ABSTRAK
Serat pangan banyak digunakan dan direkomendasikan untuk menurunkan konsentrasi kolesterol darah dan mencegah hiperkolesterolemia. Agar, karagenan, dan bekatul merupakan bahan pangan yang mengandung serat yang tinggi. Tujuan penelitian ialah menganalisis pengaruh suplementasi agar, karagenan, dan bekatul pada profil lipid darah mencit hiperkolesterolemia. Sumber serat yang digunakan sebagai perlakuan pada penelitian ini adalah agar, karagenan, dan bekatul. Hewan percobaan dikelompokkan dalam suatu rancangan acak lengkap. Kelompok kontrol dibagi menjadi kontrol negatif yang diberi diet standar dan kontrol positif diberikan diet hiperkolesterolemik dengan kadar lemak 12%. Kelompok perlakuan dibedakan berdasarkan kadar serat pangan 10, 12, dan 14%. Setiap kelompok perlakuan diulang sebanyak lima kali. Darah yang diperoleh kemudian disentrifuse untuk mendapatkan serumnya, untuk kemudian dianalisis konsentrasi kolesterol total serum, HDL-c, LDL-c, trigliserida, dan glukosa dengan metode enzimatis kolorimetri masing-masing menggunakan Kit Boehringer. Sampel organ hati dan feses diekstraksi dengan menggunakan dietil eter, untuk mengetahui konsentrasi kolesterol dengan metode enzimatis kolorimetri menggunakan Kit Boehringer. Suplementasi agar, karagenan, dan bekatul sebagai sumber serat pangan meningkatkan konsentrasi HDL-c serum dan kolesterol feses, tetapi menurunkan konsentrasi kolesterol total, trigliserida, LDL-c dalam serum, dan kolesterol hati mencit hiperkolesterolemia. Agar, karagenan, dan bekatul mempunyai pengaruh yang sama pada konsentrasi kolesterol total, trigliserida, HDL-c, LDL-c dalam serum, kolesterol hati, dan feses mencit hiperkolesterolemia. Berdasarkan hasil penurunan konsentrasi kolesterol total serum dan peningkatan pengeluaran kolesterol melalui feses, maka serat pangan karagenan dipilih untuk diperbandingkan dengan obat simvastatin dan lipitor pada penelitian selanjutnya.
Kata kunci: Agar, bekatul, hiperkolesterolemia, karagenan
ABSTRACT
Dietary fiber is widely used and recommended to reduce blood cholesterol and to prevent hypercholesterolemia. Agar, carrageenan, and rice bran are examples of foods with high fiber contents. An experiment was conducted to study the effects of agar, carrageenan, and rice bran supplementations on serum lipid profiles of hypercholesterolemic mice. The source of dietary fiber was used as treatment in these experiment i.e. agar, carragenan, and rice bran. The experimental mice were assigned into a completely randomized design. The control group was divided into negative control group, that was fed with a
standard diet and the positive control group was fed with a hypercholesterolemic diet. The treatment was the dosage of food that are differentiated into 10%, 12%, and 14% based on the level of dietary fiber. Each treatment group was repeated five times. Blood samples were collected and then centrifuged to obtain serum, and then analyzed for concentrations of total serum cholesterol, HDL-c, LDL-c, triglycerides, and glucose by enzymatic colorimetric methods respectively using Boehringer kit. Liver and feces samples were extracted with diethyl ether, to determine the concentration of cholesterol by enzymatic colorimetric method using a Boehringer kit. Supplementation of agar, carrageenan, or rice bran as a source of dietary fiber increased serum concentration of HDL-c and fecal cholesterol, but lowered serum concentrations of total cholesterol, triglycerides, LDL-c and liver cholesterol of hypercholesterolemic mice. Agar, carrageenan, and rice bran dietary fiber have the same effect on the serum concentrations of total cholesterol, triglycerides, HDL-c, LDL-c, liver and feces cholesterol concentrations of hypercholesterolemic mice. Based on the decrease in serum total cholesterol concentration and increase in cholesterol excretion in the feces, the carrageenan was selected to be used in the next experiment to compare with simvastatin and lipitor drug.
Key Words: Agar, carrageenan, cholesterol, hypercholesterolemia, rice bran
PENDAHULUAN
Penyakit kardiovaskuler merupakan penyebab utama kematian orang di seluruh dunia, dan juga mempengaruhi kesehatan jutaan orang di negara-negara maju dan berkembang. Secara khusus, di sebagian besar negara Eropa, penyakit kardiovaskuler menyumbang sekitar 40% untuk semua penyebab kematian (Kromhout 2001). Kandungan kolesterol dalam plasma darah yang tinggi atau hiperkolesterolemia telah diketahui meningkatkan risiko aterosklerosis yang berlanjut pada penyakit jantung koroner (Milias et al. 2006, Sudha 2009).
Hiperkolesterolemia dapat terjadi karena gaya hidup (life style) yang tidak sehat; mulai dari pola makan yang tidak seimbang sampai kurangnya aktivitas olah raga. Pola makan tidak seimbang meliputi konsumsi makanan yang tinggi lemak dan karbohidrat, konsumsi makanan yang rendah serat, serta kebiasaan merokok dan minum alkohol (Milias et al. 2006). Tingginya kolesterol dalam tubuh dapat disebabkan oleh sintesis kolesterol dan penyerapan kolesterol yang tinggi, dan juga karena konsumsi makanan yang tinggi lemak dan karbohidrat (Sudha 2009). Oleh karena itu, penurunan kolesterol darah ke tingkat normal dapat ditempuh dengan dua cara, yaitu mengurangi konsumsi lemak atau
kolesterol yang berasal dari makanan, dan menghambat penyerapan kolesterol atau menghambat sintesis kolesterol endogen dengan penggunaan obat.
Pengurangan konsumsi lemak dan kolesterol secara ketat tetap tidak menurunkan keadaan hiperkolesterol ke keadaan normal pada individu atau usia tertentu. Salah satu upaya untuk menurunkan konsentrasi kolesterol dalam darah ialah dengan cara memperbanyak konsumsi serat pangan (dietary fiber) (Anderson et al. 2009). Serat pangan menghambat absorpsi kolesterol dalam usus halus yang akhirnya menurunkan konsentrasi kolesterol plasma, dan meningkatkan sintesis kolesterol oleh hati, sintesis empedu, dan ekskresi kolesterol melalui feses (Jonnalagadda et al. 1993). Oleh karena itu, serat pangan telah banyak digunakan dan direkomendasikan untuk menjaga konsentrasi kolesterol darah supaya tetap normal.
Salah satu bahan pangan nabati yang berpotensi sebagai penurun kolesterol ialah agar. Agar merupakan salah satu produk primer dari rumput laut yang yang berasal dari ganggang merah (Rhodophyta) yang dikenal sebagai agarofita (Praiboon et al. 2006). Di dalam taksonomi, agarofita diklasifikasikan pada kelas Florideophyceae yang terdiri atas tiga kelompok, yaitu Gelidiaceae (Gelidium, Gelidiella, Pterocladia). Gracilariales (Glacilaria) dan Ahnfeltiacea (Ahnfeltia) (Marinho-Soriano 2001, Raine dan Trono 2002, Ahmad et al. 2011). Produksi agar di dunia saat ini banyak dihasilkan Gracilaria dan Gelidium masing-masing sebesar 53% dan 44%, sedangkan agarofita lain, seperti Gelidiella dan Pterocladia hanya menghasilkan agar dalam jumlah kecil sekitar 3%. Oleh karena itu, Gracilaria saat ini merupakan pengganti yang baik agar Gelidium dalam industri makanan (Ahmad et al. 2011). Secara umum, serat pangan rumput laut adalah sekitar 33-50% bobot kering (Benjama dan Masniyom 2011).
Sumber serat yang berpotensi dapat menurunkan konsentrasi kolesterol darah selain agar ialah karagenan. Karagenan merupakan salah satu produk primer dari rumput laut yang berasal dari ganggang merah (Rhodophyta). Eucheuma sp. merupakan salah satu kelompok rumput laut karaginofit, yaitu rumput laut yang mengandung bahan utama polisakarida karagenan. Adapun jenis karagenan yang dihasilkan Eucheuma sp. terutama adalah kappa karagenan (Winarno 1996). Karagenan adalah senyawa polisakarida yang tersusun dari unit -D-galaktosa
dan α-L-galaktosa 3,6 anhidrogalaktosa yang dihubungkan oleh ikatan 1,4 glikosiklik dan setiap unit galaktosa mengikat gugusan sulfat (Golcalves et al. 2002).
Karagenan dapat digunakan untuk mengontrol kandungan kolesterol dalam makanan karena kemampuannya untuk meniru tekstur dan kualitas sensorik lemak, mengurangi jumlah total lemak dalam makanan (Panlasigui et al. 2003). Karagenan lebih banyak digunakan daripada agar-agar sebagai emulser/stabilisator dalam banyak makanan, terutama produk makanan berbasis susu, seperti susu cokelat, es krim, susu evaporasi, puding, jeli, selai, salad dressing, gel pencuci mulut, produk daging, dan makanan hewan peliharaan (Tobacman 2001; Cardozo et al. 2007)
Karagenan merupakan sumber serat pangan yang baik bagi kesehatan. Telah diketahui bahwa kandungan serat pangan rumput laut adalah sekitar 33-50% bobot kering (Benjama dan Masniyom 2011). Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa karagenan memiliki efek hipoglikemik, karena kemampuan penyerapan asam empedu dalam lumen usus (Jiao et al. 2011). Eucheuma cottoni mampu menurunkan dan menormalkan kadar kolesterol darah tikus hiperkolesterolemia bergantung pada konsentrasi dan bentuknya. Rumput laut dalam bentuk gel lebih cepat menurunkan dan menormalkan kadar kolesterol darah daripada bentuk larutan (Hardoko 2008). Eucheuma cottoni juga mampu menurunkan kadar gula darah tikus Wistar yang hyperglycemic diabetic (dependence diabetic mellitus) dengan cepat bergantung pada kosentrasi yang diberikan (Hardoko 2007).
Salah satu bahan pangan nabati yang berpotensi sebagai penurun kolesterol adalah bekatul padi yang merupakan hasil samping penggilingan padi. Telah diketahui bahwa bekatul mengandung nutrisi yang sangat baik, seperti kandungan lemak kasar yang didominasi oleh oleat dan linoleat, protein yang bermutu baik, vitamin B dan E, dan serat pangan yang mudah larut (Luh 1991). Bekatul sebagai sumber serat dapat menurunkan konsentrasi kolesterol plasma darah (Kritchesky 1997, Kahlon dan Chow 1997). Potensi bioaktif bekatul tersebut mendorong pengembangan bekatul menjadi pangan fungsional yang berperan sebagai produk kesehatan. Bekatul sudah banyak diproduksi secara komersil sehingga mudah
didapat dengan harga yang relatif murah. Adanya diversifikasi pangan, maka produk agar, karagenan, dan bekatul dapat dijadikan produk yang menyehatkan karena berserat tinggi.
Hasil penelitian tahap pertama telah diperoleh hasil bahwa induksi diet hiperkolesterolemik pada kadar lemak 12% selama 30 hari telah menyebabkan mencit jantan mengalami hiperkolesterolemia. Hasil analisis menunjukkan bahwa konsentrasi kolesterol total serum yang dapat dicapai sebesar 181,24±14,25 mg/dL. Komposisi diet hiperkolesterolemik ini dijadikan diet standar kelompok kontrol positif mencit hiperkolesterolemia, dan diet yang disuplementasi serat pangan agar, karagenan, dan bekatul. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh suplementasi agar, karagenan, dan bekatul sebagi sumber serat pangan pada perbaikan profil lipid darah mencit jantan hiperkolesterolemia.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei 2011–Januari 2012. Penelitian telah dilaksanakan di kandang hewan Jurusan Pendidikan Biologi, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Indonesia. Analisis lipid darah dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Analisis proksimat pakan dilaksanakan di Laboratorium Nutrisi, Balai Penelitian Ternak Ciawi, Bogor.
Alat dan Bahan
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan dewasa strain Swiss Webster yang telah berumur tiga bulan dengan bobot rerata 30 g sebanyak 75 ekor yang dibagi menjadi tiga kelompok, yaitu 25 ekor diberi suplementasi agar, 25 ekor diberi suplementasi karagenan, dan 25 ekor diberi suplementasi bekatul. Mencit diperoleh dari Laboratorium Pusat Ilmu Hayati, Institut Teknologi Bandung. Mencit dipelihara di dalam kandang berupa kotak plastik (30 x 22 x 12 cm3) yang dilengkapi tempat makan dan botol air minum. Selama penelitian, mencit diberikan penerangan; 12 jam terang dan 12 jam gelap.
Bahan pakan yang dipakai adalah agar, karagenan, bekatul, tepung jagung, tepung ikan, bungkil kedelai, kuning telur, CaCO3, premix, telur, garam, dan minyak kelapa. Serat pangan agar, karagenan, dan bekatul masing-masing secara terpisah dicampurkan dengan bahan-bahan diet lainnya sesuai komposisi diet percobaan yang telah dihitung untuk kemudian dibentuk menjadi pellet. Kit Boehringer digunakan untuk menganalisis konsentrasi lipid (kolesterol, HDL, LDL, dan trigliserida), serta glukosa dalam serum darah mencit.
Komposisi Diet
Komposisi diet hiperkolesterolemik dihitung berdasarkan bahan kering dari masing-masing bahan diet. Komposisi nutrien diet hiperkolesterolemik diperoleh dari hasil analisis proksimat dan hasil perhitungan. Konsumsi diet dihitung berdasarkan jumlah diet segar yang diberikan dikalikan persentase hasil proksimat nutrien. Komposisi diet hiperkolesterolemik yang diberi suplementasi agar (Tabel 20), karagenan (Tabel 23), dan bekatul (Tabel 26). Komposisi nutrien diet hiperkolesterolemik yang diberi suplementasi agar (Tabel 21), karagenan (Tabel 24), dan bekatul (Tabel 27). Jumlah konsumsi diet hiperkolesterolemik yang diberi suplementasi agar (Tabel 22), karagenan (Tabel 25), dan bekatul (Tabel 28).
Tabel 20. Komposisi diet hiperkolesterolemik dengan suplementasi agar
Bahan Diet Kadar Diet
AG(-) AG(+) AG10 AG12 AG14
Tepung jagung (%) 66 60 55 50 45 Tepung ikan (%) 8 8 8 8 8 Bungkil kedelai (%) 20 20 20 18 18 Telur (%) 0 3 3 3 3 AGAR (%) 0 0 5 12 18 Minyak kelapa (%) 2 6 6 6 5 Premiks (%) 1 1 1 1 1 Garam (%) 1 1 1 1 1 CaCO3 (%) 1 1 1 1 1 Total (%) 100 100 100 100 100
Tabel 21. Komposisi nutrien diet hiperkolesterolemik dengan suplementasi agar
Komposisi Nutrien Kadar Diet
AG(-) AG(+) AG10 AG12 AG14
Air (%) 9,39 9,17 9,49 8,13 7,88 Abu (%) 8,49 8,84 17,99 15,13 15,48 Protein (%) 21,92 23,62 21,15 20,56 21,65 Lemak (%) 4,11 13,56 15,04 14,40 13,18 BETN (%)* 56,09 44,81 36,33 41,78 41,81 Serat pangan (%)* 6,99 8,74 10,20 12,19 14,01 Ca (%)* 1,23 1,23 1,30 1,38 1,47 P (%) 0,53 0,58 0,43 0,42 0,33 Energi (kkal/kg) 3812 4421 4395 4392 4029 Kolesterol (mg/g) 0,052 0,154 0,151 0,150 0,150
Keterangan: * Hasil perhitungan
Tabel 22. Jumlah konsumsi (g/ekor/hari) diet hiperkolesterolemik dengan suplementasi agar*
Konsumsi Kadar Diet
AG(-) AG(+) AG10 AG12 AG14
Bahan segar 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 Protein kasar 2,19 2,36 2,12 2,06 2,17 Lemak kasar 0,41 0,14 0,15 0,14 0,13 BETN 5,61 4,48 3,63 4,18 4,18 Serat pangan 0,70 0,88 1,02 1,22 1,40 Kolesterol 0,01 0,02 0,02 0,02 0,02 Energi 381,20 442,10 439,50 439,20 402,90
Keterangan: * Hasil perhitungan
Tabel 23. Komposisi diet hiperkolesterolemik dengan suplementasi karagenan
Bahan Diet Kadar Diet
KR(-) KR(+) KR10 KR12 KR14 Tepung jagung (%) 66 60 47 32 17 Tepung ikan (%) 8 8 8 8 8 Bungkil kedelai (%) 20 20 18 18 18 Kuning telur (%) 0 3 3 3 3 KARAGENAN (%) 0 0 15 30 46 Minyak kelapa (%) 2 6 6 6 7 Premiks (%) 1 1 1 1 1 Garam (%) 1 1 1 1 1 CaCO3 (%) 1 1 1 1 1 Total (%) 100 100 100 100 100
Tabel 24. Komposisi nutrien diet hiperkolesterolemik dengan suplementasi karagenan
Komposisi Nutrien Kadar Diet
KR(-) KR(+) KR10 KR12 KR14 Air (%) 9,39 9,17 9,74 9,59 9,66 Abu (%) 8,49 8,84 13,93 11,34 12,81 Protein (%) 21,92 23,62 14,94 11,66 12,25 Lemak (%) 4,11 13,56 10,51 12,79 13,02 BETN (%)* 56,09 44,81 50,88 54,62 52,26 Serat pangan (%)* 6,99 8,75 10,48 12,27 14,05 Ca(%)* 1,23 1,23 1,31 1,43 1,51 P (%) 0,53 0,58 0,31 0,30 0,27 Energi (kkal/kg) 3812 4421 4396 4698 4654 Kolesterol (mg/g) 0,052 0,154 0,152 0,151 0,152
Keterangan: * Hasil perhitungan
Tabel 25. Jumlah konsumsi (g/ekor/hari) diet hiperkolesterolemik dengan suplementasi karagenan*
Konsumsi Kadar Diet
KR(-) KR(+) KR10 KR12 KR14 Bahan segar 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 Protein kasar 2,19 2,36 1,49 1,17 1,23 Lemak kasar 0,41 0,136 1,05 1,28 1,30 BETN 5,61 4,48 5,09 5,46 5,26 Serat pangan 0,70 0,88 1,05 1,23 1,40 Kolesterol 0,01 0,02 0,02 0,02 0,02 Energi 381,20 442,10 439,60 469,80 465,40
Keterangan: * Hasil perhitungan
Tabel 26. Komposisi diet hiperkolesterolemik dengan suplementasi bekatul
Bahan Diet Kadar Diet
BT(-) BT(+) BT10 BT12 BT14 Tepung jagung (%) 66 60 41 28 17 Tepung ikan (%) 8 8 8 8 4 Bungkil kedelai (%) 20 20 20 16 13 Kuning telur (%) 0 3 3 3 3 BEKATUL (%) 0 0 16 38 57 Minyak kelapa (%) 2 6 5 4 3 Premiks (%) 1 1 1 1 1 Garam (%) 1 1 1 1 1 CaCO3 (%) 1 1 1 1 1 Total (%) 100 100 100 100 100
Tabel 27. Komposisi nutrien diet hiperkolesterolemik dengan suplementasi bekatul
Komposisi Nutrien Kadar Diet
BT(-) BT(+) BT10 BT12 BT14 Air (%) 9,39 9,17 7,88 7,86 9,52 Abu (%) 8,49 8,84 16.06 14,72 13,93 Protein (%) 21,92 23,62 14,00 14,00 13,00 Lemak (%) 4,11 13,56 16,35 17,41 17,54 BETN (%)* 56,09 44,81 45,71 46,01 46,01 Serat pangan (%)* 6,99 8,75 10,28 12,28 14,30 Ca (%)* 1,23 1,23 1,51 1,74 1,70 P (%) 0,53 0,58 0,82 0,81 0,77 Energi (kkal/kg) 3812 4421 4194 4339 4217 Kolesterol (mg/g) 0,052 0,154 0,153 0,151 0,150
Keterangan: * Hasil perhitungan
Tabel 28. Jumlah konsumsi nutrien (g/ekor/hari) diet hiperkolesterolemik dengan suplementasi bekatul*
Kosumsi Kadar Diet
BT(-) BT(+) BT10 BT12 BT14 Bahan segar 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 Protein 2,19 2,36 1,40 1,40 1,30 Lemak 0,41 1,36 1,64 1,74 1,75 BETN 5,61 4,48 4,57 4,60 4,60 Serat pangan 0,70 0,88 0,10 0,12 0,14 Kolesterol 0,01 0,02 0,02 0,02 0,02 Energi 381,20 442,10 419,40 433,90 421,70
Keterangan: * Hasil perhitungan
Metode Penelitian
Penelitian kedua dilakukan secara simultan dengan menggunakan 75 ekor mencit jantan hiperkolesterolemia yang terbagi atas tiga pengamatan, yaitu (1) 25 ekor diberi suplementasi serat pangan agar, (2) 25 ekor diberi suplementasi serat pangan karagenan, dan (3) 25 ekor diberi suplementasi serat pangan bekatul. Rancangan penelitian untuk ketiga pengamatan tersebut menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan lima kelompok perlakuan yang diulang sebanyak lima kali. Kelompok pertama (K-) ialah mencit normokolesterolemia yang diberikan diet standar tanpa suplementasi serat pangan (agar, karagenan, dan bekatul). Kelompok kedua(K+) ialah mencit hiperkolesterolemia yang diberi diet hiperkolesterolemik tanpa suplementasi serat pangan (agar, karagenan, dan
bekatul) dengan kandungan serat pangan diet sebesar 8%. Kelompok ketiga (AG10/KR10/BT10) ialah mencit hiperkolesterolemia yang diberikan diet hiperkolesterolemik disuplementasi serat pangan agar, karagenan, dan bekatul dengan kadar serat pangan diet sebesar 10%. Kelompok keempat (AG12/KR12/ BT12) ialah mencit hiperkolesterolemia yang diberikan diet hiperkolesterolemik disuplementasi serat pangan agar, karagenan, dan bekatul dengan kadar serat pangan diet sebesar 12%. Kelompok kelima (AG12/KR14/BT14) ialah mencit hiperkolesterolemia disuplementasi serat pangan agar, karagenan, dan bekatul dengan kadar serat pangan diet sebesar 14%. Setiap kegiatan penelitian dilakukan masing-masing selama tiga bulan. Selama bulan pertama, mencit percobaan diberikan diet hiperkolesterolemik pada kadar lemak 12% sehingga diperoleh mencit hiperkolesterolemia.
Setelah mengalami hiperkolesterolemia, mencit diberikan perlakuan dengan pemberian diet yang mengandung serat pangan berbeda (agar, karagenan, dan bekatul). Diet percobaan diberikan sebanyak 10 g/ekor/hari selama satu bulan setelah kondisi hiperkolesterolemia. Penimbangan bobot badan dilakukan satu minggu sekali. Pada akhir masa percobaan, mencit dipuasakan selama 12 jam. Selanjutnya sampel darah diambil dari pembuluh vena caudalis bagian ekor mencit. Darah yang diperoleh kemudian disentrifuse untuk mendapatkan serumnya, yang kemudian digunakan untuk analisis konsentrasi total kolesterol, HD-c, LDL-c, trigliserida, dan glukosa dengan metode enzimatis kolorimetri masing-masing menggunakan Kit Boehringer. Sampel organ hati dan feses diekstraksi dengan menggunakan dietil eter (Wiradimadja 2007), untuk mengetahui konsentrasi kolesterol pada dua sampel tersebut dan dianalisis dengan menggunakan Kit Boehringer.
Analisis Statistik
Suplementasi serat pangan agar, karagenan, dan bekatul dalam diet hiperkolesterolemik dalam penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Data kuantitatif parameter lipid darah (kolesterol total serum, trigliserida, HDL-c, dan LDL-c), konsentrasi glukosa, konsentrasi kolesterol feses dan hati, serta bobot badan dianalisis dengan menggunakan analysis of variance (ANOVA)
dan dilanjutkan dengan uji Duncan multiple range test. Analisis secara keseluruhan dilakukan dengan software Statistical Analysis System (SAS ) 9.1.3.