AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETANOL BUAH
ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
SKRIPSI
OLEH:
FAUZI
NIM 121524033
PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETANOL BUAH
ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
SKRIPSI
Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi Pada Fakultas Farrmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
FAUZI
NIM 121524033
PROGRAM EKSTENSI SARJANA FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
iv
KATA PENGANTAR
Bismillaahirrahmaanirrahiim,
Puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT, Tuhan semesta
alam, yang telah melimpahkan rahmat dan keberkahan-Nya, sehingga penulis
dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini, serta shalawat dan
salam bagi Rasulullah Muhammad SAW sebagai suri tauladan dalam hidup dan
kehidupan.
Skripsi ini disusun untuk melengkapi salah satu syarat mencapai gelar
Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, dengan judul
“Uji Aktivitas Antikanker Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium DC.) Terhadap Sel Kanker Serviks”
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr.
yang telah memberikan banyak waktu, bimbingan dan nasihat selama penelitian
hingga selesainya penyusunan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih
kepada Ibu Prof. Dr. Julia Reveny, M.Si., Apt., selaku Wakil Dekan I Fakultas
Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan fasilitas sehingga
penulis dapat menyelesaikan pendidikan. Selain itu, penulis juga mengucapkan
terima kasih kepada
telah memberikan evaluasi dan masukan kepada penulis dalam penyusunan skripsi
ini. Ibu Dra. Herawaty Ginting M.Si., Apt., selaku penasehat akademik serta
seluruh Staf Pengajar Fakultas Farmasi USU yang telah banyak membimbing dan
v
Pada kesempatan ini penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
Ayahanda Zakwan Yusuf dan Ibunda Nur aidar tercinta yang telah memberikan
pengorbanan tidak ternilai, baik moril maupun materil, juga kepada abang
Hendro, abang Denny Satria, Ikhsan, Muhammad Fadhli serta teman-teman
ekstensi farmasi, Zizi, Eca, Maya, Dinda, Tarry, Arnis, Lia, Futri, Dadang dan
Didi atas do’a dan dukungannya dalam penyelesaian skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan,
sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun. Akhir
kata, semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan menjadi sumbangan
yang berarti bagi ilmu pengetahuan khususnya dalam bidang ilmu farmasi.
Medan, Agustus 2015 Penulis,
Fauzi
vi
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETANOL BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
Abstrak
Kanker serviks merupakan salah satu jenis kanker yang menjadi penyebab kematian terbesar di Indonesia pada wanita. Penyebab utama kanker serviks adalah Human Papilloma Virus (HPV). Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) adalah salah satu tanaman yangdikenal dalam masyarakat Batak, tergolong dalam tanaman liar yang belum banyak dimanfaatkan sebagai tanaman obat. Buah andaliman diyakini memiliki potensi antikanker. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui karakteristik simplisia buah andaliman, menghitung nilai IC50 ekstrak terhadap sel HeLa dan menghitung indeks selektivitas ekstrak etanol buah andaliman.
Ekstrak diperoleh dengan maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Uji aktivitas sitotoksik EEBA secara in vitro terhadap sel HeLa dan sel Vero menggunakan metode MTT. Sel HeLa ditumbuhkan dalam media kultur RPMI pada plate 96-sumuran kemudian diberi ekstrak etanol buah andaliman dengan seri konsentrasi 500 µ g/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62,5 µg/mL; 31,25 µg/mL dan 15,625 µg/mL.Sel Vero ditumbuhkan dalam media kultur M199 pada96-sumuran kemudian diberi ekstrak etanol buah andaliman dengan seri konsentrasi 1000 µg/mL; 500 µg/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62,5 µg/mL dan 31,25 µg/mL. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada 595 nm dan dianalisis dengan SPSS 19 kemudian dihitung indeks selektivitasnya.
Hasilskrining fitokimia terhadap simplisia dan ekstrak etanol buah andaliman diperoleh senyawa kimia golongan alkaloid, flavonoid, tanin, glikosida, dan steroid/triterpenoid. Hasil pemeriksaan karakteristik simplisia diperoleh kadar air 6,30%; kadar sari larut air 12,41%; kadar sari larut dalam etanol 16,28%; kadar abu total 4,62% dan kadar abu tidak larut asam 0,20%. Hasil pengujian aktivitas sitotoksik ekstrak etanol buah andaliman terhadap sel HeLa menunjukkan nilai IC50sebesar 42,462 µg/mL dan pada sel Vero sebesar 258,167µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah andaliman memiliki efek sitotoksisitas yang poten terhadap sel kanker serviks HeLa. EEBA memiliki indeks selektivitas sebesar 6,08. Hal ini berarti EEBA bekerja selektif yaitu hanya menghambat sel kanker serviks tanpa mematikan sel normal (Vero).
Kata Kunci: MTT, sitotoksisitas, Sel HeLa, Sel Vero, Zanthoxylum
vii
ANTICANCER ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT FROM ANDALIMAN FRUIT (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
ON CERVICAL CANCER CELLS
Abstract
Cervical cancer is one type of the largest cancer that becomes largest cause of death woman in Indonesia.The main cause of cervical cancer is Human Papilloma Virus (HPV).Andaliman ( Zanthoxylum acanthopodium DC.) is one of the plant which well known within the community Bataknese were classified as a part wild plants that have not been widely used as a medicinal plant. Fruit andaliman does believed have anticancer potential. The purpose of this research were to known characteristic of andaliman fruit simplex, to determinated the IC50 value of extract on HeLa cell and determinated the selectivity index of EEBA.
Extraction were used maceration method with 96% ethanol. Cytotoxic effect was tested in vitro on HeLa and Vero cells line using MTT assay. HeLa cells were seeded in RPMI medium at 96-well plate and then were given andaliman fruitethanolic extract with concentration 500 µg/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62.5 µg/mL;31.25 µg/mL and 15.625 µg/mL. While Vero cells were seeded in M199 culture medium at 96-well plate and then were given extract with concentration 1000 µg/mL; 500 µg/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62.5µ g/mL and 31.25 µg/mL The absorbanceswere read by ELISA reader at ƛ 595 nm and analysed with SPSS 19 and calculated selectivity index.
The results of photochemical screening from simplex and ethanol extract of Andaliman fruit contains alkaloid, flavonoids, glikosids, tannins and steroids/triterpenoids. The result of the simplex characteristics were showed that 6.30% water content; 12.41% water-soluble extract content; 16.28% ethanol-soluble extract content; 4.62% total ash and 0.20% acidic unethanol-soluble ash. The cytotoxic activity assay was showed that ethanol extract of Andaliman fruit on HeLa cells have IC50 values of 42.462 µ g/mL and for Vero cells was showed IC50 values of 258.167 µ g/mL. Andaliman fruits ethanolic extract was exhibited cytotoxic effect against cervical cancer HeLa cells. EEBA have selectivity index of 6.08. Ethanolic extract of andaliman fruit have selective activity cervical cancer cell without inhibit the normal cell (Vero).
Keywords: MTT, Cytotoxicity, HeLa Cells, Vero Cells, Zanthoxylum
viii
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
HALAMAN JUDUL ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
KATA PENGANTAR ... iv
ABSTRAK ... vi
ABTRACT ... vii
DAFTAR ISI ... viii
DAFTAR TABEL ... xiii
DAFTAR GAMBAR ... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ... xv
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah ... 3
1.3 Hipotesis ... 4
1.4 Tujuan Penelitian ... 4
1.5 Manfaat Penelitian ... 5
1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6
2.1 Uraian Tumbuhan ... 6
2.1.1 Daerah tempat tumbuh (habitat) ... 6
2.1.2 Morfologi tumbuhan ... 7
ix
2.1.4 Nama asing ... 8
2.1.5 Kandungan kimia ... 8
2.1.6 Manfaat tumbuhan ... 9
2.2 Ekstraksi ... 9
2.2.1 Metode ekstraksi ... 10
2.3 Kanker ... 12
2.3.1 Tinjuan umum kanker ... 12
2.3.2 Sifat kanker ... 14
2.3.3 Karsinogenesis ... 17
2.4 Kanker Serviks ... 17
2.4.1 Patofisiologi kanker serviks ... 18
2.4.2 Etiologi dan faktor resiko kanker serviks ... 20
2.4.3 Klasifikasi stadium kanker serviks ... 21
2.4.4 Prognosis kanker serviks ... 23
2.4.5 Pencegahan kanker serviks ... 24
2.4.6 Pengobatan kanker ... 24
2.5 Kultur Sel ... 25
2.5.1 Hela cell line ... 25
2.6 Uji Sitotoksik ... 26
BAB IIIMETODE PENELITIAN... 29
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ... 29
3.2 Alat dan Bahan ... 29
3.2.1 Alat ... 29
x
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan ... 30
3.3.1 Pengambilan bahan ... 30
3.3.2 Identifikasi tumbuhan ... 31
3.3.3 Pembuatan simplisia ... 31
3.4 Pembuatan Pereaksi ... 31
3.4.1 Pereaksi Bouchardat ... 31
3.4.2 Pereaksi Dragendorff ... 31
3.4.3 Pereaksi Mayer ... 32
3.4.4 Pereaksi besi (III) klorida 1% ... 32
3.4.5 Pereaksi Molish ... 32
3.4.6 Pereaksi timbal (II) asetat 0,4 M ... 32
3.4.7 Pereaksi asam klorida 1 N ... 32
3.4.8 Pereaksi asam klorida 2 N ... 32
3.4.9 Pereaksi natrium hidroksida 1 N ... 33
3.4.10 Pereaksi natrium hidroksida 2 N ... 33
3.4.11 Larutan kloralhidrat... 33
3.4.12 Pereaksi Liebermann-Burchard ... 33
3.5 Skrining Fitokimia Serbuk Simplisia dan Ekstrak ... 33
3.5.1 Pemeriksaan alkaloid ... 33
3.5.2 Pemeriksaan flavonoid ... 34
3.5.3 Pemeriksaan glikosida... 34
3.5.4 Pemeriksaan glikosida antrakinon ... 35
3.5.5 Pemeriksaan saponin ... 35
xi
3.5.7 Pemeriksaan steroid/triterpenoid ... 36
3.6 Karakterisasi Simplisia ... 36
3.6.1 Pemeriksaan makroskopik ... 36
3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik ... 36
3.6.3 Penetapan kadar air ... 37
3.6.4 Penetapan kadar sari larut dalam air ... 37
3.6.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol ... 38
3.6.6 Penetapan kadar abu total ... 38
3.6.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam ... 38
3.7 Pembuatan Ekstrak ... 39
3.8 Sterilisasi Alat dan Bahan ... 39
3.9 Pembuatan Media ... 39
3.9.1 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ... 39
3.9.2 Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK-RPMI) .... 40
3.9.3 Pembuatan Media M199 ... 41
3.9.4 Pembuatan MK-M199 ... 41
3.10 Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Buah Andaliman (EEBA) .... 42
3.11 Penumbuhan Sel ... 42
3.11.1 Penumbuhan sel HeLa ... 42
3.11.2 Penumbuhan sel Vero ... 43
3.12 Subkultur Sel ... 43
3.12.1 Subkultur sel HeLa ... 43
3.12.2 Subkultur sel Vero ... 44
xii
3.13.1 Panen sel HeLa ... 44
3.13.2 Panen sel Vero ... 44
3.14 Perhitungan Sel HeLa dan Sel Vero ... 45
3.15 Pembuatan Larutan Uji ... 46
3.16 Pengujian Sitotoksik ... 46
3.16.1 Pengujian sitotoksik terhadap sel HeLa ... 46
3.16.2 Pengujian sitotoksik terhadap Sel Vero ... 47
3.17 Analisis Hasil ... 48
3.18 Indeks Selektivitas ... 48
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 49
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan ... 49
4.2 Hasil Karakterisasi Simplisia ... 49
4.3 Hasil Skrining Fitokimia ... 51
4.4 Hasil Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Buah Andaliman (EEBA) Terhadap Sel HeLa Menggunakan Metode MTT .. 53
4.5 Efek Sitotoksik EEBA Terhadap Sel HeLa dan Sel Vero ... 56
4.5.1 Efek sitotoksik terhadap sel HeLa ... 56
4.5.2 Efek sitotoksik terhadap sel Vero ... 58
4.6 Pengaruh Selektivitas EEBA Terhadap Sel HeLa dan Sel Vero ... 59
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 62
5.1 Kesimpulan ... 62
5.2 Saran ... 62
DAFTAR PUSTAKA ... 63
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Stadium kanker serviks menurut International Federation of
Gynecology and Obstertics (FIGO) 1988 ... 22
Tabel 4.1 Hasil karakterisasi simplisia buah andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium DC.) ... 50
Tabel 4.2 Hasilskrining fitokimia simplisia dan ekstrak etanol buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) ... 51
Tabel 4.3 Presentase sel HeLa hidup dengan perlakuan EEBA ... 57
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ... 5
Gambar 2.1 Buah andaliman ... 8
Gambar 2.2 Proses terjadinya karsinogenesis sel ... 17
Gambar 2.3 Reduksi MTT menjadi formazan ... 28
Gambar 3.1 Hemositometer (kamar hitung) ... 45
Gambar 4.1 Kristal formazan ... 54
Gambar 4.2 Perbedaan warna media berisi sel HeLa dan sel vero dengan larutan uji setelah pemberian MTT (3 kali pengulangan) ... 55
Gambar 4.3 Hubungan konsentrasi larutan uji terhadap % sel HeLa hidup ... 57
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Hasil identifikasi tumbuhan andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium DC.) ... 68
Lampiran 2. Gambar makroskopik simplisia buah andaliman ... 69
Lampiran 3. Gambar mikroskopik simplisia buah andaliman ... 70
Lampiran 4. Bagan kerja penelitian ... 71
Lampiran 5. Perhitungan kadar air simplisia buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) ... 72
Lampiran 6. Perhitungan kadar sari larut dalam air simplisia buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) .. ... 73
Lampiran 7. Perhitungan kadar sari larut dalam etanol simplisia buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) .. ... 74
Lampiran 8. Perhitungan kadar abu total simplisia buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) ... 75
Lampiran 9. Perhitungan kadar abu tidak larut dalam asam simplisia buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) ... 76
Lampiran 10. Rendemen ekstrak etanol buah andaliman ... 77
Lampiran 11. Perhitungan jumlah sel HeLa pada hemositometer ... 78
Lampiran 12. Perhitungan jumlah sel Veropada hemositometer ... 79
Lampiran 13. Perhitungan persen sel hidup dari berbagai konsentrasi larutan uji ekstrak etanol buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) terhadap sel HeLa ... 80
Lampiran 14. Perhitungan persen sel hidup dari berbagai konsentrasi larutan uji ekstrak etanol buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) terhadapsel Vero ... 81
xvi
Lampiran 16. Perhitungan nilai IC50 ekstrak etanol buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) sel Vero
menggunakan analisa probit SPSS 19 ... 83
Lampiran 17. Bagan kerja pembuatan ekstrak etanol buah andaliman ... 84
Lampiran 18. Bagan pembuatan media RPMI ... 85
Lampiran 19. Bagan pembuatan media M199 ... 86
Lampiran 20. Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK-RPMI) dan (MK-M199) ... 87
Lampiran 21. Bagan penumbuhan sel HeLa ... 88
Lampiran 22. Bagan penumbuhan sel Vero ... 89
Lampiran 23. Bagan panen sel HeLa ... 90
Lampiran 24. Bagan panen sel Vero ... 91
Lampiran 25. Bagan perhitungan sel HeLa dan sel Vero ... 92
Lampiran 26. Bagan pembuatan larutan uji ... 93
Lampiran 27. Bagan pengujian sitotoksik ... 94
Lampiran 28. Gambar sel HeLa dan sel Vero yang telah konfluen (dilihat di bawah mikroskop inverted dengan perbesaran 10 x 10) ... 95
Lampiran 29. Gambar sel HeLa dan sel Vero dalam kamar hitung (dilihat di bawah mikroskop inverted dengan perbesaran 10 x 10) ... 96
Lampiran 30. Gambar morfologi sel kanker serviks HeLa dan Vero (dilihat dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 10 x 10) setelah pemberian ekstrak dari konsentrasi tertinggi hingga terendah ... 97
vi
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETANOL BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
TERHADAP SEL KANKER SERVIKS
Abstrak
Kanker serviks merupakan salah satu jenis kanker yang menjadi penyebab kematian terbesar di Indonesia pada wanita. Penyebab utama kanker serviks adalah Human Papilloma Virus (HPV). Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) adalah salah satu tanaman yangdikenal dalam masyarakat Batak, tergolong dalam tanaman liar yang belum banyak dimanfaatkan sebagai tanaman obat. Buah andaliman diyakini memiliki potensi antikanker. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui karakteristik simplisia buah andaliman, menghitung nilai IC50 ekstrak terhadap sel HeLa dan menghitung indeks selektivitas ekstrak etanol buah andaliman.
Ekstrak diperoleh dengan maserasi menggunakan pelarut etanol 96%. Uji aktivitas sitotoksik EEBA secara in vitro terhadap sel HeLa dan sel Vero menggunakan metode MTT. Sel HeLa ditumbuhkan dalam media kultur RPMI pada plate 96-sumuran kemudian diberi ekstrak etanol buah andaliman dengan seri konsentrasi 500 µ g/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62,5 µg/mL; 31,25 µg/mL dan 15,625 µg/mL.Sel Vero ditumbuhkan dalam media kultur M199 pada96-sumuran kemudian diberi ekstrak etanol buah andaliman dengan seri konsentrasi 1000 µg/mL; 500 µg/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62,5 µg/mL dan 31,25 µg/mL. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada 595 nm dan dianalisis dengan SPSS 19 kemudian dihitung indeks selektivitasnya.
Hasilskrining fitokimia terhadap simplisia dan ekstrak etanol buah andaliman diperoleh senyawa kimia golongan alkaloid, flavonoid, tanin, glikosida, dan steroid/triterpenoid. Hasil pemeriksaan karakteristik simplisia diperoleh kadar air 6,30%; kadar sari larut air 12,41%; kadar sari larut dalam etanol 16,28%; kadar abu total 4,62% dan kadar abu tidak larut asam 0,20%. Hasil pengujian aktivitas sitotoksik ekstrak etanol buah andaliman terhadap sel HeLa menunjukkan nilai IC50sebesar 42,462 µg/mL dan pada sel Vero sebesar 258,167µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah andaliman memiliki efek sitotoksisitas yang poten terhadap sel kanker serviks HeLa. EEBA memiliki indeks selektivitas sebesar 6,08. Hal ini berarti EEBA bekerja selektif yaitu hanya menghambat sel kanker serviks tanpa mematikan sel normal (Vero).
Kata Kunci: MTT, sitotoksisitas, Sel HeLa, Sel Vero, Zanthoxylum
vii
ANTICANCER ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT FROM ANDALIMAN FRUIT (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
ON CERVICAL CANCER CELLS
Abstract
Cervical cancer is one type of the largest cancer that becomes largest cause of death woman in Indonesia.The main cause of cervical cancer is Human Papilloma Virus (HPV).Andaliman ( Zanthoxylum acanthopodium DC.) is one of the plant which well known within the community Bataknese were classified as a part wild plants that have not been widely used as a medicinal plant. Fruit andaliman does believed have anticancer potential. The purpose of this research were to known characteristic of andaliman fruit simplex, to determinated the IC50 value of extract on HeLa cell and determinated the selectivity index of EEBA.
Extraction were used maceration method with 96% ethanol. Cytotoxic effect was tested in vitro on HeLa and Vero cells line using MTT assay. HeLa cells were seeded in RPMI medium at 96-well plate and then were given andaliman fruitethanolic extract with concentration 500 µg/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62.5 µg/mL;31.25 µg/mL and 15.625 µg/mL. While Vero cells were seeded in M199 culture medium at 96-well plate and then were given extract with concentration 1000 µg/mL; 500 µg/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62.5µ g/mL and 31.25 µg/mL The absorbanceswere read by ELISA reader at ƛ 595 nm and analysed with SPSS 19 and calculated selectivity index.
The results of photochemical screening from simplex and ethanol extract of Andaliman fruit contains alkaloid, flavonoids, glikosids, tannins and steroids/triterpenoids. The result of the simplex characteristics were showed that 6.30% water content; 12.41% water-soluble extract content; 16.28% ethanol-soluble extract content; 4.62% total ash and 0.20% acidic unethanol-soluble ash. The cytotoxic activity assay was showed that ethanol extract of Andaliman fruit on HeLa cells have IC50 values of 42.462 µ g/mL and for Vero cells was showed IC50 values of 258.167 µ g/mL. Andaliman fruits ethanolic extract was exhibited cytotoxic effect against cervical cancer HeLa cells. EEBA have selectivity index of 6.08. Ethanolic extract of andaliman fruit have selective activity cervical cancer cell without inhibit the normal cell (Vero).
Keywords: MTT, Cytotoxicity, HeLa Cells, Vero Cells, Zanthoxylum
1
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kanker merupakan salah satu jenis penyakit yang cukup banyak terjadi
dimasyarakat. Menurut WHO pada tahun 2002, Indonesia merupakan negara
dengan penderita kanker mulut rahim (serviks) nomor satu di dunia. Di
Indonesiasendiri diperkirakan setiap harinya terjadi 41 kasus baru kanker
serviksdan 20 perempuan meninggal dunia karena penyakit tersebut (Rachmani,
2012). Kanker serviks merupakan jenis kanker yang paling banyak angka
kejadiannya (sekitar 27%) pada perempuan di Indonesia.Lebih dari 70% penderita
datang memeriksakan diri dalam stadium lanjut,sehingga banyak menyebabkan
kematian karena terlambat ditemukan dan diobati. Tingginya angka ini biasanya
disebabkan rendahnya pengetahuan dan kesadaran akan bahaya kanker serviks
(Yuliatin, 2011).
Melihat perkembangan jumlah penderita dan kematian akibat kanker
serviks, diperkirakan bahwa sekitar 10 persen wanita di dunia sudah terinfeksi
Human Papilloma Virus (HPV). Muncul fakta baru bahwa semua perempuan
mempunyai risiko untuk terkena infeksi HPV (Dunleavey, 2009).
Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) adalah salah satu tanaman
yangdikenal masyarakat Batak, tergolong tanaman liar dan merupakan tanaman
khas Propinsi Sumatera Utara yang belum banyak dimanfaatkan sebagai tanaman
obat (Suryanto, dkk., 2004). Bagian kulit kayu dan daun tanaman yang berasal
2
inflamasi dan rematik. Buah andaliman mengandung banyak senyawa yang
bersifat antioksidan (Wijaya, 1999). Buah andaliman telah dilaporkan memiliki
aktivitas antiinflamasi dan juga telah diteliti aktivitas antioksidan ekstrak etanol
buah andaliman serta aktivitas antiradikal ekstrak etanol buah andaliman
konsentrasi 200 µ g/mL menunjukkan daya inhibisi 61,81%, memiliki aktivitas
penghambatan xantin oksidase sebesar 9,9 µg/mL; 3,9 µg/mL; 9,54 µg/mL; 3,69
µg/mL dan 4,03 µ g/mL serta memiliki aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
pada ekstrak petroleum eter 220,67 µg/mL; diklormetana 88,26 µg/mL; etilasetat
83,50 µg/mL; butanol 53,53 µg/mL; metanol 26,39 µg/mL (Kristanty, 2012),
n-heksana 349,72µ g/mL dan etanol 32, 19 µg/mL (Gultom, 2012).
Buah andaliman juga diketahui memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel
MCF-7 dan sel T47D. Pada sel MCF-7, ekstrak etanol buah andaliman (EEBA)
memberikan hasil IC50 sebesar 957,499 µ g/mL; ekstrak n-heksana buah andaliman
(ENBA) memberikan hasil IC50 sebesar 159,747 µg/mL danekstrak etilasetat buah
andaliman (EEABA) memberikan hasil IC50 sebesar 136,490 µg/mL. Pada sel
T47D, EEBA memberikan hasil IC50 sebesar 463,231 µg/mL (Thaib, 2013),
ENBAmemberikan hasil IC50 sebesar 30,908 µg/mL dan EEABA memberikan
hasil IC50 sebesar24,476 µg/mL (Anggraeni, 2014). Ekstrak dinyatakan aktif
apabila memberikan nilai IC50 10 - 100 µg/mL dan cukup aktif apabila
memberikan nilai IC50 100-500 µg/mL (Weerapreeyakul, dkk., 2012).
Kultur sel HeLa atau HeLa cell line merupakan continuous cell line yang
diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim (cervix) seorang wanita penderita
kanker leher rahim bernama Henrietta Lacks yang meninggal akibat kanker pada
3
digunakan sebagai model untuk pengujian antikanker. Sel Vero merupakan sel
monolayer berbentuk poligonal dan pipih yang diisolasi dari sel ginjal monyet
hijau afrika oleh Yasumura dan Kawakita di Universitas Chiba, Jepang. Sel Vero
biasa digunakan untuk mempelajari pertumbuhan sel, diferensiasi sel,
sitotoksisitas, dan transformasi sel yang diinduksi oleh berbagai senyawa kimia.
Sel ini juga direkomendasikan untuk dijadikan sebagai model dalam mempelajari
karsinogenesis secara in vitro (Goncalves, dkk., 2006).
Penelitian untuk membuktikan efek sitotoksik dari ekstrak etanol buah
Andaliman terhadap kanker serviks belum pernah dilakukan. Oleh karena itu,
peneliti tertarik untuk melakukan penelitian pendahuluan dengan melihat efek
sitotoksiknya terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero. Selain itu, peneliti juga ingin
mengetahui apakah ekstrak ini dapat bekerja selektif, yaitu apakah mampu
menghambat sel kanker serviks tanpa menghambat sel normal.
Penelitian ini meliputi pembuatan simplisia, karakterisasi simplisia,
skrining fitokimia, pembuatan ekstrak dengan metode maserasi menggunakan
pelarut etanol 96%, uji sitotoksik Ekstrak Etanol Buah Andaliman (EEBA)
terhadap kultur sel HeLa dan Vero serta menghitung Indeks Selektivitas (IS)
EEBA.
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian diatas, maka perumusan masalah dari penelitian ini
sebagai berikut:
a. Apakah karakteristik simplisia buah Andaliman (Zanthoxylum
4
b. Golongan senyawa kimia apakah yang terkandung di dalam buah
Andaliman?
c. Apakah ekstrak etanol buah Andaliman memiliki efek sitotoksik pada sel
HeLa dan sel Vero?
d. Apakah ekstrak etanol buah Andaliman selektif terhadap sel HeLa dan sel
Vero?
1.3 Hipotesis
Berdasarkan perumusan masalah diatas, maka hipotesis dari penelitian ini
adalah:
a. Karakteristik simplisia buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium
DC.) dapat ditentukan.
b. Buah Andaliman mengandung golongan senyawa kimia seperti alkaloid,
flavonoid, tanin, saponin, glikosidadan steroid/triterpenoid.
c. Ekstrak etanol buah Andaliman memiliki efek sitotoksik pada sel HeLa
dan sel Vero.
d. Ekstrak etanol buah Andaliman selektif terhadap sel HeLa dan sel Vero.
1.4 Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk:
a. Mengetahui karakteristik simplisiabuah Andaliman.
b. Mengetahui golongan senyawa kimia yang terkandung dalam buah
Andaliman.
5
d. Mengetahui nilai IS ekstrak etanol buah Andaliman terhadap sel kanker
serviks.
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah:
a. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang efek
antikanker dari ekstrak etanol buah Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium DC.).
b. Menambah inventaris tanaman obat yang berkhasiat sebagai antikanker.
1.6 Kerangka Pikir Penelitian
Variabel Bebas Variabel Terikat Parameter
Gambar 1.1 Diagram Kerangka Pikir Penelitian
Simplisia buah 4. Nilai kadar abu total 5. Nilai kadar abu tidak
larut dalam asam 6. Nilai kadar sari larut
dalam air
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Uraian Tumbuhan
Uraian tumbuhan meliputi daerah tumbuh (habitat), morfologi
tumbuhan,sistematika tumbuhan, nama asing, kandungan kimia dan manfaat
tumbuhan.
2.1.1 Daerah tumbuh (habitat)
Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) merupakan salah satu jenis
rempah-rempah dari tumbuhan liar yang dikenal oleh masyarakat Batak,
SumateraUtara. Andaliman termasuk tanaman rempah yang tumbuh di
pegunungan kawasan Danau Toba dan sekitarnnya. Diduga penyebaran tanaman
secara umum melalui burung yang memakan buah andaliman, kemudian melalui
kotoran burung tersebut biji andaliman tersebar kemana-mana dan tumbuh secara
liar (Parhusip, 2006). Asal tumbuhan ini dari daerah Himalaya Subtropis. Di
dunia, tumbuhan ini tersebar antara lain di India Utara, Nepal, Pakistan Timur,
Myanmar, Thailand dan Cina. Di Cina, tumbuhan ini tumbuh pada ketinggian
2900 m dpl. Di Indonesia,tumbuhan ini tumbuh liar pada daerah dengan
ketinggian 1400 m dpl pada temperatur 15 - 18 oC (Wijaya, 1999). Di Sumatera
Utara tanaman ini tumbuh liar pada berbagai tempat, yaitu di daerah Angkola,
Mandailing, Humbang, Silindung, Dairi dan Toba Holbung (Parhusip, 2006).
Andaliman bukan ditanam seperti cabai, merica dan sayur-mayur lainnya.
7
2.1.2 Morfologi tumbuhan
Andaliman merupakan tumbuhan perdu, tegak dengan tinggi 3 - 8 meter
,batang dan cabang berwarna kemerahan, berbulu halus dan berduri.Bunganya
majemuk berbatas mempunyai kelopak yang disusun oleh lima daun kelopak
bebas. Buah andaliman termasuk buah sejati berdiameter 3 - 4 mm yang berasal
dari satu bunga dengan banyak bakal buah yang masing-masing bebas dan
kemudian tumbuh menjadi buah tetapi berkumpul pada satu tangkai (Siregar,
2002). Daunnya merupakan daun majemuk dengan panjang 2 - 25 cm, anak daun
1- 6 pasang dengan tangkai yang pendek, tepi daun bergerigi, ujung daun runcing,
warna daun hijau dan permukaan atas daun lebih tua dibanding permukaan bawah
daun. Tumbuhan ini berkembang biak dengan biji. Sistem akartunggang dimana
tumbuh menjadi akar pokok yangbercabangmenjadi akar yang lebih kecil dan
sedikit berbulu halus diseluruh permukaannya (Parhusip, 2006).
2.1.3 Sistematika tumbuhan
Sistematika tumbuhan andaliman menurut Sharma (1993), sebagai berikut:
Kingdom : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae
Ordo : Rutales
Famili : Rutaceae
Genus : Zanthoxylum
8
A B
Gambar 2.1 Buah andaliman; A. Buah muda, B. Buah yang sudah tua 2.1.4 Nama asing
Nama asing andaliman adalah yan-jiao (Cina), mouh laaht faa jiu
(CinaKanton), mao la hua jiao (Cina Mandarin), indonesian lemon pepper
(Inggris), indonesischer zitronenpfeffer (Jerman), tambhul (India), sansho
(Jepang) dan emmay/yerma (Tibet) (Anonim, 2012).
2.1.5 Kandungan kimia
Buah andaliman mengandung senyawa polifenolat, monoterpen dan
seskuiterpen sertakuinon. Selain itu juga terdapat minyak atsiri seperti geraniol,
linalool, cineol dan citronella yang menimbulkan kombinasi bau mint dan lemon
(Sinaga, 2009). Ekstrak andaliman diketahui jugamengandung flavonoid, alkaloid,
terpenoid dan steroid (Nababan, 2012).
Tanaman andaliman juga mengandung senyawa terpenoid yang memiliki
aktivitas antioksidan yang sangat baik bagi kesehatan dan berperan dalam
mempertahankan mutu produk pangan dari berbagai kerusakan seperti ketengikan,
perubahan nilai gizi serta perubahan warna dan aroma makanan. Senyawa
9
2.1.6 Manfaat tumbuhan
Buah andaliman banyak digunakan sebagai bahan aromatik, tonik,
perangsang nafsu makan dan obat sakit perut (Sirait, dkk., 1991). Selain itu buah
andaliman memiliki aktivitas fisiologi sebagai antioksidan, antimikroba,
hepatoprotektif, antiplasmodial, sitotoksik, antiproliferatif, antelmintik, antivirus
dan antikonvulsan. Secara tradisional, buah andalimann digunakan sebagai bumbu
masak yang dapat mengobati asma dan bronkitis, menghilangkan rasa sakit,
mengobati penyakit jantung, penyakit mulut, gigi dan tenggorokan (Wijaya,
1999).
2.2 Ekstraksi
Ekstraksi berasal dari kata “extrahere”, “to draw out”, yaitu suatu cara
untuk menarik satu atau lebih zat dari asalnya. Tujuan utama ekstraksi adalah
mendapatkan atau memisahkan sebanyak mungkin zat-zat yang memiliki khasiat
pengobatan dari zat-zat yang tidak dibutuhkan, agar lebih mudah dipergunakan
(kemudahan diabsorpsi, rasa dan pemakaian) dan disimpan sehingga tujuan
pengobatannya lebih terjamin (Syamsuni, 2006).
Hasil ekstraksi disebut dengan ekstrak, yaitu sediaan pekat yang diperoleh
dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani
menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut
diuapkan. Simplisia yang digunakan dalam proses pembuatan ekstrak adalah bahan
alamiah yang belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan
10
2.2.1 Metode ekstraksi
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut
sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair (Depkes RI,
2000). Ekstraksi dengan menggunakan pelarut dapat dilakukan dengan beberapa
cara yaitu :
1. Cara dingin
a. Maserasi
Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia dengan menggunakan pelarut dengan
beberapa kali pengadukan pada temperatur ruangan (Depkes RI, 2000).
b. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai terjadi
penyarian sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur kamar. Proses
ini terdiri dari tahap pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap
perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak) (Depkes RI, 2000).
2. Cara panas
a. Refluks
Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama
waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya
pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama
sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna.
b. Sokletasi
Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang umumnya dilakukan
dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut
11
xx
c. Digesti
Digesti adalah maserasi dengan pengadukan kontinu pada temperatur yang lebih
tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara umum dilakukan pada temperatur
40 - 500C (Depkes RI, 2000).
d. Infundasi
Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia nabati dengan
air pada suhu 90 0C selama 15 menit (Depkes RI, 1979).
e. Dekoktasi
Dekok adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia nabati dengan
air pada waktu yang lebih lama yaitu ± 30 menit dan dilakukan pada temperatur
air mendidih (Depkes RI, 2000).
Metode ekstraksi dipilih berdasarkan beberapa faktor seperti sifat dari
bahan mentah obat dan daya penyesuaian dengan tiap macam metode ekstraksi
dan kepentingan dalam memperoleh ekstrak yang sempurna atau mendekati
sempurna dari obat. Kelarutan dan stabilitas bahan kandungan tumbuhan
merupakan sifat yang penting untuk memperoleh sediaan obat yang tepat, oleh
karena banyak bahan tumbuhan larut dalam air atau alkohol sehingga air atau
etanol menjadi acuan cairan pengekstraksi (Voight,1994).
Cara ekstraksi dapat dilakukan dengan teknik maserasi. Istilah maserasi
berasal dari bahasa Latin macerare, yang artinya “merendam”. Maserasi
merupakan proses yang paling tepat di mana obat yang sudah halus dimungkinkan
untuk direndam di dalam menstruum sampai meresap dan melunakkan susunan sel,
sehingga zat-zat yang mudah larut akan melarut (Ansel, 2008).
12
wadah atau bejana yang bermulut lebar. Bejana ditutup rapat, dan isinya dikocok
berulang-ulang biasanya berkisar 2-14 hari. Pengocokan memungkinkan pelarut
segar mengalir berulang-ulang masuk ke seluruh permukaan obat yang sudah
halus. Cara lain untuk pengocokan berulang-ulang ini adalah menempatkan obat
dalam kantung kain berpori yang diikat dan digantungkan pada bagian atas
menstruum, banyak persamaannya dengan kantung teh yang digantungkan dalam
air dalam pembuatan secangkir teh. Begitu zat-zat terlarut di dalam menstruum, ia
cenderung untuk turun ke dasar bejana karena meningkatnya gaya berat. Ekstrak
dipisahkan dari ampasnya dengan memeras kantung obat dan membilasnya dengan
penambahan menstruum baru, hasil pencucian merupakan tambahan ekstrak.
Apabila maserasi dilakukan tidak di dalam kantung, maka ampas dipisahkan
dengan menapis atau menyaring, di mana ampas yang disaring bebas dari ekstrak.
Maserasi biasanya dilakukan pada temperatur 15 - 20oC dalam waktu selama 3 hari
sampai bahan yang mudah larut akan melarut (Ansel, 2008).
2.3 Kanker
2.3.1 Tinjauan umum kanker
Kanker atau karsinoma adalah pembentukan jaringan baru yang abnormal
dan bersifat ganas (maligne). Satu kelompok sel dengan mendadak menjadi liar
dan memperbanyak diri secara pesat dan terus menerus (proliferasi). Sel-sel
kanker ini menginfiltrasi jaringan sekitarnya dan memusnahkannya (Tjay dan
Rahardja, 2002). Berdasarkan lokalisasinya kanker atau yang merupakan tumor
ganas dibedakan sebagai berikut: karsinoma (pada jaringan kelenjar), sarkoma
(pada jaringan penghubung), limfoma (pada ganglia limfatik) dan leukemia (pada
13
Kanker umumnya didefinisikan sebagai suatu pertumbuhan atau tumor
hasil dari pembelahan sel yang tidak normal dan tidak terkendali. Sel-sel
normal dalam tubuh terus mengalami pembelahan sel-sel tua lalu menggantinya
dengan sel yang baru. Proses pertumbuhan dan kematian sel tua secara benar
disebut sebagai homeostasis, yang mana bertujuan untuk menjaga
keseimbangan yang sehat dalam kehidupan. Untuk mencapai tujuan ini,
pertumbuhan sel dan pembelahan terjadi dalam proses yang disebut siklus sel,
dan langkah-langkah itu dikendalikan oleh berbagai mekanisme genetik dan
molekuler. Bila salah satu atau beberapa bagian mekanisme itu mengalami
kerusakan dalam siklus sel, itulah yang menyebabkan kanker (Mulyadi, 1997).
Kanker terjadi melalui beberapa tingkat yaitu:
a) Fase inisiasi: DNA dirusak akibat radiasi atau zat karsinogen (radikalbebas).
Zat-zat inisiator ini mengganggu proses reparasi normal, sehingga terjadi
mutasi DNA dengan kelainan pada kromosomnya. Kerusakan DNA
diturunkan kepada anak-anak sel dan seterusnya
b) Fase promosi: zat karsinogen tambahan (co-carsinogens) diperlukan sebagai
promotor untuk mencetuskan proliferasi sel. Dengan demikian, sel-sel rusak
menjadi ganas
c) Fase progesi: gen-gen pertumbuhan yang diaktivasi oleh kerusakan DNA
mengakibatkan mitosis dipercepat dan pertumbuhan liar dari sel-sel ganas.
(Tjay dan Rahardja, 2002).
Kriteria sitologi yang memungkinkan ahli patologi untuk mendiagnosis, atau
14
1. Morfologi sel kanker biasanya berbeda dan lebih bervariasi dari sel normal
pada jaringan yang sama. Ukuran dan bentuk sel kanker lebihbervariasi
2. Nucleus sel kanker biasanya lebih besar dan kromatinnya lebih terlihat
(hipercromatic) daripada nucleus pada sel normal
3. Jumlah sel yang bermitosis biasanya lebih banyak pada suatu populasi
selkanker dibandingkan pada populasi jaringan normal. Dua puluh atau
lebih figur mitosis per 1000 sel sering dijumpai pada jaringan kanker,
sedangkan kurang dari satu per 1000 biasa ditemui pada tumor jinak atau
jaringan normal. Jumlah ini lebih besar pada jaringan normal yang
memiliki tingkat pertumbuhan yang tinggi seperti pada sumsum tulang
atau sel crypt pada mukosa gastrointestinal
4. Banyaknya mitosis abnormal atau sel raksasa, pleomorphic (variasi ukuran
dan bentuk) atau nuclei lebih dari satu biasa ditemukan pada jaringan
ganas daripada jaringan normal
5. Invasi jaringan normal oleh neoplasma menunjukkan bahwa tumor telah
menginvasi dan menyebar (Ruddon, 2007).
2.3.2 Sifat kanker
Kanker mempunyai berbagai sifat umum, diantaranyaadalah:
1) Heterogenitas
Populasi sel dalam suatu tumor tidak homogeny, tetapi heterogen, walaupun
semua berasal dari satu sel yang sama. Heterogenitas ini terjadi karena sel-sel
kanker tumbuh dengan cepat, sehingga sebelum dewasa dan matang telah
mengalami mitosis, terus berkembang sehingga semakin lama semakin banyak
15 bentuk yang bervariasi (Sukardja, 2000).
2) Tumbuh autonom
Sel kanker tumbuh terus tanpa batas(immortal), liar, terlepas dari kendali
pertumbuhan normal sehingga terbentuk suatu tumor yang terpisah dari bagian
tubuh yang normal. Tumor dapat menimbulkan kelainan bentuk dan gangguan
fungsi organ yang ditumbuhinya. Sel-sel normal setelah beberapa generasi akan
berhenti tumbuh. Hanya sel yang disebut stem sel masih mempunyai kemampuan
tumbuh bila ada rangsangan untuk tumbuh (Sukardja, 2000).
3) Mendesak dan merusak sel-sel normal disekitarnya
Sel-sel tumor mendesak (ekspansif) sel-sel normal disekitarnya, yang berubah
menjadi kapsul yang membatasi pertumbuhan tumor. Pada tumor jinak, kapsul itu
berupa kapsul sejati yang memisahkan gerombolan sel tumor dengan sel-sel
normal, sedangkan pada tumor ganas berupa kapsul palsu, karena kapsul itu dapat
ditembus atau diinfiltrasi oleh sel-sel kanker (Sukardja, 2000).
4) Dapat bergerak sendiri (amoeboid)
Sel-sel kanker itu dapat bergerak sendiri seperti amoeba dan lepas dari
gerombolan sel-sel tumor induknya, masuk diantara sel-sel normal disekitarnya.
Hal ini menimbulkan:
a) Infiltrasi atau invasi ke jaringan atau organ di sekitarnya.
Sel-sel kanker dapat tumbuh di jaringan sekitarnya, menimbulkan
perlekatan-perlekatan, obstruksi saluran-saluran tubuh.
b) Metastase atau anak sebar dikelenjar limfa atau di organ lainnya.
Sel-sel kanker dapat masuk ke dalam pembuluh limfa dan bersama aliran
16
limfogen). Sel - sel kanker dapat pula masuk ke dalam pembuluh darah
dan bersama aliran darah beredar keseluruh tubuh (penyebaran
hematogen (Sukardja, 2000).
5) Tidak mengenal koordinasi dan batas-batas kewajaran
Ketidakwajaran itu antara lain disebabkan oleh:
a) Kurang daya adhesi dan kohesi
Karena kurangnya daya adhesi dan kohesi sel-sel kanker itu mudah lepas
dari gerombolan sel-sel induknya dan dapat bergerak menyusup diantara
sel-sel normal
b) Tidak mengenal kontak inhibisi
Sel-sel normal akan berhenti tumbuh jika ada kontak dengan sel normal
disekitarnya, sedangkan sel kanker tidak
c) Tidak mengenal tanda posisi
Sel-sel normal akan berhenti tumbuh jika berada pada tempat atau posisi
yang tidak semestinya, sedangkan sel kanker tidak, sehingga dapat timbul
anak sebar (metastase)
d) Tidak mengenal batas kepadatan
Sel normal akan berhenti tumbuh jika kepadatan sel telah mencapai
konsistensi tertentu, sedangkan sel kanker tidak (Sukardja, 2000).
6) Tidak menjalankan fungsinya yang normal
Sel-sel kanker merusak fungsi organ yang ditumbuhinya. Hal ini antara lain
karena (Sukardja, 2000):
a) Membran sel kanker tidak mengandung fibronektinya itu suatu
17 kurang, muatan listrik kurang
b) Sel kanker dapat membentuk hormon, enzim dan protein yang pada
pertumbuhan sel normal hanya diproduksi oleh sel-sel tertentu saja
2.3.3 Karsinogenesis
Karsinogenesis adalah suatu proses perubahan struktur DNA yang bersifat
irreversible, sehingga terjadi kanker. Salah satu factor terbentuknya kanker karena
adanya sel epitel yang terus berkembang (berproliferasi). Saat berproliferasi,
genetik sel bisa berubah akibat adanya pengaruh agen karsinogen yang
menyebabkan hilangnya penekanan terhadap proses proliferasi sel. Perubahan sel
menjadi ganas juga melibatkan gen-gen yang mengatur pertumbuhan sel,
akibatnya sel berkembang tidak terkendali.
Gambar 2.2 Proses terjadinya karsinogenesis sel (Mulyadi,1997) 2.4 Kanker Serviks
Kanker serviks (cervical cancer) adalah kanker yang terjadi pada area
leher rahim (serviks). Serviks adalah bagian rahim yang menghubungkan uterus
bagian atas dengan vagina. Bagian serviks yang dekat dengan uterus disebut
18
dimana kedua bagian tersebut bertemu disebut zona transformasi. Sebagian besar
kanker serviks berawal pada zona transformasi (Yuliatin, 2011).
Kanker serviks adalah tumor ganas primer yang berasal dari metaplasia
epitel di daerah skuamokolumner junction yaitu daerah peralihan mukosa vagina
dan mukosa kanalis servikalis. Kanker serviks merupakan kanker yang terjadi
pada serviks atau leher rahim, suatu daerah pada organ reproduksi wanita yang
merupakan pintu masuk ke arah rahim, letaknya antara rahim (uterus) dan liang
senggama atau vagina. Kanker leher rahim biasanya menyerang wanita berusia 35
- 55 tahun. Sebanyak 90% dari kanker leher rahim berasal dari sel skuamosa yang
melapisi serviks dan 10% sisanya berasal dari sel kelenjar penghasil lendir pada
saluran servikal yang menuju ke rahim. Sebelum terjadinya kanker, akan
didahului oleh keadaan yang disebut lesi prakanker atau neoplasia intraepitel
serviks (NIS) (Yatim, 2005).
2.4.1 Patofisiologi kanker serviks
Karsinoma serviks adalah penyakit yang progresif, mulai dengan
intraepitel, berubah menjadi neoplastik, dan akhirnya menjadi kanker serviks
setelah 10 tahun atau lebih. Secara histopatologi lesi pre invasif biasanya
berkembang melalui beberapa stadium displasia (ringan, sedang dan berat)
menjadi karsinoma insitu dan akhirnya invasif. Berdasarkan karsinogenesis
umum, proses perubahan menjadi kanker diakibatkan oleh adanya mutasi gen
pengendali siklus sel. Gen pengendali tersebut adalah onkogen, tumor supressor
gen, dan repair gen. Onkogen dan tumor supresor gen mempunyai efek yang
berlawanan dalam karsinogenesis, dimana onkogen memperantarai timbulnya
19
perkembangan tumor yang diatur oleh gen yang terlibat dalam pertumbuhan sel.
Meskipun kanker invasif berkembang melalui perubahan intraepitel, tidak semua
perubahan ini progress menjadi invasif. Lesi preinvasif akan mengalami regresi
secara spontan sebanyak 3 - 35%. Bentuk ringan (displasia ringan dan sedang)
mempunyai angka regresi yang tinggi. Waktu yang diperlukan dari displasia
menjadi karsinoma insitu (KIS) berkisar antara 1 - 7 tahun, sedangkan waktu yang
diperlukan dari karsinoma insitu menjadi invasif adalah 3 - 20 tahun (Rustam,
1984).
Proses perkembangan kanker serviks berlangsung lambat, diawali adanya
perubahan displasia yang perlahan-lahan menjadi progresif. Displasia ini dapat
muncul bila ada aktivitas regenerasi epitel yang meningkat misalnya akibat
trauma mekanik atau kimiawi, infeksi virus atau bakteri dan gangguan
keseimbangan hormon. Dalam jangka waktu 7 - 10 tahun perkembangan tersebut
menjadi bentuk preinvasif berkembang menjadi invasif pada stroma serviks
dengan adanya proses keganasan. Perluasan lesi di serviks dapat menimbulkan
luka, pertumbuhan yang eksofitik atau dapat berinfiltrasi ke kanalis serviks. Lesi
dapat meluas ke forniks, jaringan pada serviks, parametria dan akhirnya dapat
menginvasi ke rektum atau vesikal urinaria. Virus DNA ini menyerang epitel
permukaan serviks pada sel basal zona transformasi, dibantu oleh faktor risiko
lain mengakibatkan perubahan gen pada molekul vital yang tidak dapat diperbaiki,
menetap dan kehilangan sifat serta kontrol pertumbuhan sel normal sehingga
20
2.4.2 Etiologi dan faktor resiko kanker serviks
Seperti kanker lain pada umumnya, penyebab kanker serviks belum
diketahui secara pasti penyebabnya, namun ada beberapa hal yang perlu
diperhatikan yang dapat menjadi faktor resiko, antara lain:
a) Aktivitas seksual
Aktivitas seksual lebih dari 2 partner dan tidak manggunakanalat
kontrasepsi beresiko menderita infeksi human papiloma virus (HPV)
(Clarke, 2001). Resiko wanita menderita kanker serviks akan semakin
tinggi bila berhubungan seksual dengan lelaki yang pernah berhubungan
seksual dengan perempuan yang menderita kanker serviks (Yatim, 2005).
b) Usia
Hubungan seksual pertama kali yang dilakukan pada usia remaja (12 - 20
tahun) mengakibatkan organ reproduksi wanita sedang aktif berkembang.
Rangsangan penis/sperma dapat memicu perubahan sifat sel menjadi tidak
normal. Sel abnormal ini berpotensi menyebabkan kanker serviks
(Wiknjosastro, 1999). Wanita yang melakukan hubungan seksual pertama
kali pada usia 10 - 14 tahun mempunyai faktor resiko 2 kali terkena infeksi
HPV (Clarke, 2001).
c) HPV (Human Papiloma Virus)
Human Papiloma Virus secara signifikan berkaitan dengan kanker serviks
intraepitel dan kanker serviks yang sudah invasi. Tipe virus yang di
anggap berkaitan dengan kanker serviks adalah tipe 16,18, 31, 35 dan 39
(Yatim, 2005).
21
Status ekonomi ini berkaitan dengan ketidakmampuan wanita untuk
melakukan deteksi dini terhadap kanker serviks serta berhubungan erat
dengan gizi serta imunitas (Wiknjosastro, 1999). Misalnya pada wanita
yang berpenghasilan tinggi lebih mungkin melakukan tes pap smear di
banding orang yang berpenghasilan rendah (Clarke, 2001).
e) Jumlah kehamilan
Jumlah kehamilan dan melahirkan, karsinoma uteri terbanyak dijumpai
pada wanita yang sering melahirkan semakin besar resiko terkena kanker
serviks (Yuliatin, 2011), pada wanita yang melahirkan pertama kali pada
usia 12 - 19 tahun juga meningkatkan resiko menderita kanker serviks
sebesar 60% dan 40% pada usia 20 - 24 tahun (Clarke, 2001).
f) Merokok
Merokok, merupakan faktor resiko yang signifikan pada kanker serviks.
Pada sebuah penelitian menunjukkan bahwa wanita yang aktif merokok
lebih dari 15 batang rokok perhari mempunyai resiko 2 kali lebih besar
terkena infeksi HPV dibanding wanita yang tidak merokok (Yatim, 2005).
2.4.3 Klasifikasi stadium kanker serviks
Klasifikasi stadium klinik berdasarkan FIGO (International Federationof
Gynecology and Obstetrics) adalah klasifikasi yang sering digunakan dalam
penentuan stadium kanker serviks. Stadium klinik ini merupakan proses untuk
mengetahui seberapa jauh penyebaran kanker. Proses penentuan stadium klinik ini
penting untuk dilakukan karena penetapan stadium kanker adalah faktor kunci
didalam memilih terapi yang tepat. Berikut tabel penentuan stadium kankerserviks
22
Tabel 2.1 Stadium kanker serviks menurut International Federation of
Gynecologyand Obstetrics (FIGO) 1988
Stadium Deskripsi
0 Karsinoma in situ (kanker pranvasif)
1 Proses terbatas pada serviks walaupun ada perluasan ke korpus uteri
1A Invasi kanker didiagnosa dengan mikroskopi (Karsinoma mikroinvasif)
1A1 Invasi minimal, semua lesi yang dapat dilihat dengan mikroskop
1A2 Kedalaman invasi stroma tidak lebih dari 3,00 mm atau kurang dan 7,00 mm atau kurang pada penyebaran yang mendatar
1B Kedalaman invasi stroma lebih dari 3,00 mm dan tidak lebih dari 5,00 dan 7,00 mm atau kurang pada penyebaran yang mendatar
1B1 Secara klinik lesi dapat dilihat 4,00 cm atau kurang dengan pembesaran maksimal
1B2 Secara klinik lesi dapat dilihat 4,00 atau lebih dengan pembesaran maksimal
II Karsinoma menyerang di luar serviks tetapi tidak sampai dinding panggul atau 1/3 bawah vagina
IIA Tanpa ada keterlibatan parametrium yang nyata
IIB Melibatkan parametrium nyata
III Tumor meluas ke dinding pelvis dan/atau meliputi 1/3 distal vagina dan/atau menyebabkan hydronephrosis atau tidak berfungsinya ginjal
IIIA Tumor meluas ke 1/3 distal vagina, tidak menyebar ke dinding pelvis
IIIB Tumor menyebar ke dinding pelvis dan/atau menyebabkan hydroneprosis atau tidak berfungsinya ginjal
IV Kanker sudah menyebar keluar rongga panggul dan secara klinik suadah terlihat tanda-tanda infeksi kanker ke selaput lendir kandung kencing dan/rectum
IVA Sel kanker menyebar pada alat/ organ yang dekat dengan serviks
IVB Kanker sudah menyebar pada alat/ organ yang jauh dari serviks
23
2.4.4 Prognosis kanker serviks
Prognosis kanker serviks adalah buruk. Prognosis yang buruk tersebut
dihubungkan dengan 85-90 % kanker serviks terdiagnosis pada stadium invasif,
stadium lanjut, bahkan stadium terminal (Suwiyoga, 2000). Selama ini, beberapa
cara dipakai menentukan faktor prognosis adalah berdasarkan klinis dan
histopatologis seperti keadaan umum, stadium, besar tumor primer, jenis sel,
derajat diferensiasi Broders. Prognosis kanker serviks tergantung dari stadium
penyakit. Umumnya, 5-years survival rate untuk stadium I lebih dari 90%, untuk
stadium II 60-80%, stadium III kira - kira 50%, dan untuk stadium IV kurang dari
30% (Geene dan Tidy,1998; Kenneth, 2000).
1. Stadium 0, 100 % penderita dalam stadium ini akan sembuh.
2. Stadium 1, Kanker serviks stadium I sering dibagi menjadi IA dan IB. Dari
semua wanita yang terdiagnosis pada stadium IA memiliki 5-years survival
rate sebesar 95%. Untuk stadium IB 5-years survival rate sebesar 70 sampai
90%. Ini tidak termasuk wanita dengan kanker pada limfonodi mereka.
3. Stadium 2, Kanker serviks stadium 2 dibagi menjadi 2, 2A dan 2B. Dari
semua wanita yang terdiagnosis pada stadium 2A memiliki 5-years survival
rate sebesar 70 - 90%. Untuk stadium 2B 5-years survival rate sebesar 60
sampai 65%.
4. Stadium 3, Pada stadium ini 5-years survival rate-nya sebesar 30 - 50%.
5. Stadium 4,Pada stadium ini 5-years survival rate-nya sebesar 20 - 30%.
24
2.4.5 Pencegahaan kanker serviks
Sel-sel yang abnormal dari kanker serviks dapat dideteksi dengan suatu
test yang disebut pap smear test. Pap Smear merupakan metode pemeriksaan
sel-sel yang diambil dari serviks dan kemudian diperiksa di bawah mikroskop untuk
melihat perubahan-perubahan yang terjadi dari sel tersebut (Riono, 1999).
Kanker serviks dapat dicegah dengan menghindari faktor-faktor resikonya.
Adapun faktor-faktor resiko yang dapat menyebabkan kanker serviks diantaranya
adalah berganti-ganti mitra seks, melakukan hubungan seks pertama saat usia di
bawah 15 tahun, merokok dan kurang terpenuhinya nutrisi seperti buah dan sayur
yang banyak mengandung antioksidan. Selain itu, penderita yang terinfeksi HIV
sering dihubungkan dengan meningkatnya resiko terjadinya karsinoma serviks
invasif karena adanya perubahan sistem imun (Rasjidi, 2007).
2.4.6 Pengobatan Kanker
Pengobatan kanker dapat dilakukan dengan cara pembedahan, radiasi,
kemoterapi, endokrinoterapi ataupun imunoterapi. Cara pembedahan, terutama
dilakukan untuk tumor padat yang terlokalisasi. Cara radiasi digunakan sebagai
pengobatan penunjang sesudah pembedahan. Pemberian kemoterapi terutama
untuk pengobatan tumor yang tidak terlokalisasi seperti leukemia.
Endokrinoterapi merupakan bagian dari kemoterapi, yaitu penggunaan hormon
tertentu untuk pengobatan tumor pada organ yang poliferasinya tergantung
hormon, seperti pada karsinoma payudara dan prostat. Sedangkan cara
imunoterapi masih dalam penelitian dan masa mendatang kemungkinan berperan
25
2.5 Kultur Sel
Kultur sel berasal dari organ atau jaringan yang telah diuraikan secara
mekanis dan atau secara enzimatis menjadi suspensi sel. Suspensi sel tersebut
kemudian dibiakkan menjadi satu lapisan jaringan (monolayer) di atas permukaan
yang keras (botol, tabung dan cawan) atau menjadi suspensi sel dalam media
penumbuh. Monolayer tersebut dapat diperbanyak lagi, disebut subkultur atau
pasase. Apabila diperbanyak terus menerus maka dihasilkan sel lestari (cell line).
Sel lestari memiliki beberapa sifat yaitu:
a. Terjadi peningkatan jumlah sel
b. Memiliki daya tumbuh yang tinggi
c. Seragam
d. Mengalami perubahan fenotipe atau transformasi (Malole, 1990).
2.5.1 HeLa cell line
Sel HeLa merupakan continous cell line yang terinfeksi oleh Human
Papiloma Virus (HPV) yang memiliki gen p53 dan p105Rb dalam bentuk wild
type. Protein E6 dan E7 yang berasal dari HPV memodulasi sejumlah protein
seluler yang berperan dalam apoptosis dan proliferasi sel. Aktivitas proliferasi
yang berlebihan pada sel HeLa diakibatkan oleh ikatan antara protein E6 yang
berikatan dengan gen p53 sehingga mempercepat degradasi p53 dan stimulasi
aktivitas enzim telomerase. Protein E7 berperan dalam meningkatkan aktivitas
proliferasi sel melalui hiperfosforilasi p105Rb (Malole, 1990).
HeLa cell line diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim serviks)
manusia. Sel ini diisolasi tahun 1915 dari rahim wanita penderita kanker leher
26
x
sebagai sel yang semi melekat (ATTC, 2011). HeLa cell line dapat digunakan
untuk tes antitumor, transformasi, uji tumorigenesis, biologi sel dan invasi bakteri.
Sel ini secara morfologi merupakan sel epitelial yang sudah dimasuki oleh Human
Papiloma Virus (HPV) tipe 18. Sel ini bersifat immortal dan sangat agresif
sehingga mudah untuk dikultivasi tetapi sel ini mudah menginvasi kultur sel lain
(Doyle, dkk., 2000).
2.6 Uji Sitotoksik
Uji sitotoksisitas adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan
kultur sel yang digunakan untuk mendeteksi adanya aktivitas antineoplastik dari
suatu senyawa. Senyawa sitotoksik adalah senyawa yang bersifat toksik pada sel
tumor secara in vitro dan jika toksisitas ini ditransfer menembus sel tumor in vivo
senyawa tersebut mempunyai aktivitas antitumor (Freshney, 2000).
Metode in vitro memberikan berbagai keuntungan, seperti: hanya
membutuhkan sejumlah kecil bahan yang digunakan untuk kultur sel primer
manusia dari berbagai organ target (ginjal, liver dan kulit), memberikan informasi
secara langsung efek potensial pada sel target manusia dan dapat digunakan
sangat sensitif dan dampak yang ditimbulkan dapat dilihat langsung (Doyle, dkk.,
2000).
a. Perhitungan secara langsung (metode haemocytometer)
Haemocytometer merupakan perangkat gelas bersama cover slip tipis,
terbagi dalam sembilan area dengan empat area pojok sebagai area menghitung
jumlah sel. Ketebalan chamber adalah 0,1 mmdengan kapasitas 10 μL cairan berisi sel dalam area 0,9 mm3. Beberapa hal perlu diperhatikan saat menghitung
27
minimum yang dihitung adalah seratus. Sel yang melekat perlu ditripsinasi untuk
mensuspensikan sel dalam larutan. Tripan blue biasa digunakan untuk
membedakan sel hidup dan sel mati. Sel hidup tidak terwarnai, bulat dan relatif
kecil dibandingkan dengan sel mati. Sedangkan sel mati membengkak dan
berwarna biru (Doyle, dkk., 2000).
b. Perhitungan secara tidak langsung dengan metode MTT
MTT assay dapat digunakan untuk mengukur proliferasi selsecara
kolorimetri. Metode ini berdasarkan pada perubahan garam tetrazolium
(3-(4,5-dimet iltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida) (MTT) menjadi formazan
dalam mitokondria yang aktif pada sel hidup. MTT diabsorbsi ke dalam sel hidup
dan dipecah melalui reaksi reduksi oleh enzim reduktase dalam rantai respirasi
mitokondria menjadi formazan yang terlarut dalam SDS 10% berwarna ungu
(Doyle, dkk., 2000). Warna ungu formazan dapat dibaca absorbansinya secara
spektrofotometri dengan ELISA reader pada panjang gelombang maksimumnya
552 - 554 nm. Absorbansi tersebut menggambarkan jumlah sel hidup. Semakin
kuat intensitas warna ungu yang terbentuk, absorbansi akan semakin tinggi, hal ini
menunjukkan bahwa semakin banyak MTT yang diabsorbsi ke dalam sel hidup
dan dipecah melalui reaksi reduksi oleh enzim reduktase dalam rantai respirasi
mitokondria sehingga formazan yang terbentuk juga semakin banyak, absorbansi
ini yang akan digunakan untuk menghitung persentase sel hidup sebagai respon
(Sieuwerts, dkk., 1995). Berikut ini gambar reaksi reduksi MTT menjadi
28
29
BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental untuk mengetahui apakah
Ekstrak EtanolBuah Andaliman (EEBA) memiliki efek antikanker terhadap sel
HeLa dan sel Vero. Tahap penelitian meliputi identifikasi bahan, pengumpulan
dan pengolahan bahan, pembuatan pereaksi, karakterisasi simplisia, skrining
fitokimia simplisia dan ekstrak, pembuatan ekstrak etanol, pengujian efek
sitotoksik EEBA terhadap sel HeLa dan sel Vero dan penentuan indeks
selektivitas.
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Agustus 2014 - Oktober 2014.
Pemeriksaan karakterisasi, skrining fitokimia dan pembuatan ekstrak etanol buah
andaliman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi Universitas
Sumatera Utara. Pengujian sitotoksik terhadap sel kanker serviks dilakukan di
Laboratorium Parasitologi Universitas Gadjah Mada.
3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas,
autoclave (Hirayama),blender (Philips), conical tube, eksikator, ELISA reader
(BenMark Biorad), inkubator CO25% (Heraceus), inverted microscope
(Olympus), krus porselin, optilab, laminar air flow (Labconco), mikropipet, tissue
culture flask (wadah kultur), hemositometer, hand counter, neraca kasar (Home
30
evaporator (Haake D1), sentrifugator, seperangkat alat destilasi, cawan porselen
alas rata, krus porselen bertutup, desikator, tanur, vortex dan 96-well plate.
3.2.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah buah andaliman.
Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas pro
analisis, yaitu: α-naftol, asam asetat anhidrida, asam asetat pekat, asam klorida pekat, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzena, besi (III) klorida,
kloralhidrat, bismut (III) nitrat, etanol 96%, eter, etilasetat, n-heksana, hepes
(Sigma), iodium, isopropanol, kalium iodida, kloroform, metanol, natrium
hidroksida, natrium sulfat anhidrat, petroleum eter, raksa (II) klorida, serbuk
magnesium, serbuk zinkum, natrium hidrogen sulfat (Macalai tesque), timbal (II)
asetat, toluena, air suling, dimetil sulfoksida (DMSO) (Sigma). Sel kanker serviks
HeLa dan Vero yang merupakan koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas
Kedokteran UGM, Media Roswell Park Memorial Institute (RPMI), media
M-199, Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penicillin -streptomisin 2%
(v/v) (Gibco), dan Fungizon (Amfoterisin B) 0,5%. Selain bahan-bahan di atas
juga digunakan 0,25% tripsin – EDTA (Gibco), Fetal Bovine Serum (FBS) 10%
(v/v) (Gibco), Phospate Buffer Saline (PBS), MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5
difeniltetrazolium bromida] (Sigma), dengan konsentrasi 5 mg/mL, natrium
dodesil sulfat (SDS) dalam HCl 0,1 N.
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan 3.3.1 Pengambilan bahan
Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif, yaitu tanpa
31
dalam penelitian ini adalah buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
yang diperoleh dari Pasar Sore, Jalan Jamin Ginting kelurahan Padang Bulan Kota
Medan, Propinsi Sumatera Utara bulan Agustus 2014.
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi buah andaliman dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang
Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI.
3.3.3 Pembuatan simplisia
Buah andaliman yang telah dikumpulkan dicuci bersih dengan air
mengalir, ditiriskan kemudian ditimbang sebagai berat basah. Bahan ini kemudian
dikeringkan di lemari pengering hingga kering, kemudian ditimbang sebagai berat
kering. Bahan kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender. Simplisia
dimasukkan dalam wadah plastik dan diikat, diberi etiket lalu disimpan pada
tempat yang terlindung dari cahaya matahari.
3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling
secukupnya, kemudian sebanyak 2 g iodium dilarutkan dalam larutan kalium
iodida, setelah larut dicukupkan volume dengan air suling hingga 100 mL
(Depkes RI, 1995).
3.4.2 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 g bismut (III) nitrat dilarutkan dalam 20 mL asam nitrat pekat.
Pada wadah lain sebanyak 27,2 g kalium iodida dilarutkan dalam 50 ml air suling,
32
Selanjutnya diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air suling hingga 100
mL (Depkes RI, 1995).
3.4.3 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,3596 g raksa (II) klorida ditimbang, kemudian dilarutkan
dalam air suling hingga 60 mL. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium
iodida lalu dilarutkan dalam 10 mL air suling. Kemudian keduanya dicampur dan
ditambahkan air suling hingga 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.4 Pereaksi besi (III) klorida 1%
Sebanyak 1 g besi (III) klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air
hingga 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.5 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.6 Pereaksi timbal (II) asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal (II) asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam
air suling bebas CO2 hingga 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.7 Pereaksi asam klorida 1 N
Sebanyak 8,5 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga
100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.8 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 mL asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga
33
3.4.9 Pereaksi natrium hidroksida 1 N
Sebanyak 4,001 g kristal natrium hidroksida ditimbang, kemudian
dilarutkan dalam air suling hingga 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.10 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g kristal natrium hidroksida ditimbang, kemudian
dilarutkan dalam air suling hingga 100 mL (Depkes RI, 1995).
3.4.11 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 mL
air suling (Depkes RI, 1995).
3.4.12 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 mL asam sulfat pekat dicampur dengan 50 mL etanol 96%,
kemudiandengan hati-hati 5 mL asam asetat anhidrida dimasukkan ke dalam
campuran tersebut dan dinginkan (Depkes RI, 1995).
3.5 Skrining Fitokimia Serbuk Simplisia dan Ekstrak
Skrining fitokimia serbuk simplisia dan ekstrak meliputi pemeriksaan
senyawa golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, glikosida antrakinon, saponin,
tanindan steroid/triterpenoid.
3.5.1 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia dan ekstrak ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian
ditambahkan 1 Ml asam klorida 2 N dan 9 mL air suling, dipanaskan di atas
penangas air selama 2 menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk
percobaan berikut:
a. 3 tetes larutan filtrat ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Mayer akan
