menghitung jumlah sel mikroba yang terlihat d

ANALISIS MIKROBIOLOGIS

14.4 Pengujian Mikrobiologi 1 Penanganan Sampel

14.5.1 menghitung jumlah sel mikroba yang terlihat d

bawah mikroskop. Jumlah sel mikroba yang terlihat di bawah mikroskop dapat dihitung dengan cara :

a. Menghitung secara mikroskopis jumlah mikroba dalam contoh dengan volume yang sangat sedikit dan terukur. Penghitungan dilakukan de-

ngan menggunakan kotak penghitung (counting cham- ber). Kotak penghitung terdiri dari kotak-kotak kecil dengan ukuran dan luas tertentu. Cairan contoh yang diketahui volumenya, diletakan di kotak penghitung dan ditutup dengan gelas penutup. Dengan volume contoh yang diketahui dan jumlah mikroba pada tiap kotak pada kotak penghitung diketahui, maka populasi mikroba dapat diketahui

b. Menghitung jumlah sel total secara mikroskopis dengan menggunakan contoh yang telah diwarnai.

Kelemahan dari penghitungan populasi mikroba secara langsung antara lain :

a. Sel mikroba yang sudah mati tidak dapat dibedakan dari yang masih hidup

b. Sel yang berukuran kecil sulit dihitung atau terlewat sehingga hasil perhitungan memberikan hasil dibawah angka sebenarnya.

c. Kurang peka karena suspensi contoh harus mengandung minimal 106 sel per ml.

d. Ketepatan yang tinggi sukar diperoleh.

e. Suspensi contoh harus bebas dari zat lain karena dapat me- nutupi sel pada saat dihitung. 14.5.2 Menghitung sel hidup Jumlah mikroba yang hidup dapat dihitung menggunakan metode penghitungan secara langsung

dan tidak langsung. Menghitung secara langsung jumlah sel mikroba yang hidup terhadap waktu (Total Plate Count) atau Menghitung mikroba secara tidak langsung berdasarkan turbiditas. Prosedurnya lebih cepat namun harus membuat kurva standarnya terlebih dahulu.

14.5.2.1 Pertumbuhan dalam agar

Berdasarkan anggapan bahwa satu sel mikroba akan tumbuh dan berkembang menjadi populasi, maka prinsip dasar dari menghitung mikroba adalah satu koloni mikroba mewakili satu sel mikroba.

Sampel dari bahan atau produk pangan yang sudah dihomogeni- sasi diinokulasi ke dalam atau permukaan media agar. Setelah diinkubasi, koloni mikroba yang tumbuh dihitung sebagai jumlah mikroba.

Proses inokulasi contoh ke media agar dapat dilakukan dengan cara penuangan, penyebaran, dan penetesan.

Pada cara penuangan, 1 ml contoh dipindahkan ke dasar cawan petri dan 15-20 ml media agar cair dituangkan di atasnya. Untuk mencegah kematian mikroba contoh, suhu media agar cair yang dituangkan berkisar 45o – 50oC. Bila suhunya terlalu rendah akan menyulitkan karena sudah mulai mengental. Selan- jutnya cawan petri digeserkan di

permukaan meja dengan mem- bentuk pola angka delapan agar contoh tersebar merata di seluruh media agar. Inkubasikan di dalam inkubator. Metode ini paling peka karena mampu menghitung mikroba sampai kepadatan 20 sel/ml. Metode ini kurang praktis digunakan di lapangan karena membutuhkan peralatan untuk mencairkan dan membekukan media agar.

Pada cara penyebaran, 0.1 ml contoh disebar secara merata di permukaan media agar (spread plate method) dengan menggunakan tongkat gelas melengkung (bent glass rod). Selanjutnya dilakukan inkubasi di dalam inkubator. Metode ini dapat digunakan di lapangan karena media agarnya sudah disiapkan terlebih dahulu. Jumlah mikroba yang dapat dihitung dengan metode ini harus mempunyai kepadatan minimal 300 sel/ml.

Pada cara penetesan, media agar pada cawan petri dibagi menjadi 3-4 sektor dengan memberi garis di dasar cawan petri. Larutan contoh sebanyak 0.02 ml diteteskan di masing-masing sektor. Setelah contoh mengering, lakukan inkubasi di dalam inkubator. Keuntungan dari metode ini adalah proses penghitungan dapat diulang sesuai jumlah sektor yang dibuat.

Keuntungan dari metode pertumbuhan agar adalah dapat diketa-

hui jumlah mikroba yang domi- nan. Keuntungan lainnya dapat diketahui adanya mikroba jenis lain yang terdapat dalam contoh. Adapun kelemahan dari metode ini adalah :

1. Kemungkinan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba, seperti pada mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel. Kemungkinan ini akan mem- perkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya.

2. Kemungkinan adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu, pH, atau kandungan oksigen se- lama masa inkubasi.

3. Kemungkinan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar di seluruh permukaan media agar sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroba lain tersebut tidak terhitung.

4. Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya antara 30 – 300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan menghasilkan penghitungan yang kurang teliti secara statistik, namun bila lebih dari 300 koloni akan menghasilkan hal yang sama karena terjadi persaingan diantara koloni.

5. Penghitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah

masa inkubasi yang umum- nya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih

14.5.2.2 Penyaringan dengan membran

Pada metode penyaringan dengan membran (membrane filtra- tion), larutan contoh disaring dengan menggunakan membran steril atau filter dengan pori-pori yang cukup untuk menahan mikroba. Membran dengan ukuran lubang 0.45 μ dapat digunakan untuk menghitung bakteri dan kamir.

Membran selanjutnya dipindahkan secara aseptis ke cawan steril berisi kertas saring yang dijenuhkan dengan media nutrien cair. Membran juga dapat dipindahkan ke media nutrisi dalam cawan petri. Bagian membran yang ada mikrobanya mengha- dap ke atas. Selanjutnya lakukan inkubasi agar koloni yang tumbuh di permukaan kertas saring dapat dihitung.

Beberapa keuntungan dari metode penyaringan dengan membran adalah :

a. Metode ini sangat peka karena dapat menghitung sel mikroba hingga kepadatan 5 sel/100 ml.

b. Proses penyaringan berlang- sung cukup cepat

Sedangkan kelemahan dari metode ini adalah tersumbatnya mem-

bran oleh zat tertentu, sehingga penggunaan teknik ini lebih cocok untuk contoh yang berupa cairan, seperti air dan minuman, dari- pada homogenat bahan pangan. 14.5.2.3 Teknik MPN

Teknik Most Probable Number (MPN) banyak digunakan untuk menghitung populasi mikroba dalam bahan atau produk pangan. Penghitungan mikroba dengan teknik MPN merupakan kombi- nasi antara pertumbuhan populasi mikroba dan Tabel Mc Crady. Teknik MPN didasarkan pada pengenceran contoh. Prinsipnya, bila contoh diencerkan terus me- nerus maka akhirnya akan diperoleh larutan yang tidak mengandung mikroba (steril). Teknik ini akan memberikan hasil baik bila asumsinya terpenuhi, yaitu : 1) sel mikroba tersebar merata dalam contoh dimana gaya tarik atau tolak diantara mikroba tidak terjadi; 2) larutan yang diinokulasi ke kaldu nutrien akan memperlihatkan pertumbuhan positif apabila mengandung satu atau lebih mikroba hidup; dan 3) terhindar dari pencemaran yang berasal dari bahan dan peralatan.

Dalam prakteknya, apabila contoh A mengandung 1000 sel/ml diencerkan 10 kali, maka akan dihasilkan larutan B dengan kandungan 100 sel/ml. Bila diencerkan lebih lanjut, maka akan dihasilkan larutan C, D, dan E dengan kandungan 10 sel/ml, 1 sel/ml,

dan 0.1 sel/ml berturut-turut. Bila 1 ml larutan A, B, C, dan D dipindahkan ke tabung berisi kaldu nutrien (nutrient broth) akan selalu ditemukan pertumbuhan. Namun pada larutan E akan ditemukan hanya sekali dalam dalam sepuluh kali pemindahan larutan ke kaldu nutrien.

Dari masing-masing larutan di atas, pindahkan ke tiga atau lima tabung berisi kaldu nutrien. Ma- sing-masing tabung mendapat 1 ml. Masing-masing tabung diinkubasi dan diamati apakah ada pertumbuhan.

Tabung dengan kelarutan terting- gi, dimana tiga tabung memperlihatkan pertumbuhan positif dica- tat bersama dengan hasil yang diperoleh pada dua pengenceran berikutnya. Misalnya ketiga tabung yang memperlihatkan pertumbuhan positif didapat pada pengenceran 10-3, maka penga- matan pertumbuhan dilakukan pada tabung dengan pengenceran 10-4 dan 10-5. Bila pada pengenceran 10-4 menunjukkan dua dari tiga tabung positif tumbuh dan pada pengenceran 10-5 tidak dijumpai tabung yang positif tumbuh, maka diperoleh hasil 3/3, 2/3, dan 0/3. Hasil pembacaan dengan menggunakan tabel Mc Crady dapat diketahui konsen- trasi mikroba dalam contoh. Beberapa keuntungan dari metode MPN ini adalah 1) dapat dibu-

at sangat peka dengan penggunaan contoh lebih besar dari 1 ml/tabung; 2) dapat digunakan dilapangan karena media dapat disipkan sebelumnya; dan 3) untuk tujuan tertentu dapat menggunakan media pertumbuhan selektif sehingga hanya mikroba yang diharapkan dapat tumbuh baik.

Kelemahan utama dari metode MPN adalah ulangannya banyak sehingga membutuhkan waktu dan biaya lebih besar untuk persiapannya. Dengan kondisi demikian, teknik MPN banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogen.

14.5.2.4 Penghitungan selektif Dalam kondisi tertentu diperlukan penghitungan mikroba secara selektif (selective counting tech- niques), misalnya untuk mengeta- hui populasi bakteri pembusuk atau patogen tertentu. Pada prinsipnya pekerjaan ini dapat dilakukan secara mudah dengan menggunakan media selektif. Media selektif adalah media agar yang mengandung zat terpilih sehingga dapat menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan namun memberi kesempatan bagi mikroba yang dimaksud untuk berkembang. Prosedur yang dilakukan sama seperti inokulasi dengan menggunakan kultur murni.

Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam penghitungan

mikroba selektif adalah :

a. Tidak ada media yang seratus persen selektif, selalu ada mikroba lain yang tumbuh. Penambahan komponen tertentu akan memberikan per- bedaan berupa warna atau bentuk morfologi. Agar bis- muth sulfit adalah media selektif bagi Salmonella, dimana koloninya terlihat hitam dan dilingkari warna kaca mengkilat dari endapan bis- muth.

b. Beberapa mikroba terdapat dalam jumlah sangat sedikit sehingga tidak dapat dihitung keberadaannya dengan menggunakan teknik pertumbuhan sebelumnya. Untuk me- ngetahui keberadaan mikroba tersebut perlu dilakukan pemupukan selektif (selective enrichment) dengan cara menginokulasikan contoh ke dalam media cair tertentu yang komposisinya telah dibuat sedemikian rupa hingga dapat menumbuhkan mikroba yang diharapkan. Setelah masa inkubasi selesai, contoh yang telah dipupuk ditumbuh- kan ke dalam media agar diferensial selektif yang dapat membedakan pertumbuhan mikroba diinginkan dengan mikroba lainnya. Contoh media pemupukan selektif untuk Salmonella adalah tetrathio- net broth. Media ini mengandung ion tetrathionat yang akan menekan pertumbuhan mikroba lain.

c. Kerusakan sublethal

Sebagian mikroba yang terdapat dalam produk pangan sudah mengalami kerusakan fisiologis dan biokimia akibat proses pengolahan, sehingga tidak dapat hidup secara normal. Mikroba ini tidak bisa tumbuh pada media selektif namun masih dapat tumbuh pada media tidak selektif. Salmonella yang mengalami kerusakan subletal akibat pengolahan dapat tumbuh pada media nutrien agar tetapi tidak dapat tumbuh pada media selektif, karena peka terhadap senyawa pi- lihan yang digunakan dalam media selektif.

Untuk menghitung populasi Salmonella sublethal, tumbuhkan dahulu dalam kaldu nutrien agar kerusakan sublethal yang bersi- fat sementara dapat di- sembuhkan dan Salmo- nella tumbuh menjadi sel normal. Jangka waktu yang diperlukan cukup 1 – 2 jam dan selanjutnya ino- kulasikan ke media selektif.

14.6. Pengujian mikrobiologi

Dalam dokumen smk11 PengawasanMutuBahanProdukPangan EddyAfrianto (Halaman 138-143)