East West Seed Indonesia menggunakan buffer Ewindo.
Analisis isozim
Analisis dengan isozim dilakukan untuk melihat adanya keragaman hasil pseudofertilisasi. Bahan tanaman menggunakan daun yang masih segar (100 200 g). Daun tersebut digunting halus dimasukkan ke dalam mortar yang telah diberi pasir kuarsa, dengan menambahkan buffer pengekstrak sebanyak 0,5 ml,
kemudian digerus sampai halus. Selanjutnya kertas saring yang ukurannya disesuaikan dengan kebutuhan dimasukkan dalam mortar untuk menyerap cairan sel daun yang telah hancur. Kertas saring yang telah menyerap cairan sel dari setiap sampel dibersihkan untuk kemudian disisipkan pada gel yang telah dilubangi.
Elektroforesis dilakukan dalam ruangan atau lemari es pada suhu antara 5
10 oC. Elektroforesis awal selama 30 menit pada 100 volt dan dielektroforesis
tetap pada 150 atau 200 watt selama 3 sampai 4 jam. Setelah selesai elektroforesis gel dibelah menjadi dua atau tiga (sesuai ketebalan) pada posisi horizontal. Kertas saring sebelumnya dikeluarkan dari lubang-lubang. Lembaran gel dimasukkan dalam nampan, kemudian diberi pewarna esterase (EST) dan peroksidase (PER). Nampan selanjutnya ditutup dengan aluminium foil diinkubasi pada suhu ruang sampai muncul pita-pita pada gel yang cukup jelas. Pewarna esterase (EST)
mengandung 100 m Sodium fosfat pH 7 (100 ml), 1-Naftil asetat (50 mg), 2-
Naftil asetat (5 mg), dan Aseton (100 mg). Pewarna peroksidase (PER)
mengandung 50 mM Natrium asetat pH 5 (100 ml), CaCl2 (50 mg), H2O2 3%
(0,5 ml), 3-Amino-9etilkarbason (50 mg), Aseton/N,N-Dimethylformamid (5 ml). Setelah pewarnaan gel dicuci dengan air mengalir sampai bersih, kemudian difiksasi dengan 50% gliserol ; 50% etanol. Kemudian gel didokumentasi.
❫ercobaan 2. Pseudofertilisasi menggunakan serbuk sari yang diiradiasi
dengan berbagai macam dosis sinar gamma 0, 50, 100, 200 dan 300 Gy
Bahan tanaman menggunakan Dianthus chinensisD.chi-11 (hasil terbaik
pada percobaan 1 koleksi Balai Penelitian Tanaman Hias sebagai donor ovul.
Serbuk sari dambil dari Dianthus chinensis D.chi-14 yang banyak menghasilkan
serbuk sari.
Prosedur Pelaksanaan
Koleksi serbuk sari, iradiasi dan penyerbukan
Kuncup bunga dari serbuk sari Dchi-14 pada tahap T8 (11 hari setelah inisiasi bunga) dikumpulkan dalam cawan petri dan diiradiasi menggunakan sinar
gamma pada dosis 50, 100, 200, dan 300 Gy pada alat Gamma chamber 4000 A
(CAIRT-BATAN, Indonesia) dengan laju dosis 1 kRad/48 detik pada tanggal 23 Agustus 2011. Sebagai kontrol adalah serbuk sari tanpa diiradiasi. Sampel dari serbuk sari yang diiradiasi setiap dosis diamati aktivitasnya setelah
jam. Kemudian dihitung persentase serbuk sari yang berkecambah dalam satu bidang pandang. Penghitungan dilakukan pada enam bidang pandang sebagai ulangan.
Kuncup bunga dari donor ovul di emaskulasi satu hari sebelum penyerbukan dan disungkup dengan kandung kertas untuk menghindari serbuk sari dari bunga lain. Penyerbukan dilakukan dengan menempelkan serbuk sari yang telah diradiasi pada kepala putik dan ditutup kembali dengan kantong kertas. Penyerbukan dengan serbuk sari tanpa diiradiasi digunakan sebagai kontrol.
❴enyelamatan embrio
Buah dipanen pada umur dua minggu setelah penyerbukan. Buah
dibersihkan dengan akuades steril, kemudian diikuti sterilisasi dengan alkohol 96% selama 2 detik kemudian dilewatkan di atas api sekilas. Buah yang telah steril dibelah dan embrio muda ditanam pada media. Buah yang telah steril dikultur pada media MS + 0.057 µM NAA + 2,22 µM BA + 2,7 mM glutamin + 0,9 mM prolin and 30% sukrosa. Kultur embrio muda diinkubasi dalam ruang
dengan suhu 25 oC dengan penyinaran 16 jam tiap hari dengan intensitas cahaya
1000 1700 lux. Embrio yang tumbuh menjadi tanaman kemudian disubkultur
pada media MS tanpa zat pengatur tumbuh. Plantlet yang telah berakar kemudian
diaklimatisasi pada kondisi luar dengan mediacoco peatsteril.
Evaluasi Ploidi
Pemeriksaan ploidi awal secara tidak langsung menggunakan
penghitungan jumlah kloropas pada sel penjaga stomata dengan analisis flow
cytometry. Analisis ploidi ini dilakukan di Pusat Penelitian Biologi LIPI,
Cibinong menggunakan alat CyFlow® space (Partec GmbH yang dilengkapi
dengan diode pumped solid-state laser 920 mW) pada panjang gelombang 488
nm andlaser diodepada panjang gelombang 638 nm (25 mW).
Potongan daun (0.5 cm2) dicacah menggunakan silet di dalam Petri discs
yang berisi 500 µl buffer ekstraksi. Setelah 30 90 detik buffer ekstraksi disaring menggunakan Partec 50 µl CellTrics filter. Pewarnaan menggunakan PI (Propidium Iodide) dan Rnase (2 ml), selanjutnya diinkubasi selama 30 60
menit sebelum dianalisis dalam flow cytometry. Sebagai kontrol (diploid)
❵❛❜ ❝l
❞ercobaan 1. Pseudofertilisasi menggunakan serbuk sari yang diiradiasi