ANALISIS MIKROBIOLOGIS
14.2 Menyiapkan peralatan dan media kultur mikroba
14.3.1 Isolasi Koloni Diskret dari Kultur campuran
Teknik yang umum digunakan untuk mengisolasi koloni diskret didasari oleh kebutuhan akan or- ganisme tertentu. Dengan demi- kian mulai dikembangkan apa yang disebut kultur murni. Untuk membuat kultur murni dari kultur campuran harus dilakukan dua langkah utama, yaitu : 1) kultur campuran diencerkan sehingga mikroba secara individual menja- di terpisah cukup jauh pada per- mukaan lempeng agar, sehingga setelah masa inkubasi masing- masing koloni dapat dipisahkan dari lainnya. Lempeng agar se- perti ini disebut lempeng isolasi dan 2) mikroba yang sudah di- pisahkan dari lempeng isolasi selanjutnya dipindahkan ke me- dia steril lainnya. Setelah diinku- basi, semua organisme di media kultur yang baru akan tumbu ber- sama dengan jenisnya. Kultur ini dikenal sebagai kultur murni. 14.3.1.1. Metode streak-plate Metode streak-plate (lempeng go- res) adalah teknik menumbuhkan mikroba di dalam media agar dengan cara menggores (streak) permukaan agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur mikroba. Dengan teknik ini mikroba yang tumbuh
akan tampak dalam jalur gores- an bekas dari streak jarum ose. Teknik isolasi mikroba ini dapat dianggap cepat secara kualitatif. Ini merupakan teknik pengencer- an penting yang melibatkan pe- nyebaran satu ose kultur ke per- mukaan lempengan agar. Ada beberapa cara untuk meng- goreskan mikroba ke media agar, diantaranya adalah penggoresan four way atau quadrant streak. Adapun cara kerja metode lem- peng gores adalah sebagai beri- kut :
a) Tuang media agar cair ke da- lam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras.
b) Bagi tiga bidang permukaan atas cawan petri yang akan digores dengan spidol atau lainnya.
c) Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup (ujung) sampai berpijar merah.
d) Panaskan bibir tabung reaksi yang berisi kultur mikroba de- ngan cara memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api.
e) Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung reaksi untuk mengambil mikroba, lalu se- gera keluarkan. Usahakan ke- tika memasukkan jarum ose jangan sampai menyentuh dinding tabung dan selalu di-
lakukan dekat pembakar bun- sen.
f) Goreskan ke atas permukaan agar dalam cawan petri se- cara perlahan-lahan. Usaha- kan jangan sampai agar han- cur atau tergores.
g) Letakkan ose yang telah beri- si mikroba di atas permukaan agar pada daerah 1 hingga mikrobanya menempel pada permukaan agar.
h) Ose dibakar hingga berpijar dan dinginkan. Letakkan ose pada lempengan agar dimana terdapat mikroba dan gosok- an secara cepat beberapa kali ke permukaan daerah 1.
i) Bakar kembali ose hingga berpijar dan dinginkan. Putar cawan petri hingga membuat sudut 90o dengan daerah 1. Sentuhkan ose ke media kul- tur di daerah 1, dan gosokan beberapa kali ke media agar di daerah 2.
j) Bakar kembali ose dan di- nginkan. Putar kembali ca- wan petri hingga membentuk sudut 90o dengan daerah 2. Ambil mikroba dari daerah 2 dan goreskan di daerah 3 dengan cara yang sama seperti di daerah 2 (Gambar 14.9).
Gambar 14.9. Isolasi mikroba dengan metode lempeng gores Sumber : www.thesciencefair.com/Merch ant2/merchant.mvc...
k) Tanpa membakar kembali ose, putar kembali cawan pe- tri hingga membuat sudut 90o dengan daerah 3. Ambil mikroba dari daerah 3 dan goreskan ke daerah 4 dengan membentuk garis yang lebar.
l) Bungkus cawan petri dengan kertas coklat, inkubasi dalam inkubator dan amati koloni yang terbentuk.
14.3.1.2 Teknik spread-plate Teknik spread-plate (lempeng sebar atau juga sering disebut spin plate) membutuhkan campuran mikroba yang dilarutkan terlebih dahulu. Selama inokulasi, sel akan disebar ke seluruh permukaan medium agar padat dengan steril.
Penyebaran mikroba dilakukan dengan menggunakan L-shaped bent rod dimana cawan petri diletakan pada ”lazy-susan” turntable sehingga dapat diputar hingga 360o (Gambar 14.10).
Gambar 14.10. Inokulasi mikroba dengan metode lempeng sebar
Sumber :
www.thesciencefair.com/Merchant2/ merchant.mvc...
Adapun tahapan inokulasi mikroba dengan metode lempeng sebar adalah ebagai berikut : a) Letakan bent glass rod ke
dalam gelas beaker dan tambahkan etil alkohol 96 % hingga menggenangi bagian bawah bent.
b) Dengan ose yang telah disterilkan, ambil satu ose penuh kultur mikroba dan letakan ke bagian pusat dari agar plate. Pasang kembali tutupnya.
c) Keluarkan glass rod dari gelas beaker dan bakar di api pembakar Bunsen. Posisi bagian bent dari glass rod
harus selalu di bagian bawah untuk mencegah alkohol yang terbakar mengalir ke tangan. Biarkan hingga alkohol yang terbakar mati semuanya. d) Dinginkan rod selama 10-15
detik. Buka tutup cawan petri dan putar pada ”lazy-susan” turntable. Selama ”lazy- susan” turntable berputar, sentuhkan bent rod steril ke permukaan agar. Gerakan di- ulangi kembali sehingga kul- tur mikroba menjadi tersebar di permukaan media agar. e) Bila gerakan berputar ”lazy-
susan turntable” telah ber- henti, letakkan kembali tutup cawan petri. Rendam rod da- lam alkohol dan bakar kem- bali.
Selain menggunakan L-shaped bent rod, teknik lempeng sebar juga dapat dikerjakan dengan menggunakan pipet dan metode swab. Adapun cara kerja lem- peng sebar menggunakan pipet adalah sebagai berikut :
a) Tuang media agar cair ke dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b) Pipet beberapa ml kultur
mikroba dan campurkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan pengenceran yang dikehendaki.
c) Aduk campuran hingga me- rata dengan cara memutar
tabung reaksi pada telapak tangan selama beberapa kali. d) Pipet larutan pengenceran
tadi sebanyak + 1 ml ke dalam cawan petri.
e) Putar cawan petri secara perlahan-lahan di atas meja untuk meratakan larutan dilusi tadi di atas permukaan media agar.
f) Lakukan proses inkubasi dan amati pertumbuhan koloni mikroba.
Adapun cara kerja lempeng sebar menggunakan metode swab (usap) adalah sebagai berikut : a. Tuang media agar cair ke
dalam cawan petri, lalu biarkan hingga mengeras. b. Pipet beberapa ml kultur
mikroba dan kemudian cam- purkan ke dalam beberapa ml aquades sesuai dengan dilusi yang dikehendaki.
c. Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selaa beberapa kali.
d. Masukkan swab stick (tangkai apus) steril ke dalam tabung reaksi hingga bagian kapas- nya tenggelam di dalam la- rutan dilusi. Usahkan mema- sukkan tangkai apus jangan
sampai menyentuh dinding tabung reaksi.
e. Apus ke atas permukaan agar dengan perlahan-lahan seca- ra merata. Ingat, usahakan jangan sampai agar hancur atau tergores.
f. Lakukan proses iInkubasi dan amati pertumbuhan koloni mikroba.
14.3.1.3 Teknik Pour Plate Teknik pour-plate (lempeng tu- ang) adalah teknik inokulasi mi- kroba di dalam media agar de- ngan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan kultur mikroba.
Teknik lempeng tuang biasa digunakan pada uji TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroba yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar.
Adapun tahan kerja teknik lem- peng tuang adalah sebagai beri- kut :
a) Pipet beberapa ml kultur mik- roba dan campurkan dengan beberapa ml aquades sesuai dengan pengenceran yang di- kehendaki.
b) Aduk hingga merata dengan cara memutar tabung reaksi menggunakan kedua telapak tangan selama beberapa kali.
c) Pipet larutan tersebut seba- nyak + 1 ml ke dalam cawan petri.
d) Tuang media agar yang ma- sih cair (suhu + 50oC) ke dalam cawan petri tersebut (Gambar 14.11).
e) Putar cawan petri secara per- lahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan kultur mikroba.
f) Lakukan proses inkubasi dan amati pertumbuhan koloni bakteri.
menggunakan isolat yang berasal dari campuran kultur agar streak- plate dan/atau spread plate. Adapun prinsipnya adalah koloni yang telah disebar dengan baik akan berkembang pada permuka- an media agar. Masing-masing mikroba dapat dipindahkan de- ngan jarum steril dan ditum- buhkan pada media agar miring (agar slant). Masing-masing me- dia agar miring mewakili pertum- buhan dari satu spesies mikroba dan dirancang sebagai kultur murni atau cadangan (stock). Pembuatan media agar miring adalah sebagai berikut : a) Tuang media agar ke dalam tabung reaksi secara aseptis dan b) Dinginkan agar pada tabung re- aksi dalam keadaan miring (+ 20- 300)
Prosedur pembuatan kultur murni pada media agar miring adalah sebagai berikut :
a) Gunakan pinsil lemak untuk menandai tabung reaksi berisi nutrien agar miring.
b) Transfer secara aseptik mi- kroba dari media streak-plate dan/atau spread plate dengan prosedur sebagai berikut : (1) Bakar jarum ose hingga ka- wat berpijar merah dan di- inginkan; (2) Setelah dingin, sentuhkan jarum ke koloni mi- kroba yang diingin-kan pada agar lempeng gores / sebar; 3) Buka tutup tabung agar miring dan lewatkan le-her
tabung secara cepat me-lalui api pembakar Bunsen; 4) Inokulasi agar miring dengan cara menggeser jarum ose dari bawah ke arah atas membentuk gerakan zigzag sepanjang permukaan agar. Jangan sampai menggali ke dalam media agar atau me- rusak permukaan media agar. c) Panaskan kembali leher ta-
bung reaksi dan tutup kem- bali.
d) Bakar jarum inokulasi dan simpan.
e) Inkubasi ke dalam inkubator dan amati bentuk koloni yang tumbuh. Lama proses inku- basi juga mempengaruhi per- hitungan mikroba. Perhitung- an mikroba yang diinkubasi- kan selama 18 jam memberi- kan hasil lebih baik dibanding- kan 24 jam. Namun demiki- an, beberapa mikroba mem- butuhkan masa inkubasi lebih lama lagi.
14.4 Pengujian Mikrobiologi