68
Lampiran 1. Hasil Identifikasi Tumbuhan Andaliman
69
Lampiran 2. Gambar Makroskopik Simplisia Buah Andaliman
Simplisia buah andaliman
70
Lampiran 3. Gambar Mikroskopik Simplisia Buah Andaliman
Keterangan:
1. Kelenjar minyak berwarna kuning kemerahan 2. Sel rambut yang kolaps
3. Sel rambut penutup
4. Epidermis kulit biji berwarna jingga kemerahan
1 2
71
Lampiran 4. Bagan Kerja Penelitian
dicuci dari pengotor sampai bersih ditiriskan
ditimbang berat basahnya
dikeringkan
ditimbang berat keringnya
dihaluskan dengan blender
di maserasi dengan etanol 96% diuapkan dengan rotary evaporator dilakukan uji sitotoksik Buah Andaliman Buah Andaliman Serbuk Simplisia
Karakterisasi Simplisia Skrining Fitokimia
Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan mikroskopik
Penetapan kadar air
Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Penetapan kadar abu total
Penetapan kadar abu yang tidak larut asam
Pemeriksaan alkaloida Pemeriksaan glikosida antrakinon Pemeriksaan saponin Pemeriksaan tannin Pemeriksaan steroid/triterpenoid Pemeriksaan glikosida
Ekstraksi secara maserasi
Maserat
Ekstrak Kental
72
Lampiran 5. Perhitungan Kadar Air Simplisia Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No. Berat sampel (g) Volume awal (mL) Volume akhir (mL)
1. 5,009 1,80 2,10
2. 5,019 2,10 2,45
3. 5,012 2,45 2,75
% Kadar air = x100%
sampel Berat awal Volume akhir Volume −
1. Kadar air = x100% 5,98% 5,009
1,80 -2,10
=
2. Kadar air = x100% 6,97% 5,019
2,10 -2,45
=
3. Kadar air = x100% 5,98% 5,012
2,45 -2,75
=
% Rata-rata kadar air = 6,30%
73
Lampiran 6. Perhitungan Kadar Sari Larut dalam Air Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) No. Berat Sampel (g) Berat Sari (g)
1. 5,032 0,135
2. 5,019 0,120
3. 5,002 0,119
% Kadar sari larut dalam air = x100%
20 100 x (g) sampel Berat (g) sari Berat
1. Kadar sari larut dalam air = x100% 13,41% 20 100 x 5,032 0,135 =
2. Kadar sari larut dalam air = x100% 11,95% 20 100 x 5,019 0,120 =
3. Kadar sari larut dalam air = x100% 11,89% 20 100 x 5,002 0,119 =
74
Lampiran 7. Perhitungan Kadar Sari Larut dalam Etanol Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No. Berat sampel (g) Berat sari (g)
1. 5,015 0,160
2. 5,021 0,173
3. 5,012 0,157
% Kadar sari larut dalam etanol = x100%
20 100 x (g) Sampel Berat (g) Sari Berat
1. Kadar sari larut dalam etanol = x100% 15,95% 20 100 x 5,015 0,160 =
2. Kadar sari larut dalam etanol = x 100% 17,22% 20 100 x 5,021 0,173 =
3. Kadar sari larut dalam etanol = x100% 15,66% 20 100 x 5,012 0.157 =
% Rata-rata kadar sari larut dalam etanol =
3
15,66% 17,22%
15,95%+ +
75
Lampiran 8. Perhitungan Kadar Abu Total Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) No. Berat Sampel (g) Berat Abu (g)
1. 2,0001 0,0929
2. 2,0009 0,0932
3. 2,0010 0,0920
% Kadar abu total = x100%
(g) Sampel Berat
(g) Abu Berat
1. Kadar abu total = x100% 4,64% 2,0001
0,0929
=
2. Kadar abu total = x 100% 4,65% 2,0009
0,0932
=
3. Kadar abu total = x 100% 4.59% 2,0010
0,0920
=
% Rata-rata kadar abu total = 4,62%
3
4,59% 4,65%
4,64%
= +
76
Lampiran 9. Perhitungan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) No. Berat Sampel (g) Berat Abu (g)
1. 2,0001 0,0042
2. 2,0009 0,0048
3. 2,0010 0,0039
% Kadar abu tidak larut dalam asam = x100% (g) Sampel Berat (g) Abu Berat
1. Kadar abu tidak larut dalam asam = x100% 0,20% 2,0001
0,0042
=
2. Kadar abu tidak larut dalam asam = x100% 0,23% 2,0009
0,0048
=
3. Kadar abu tidak larut dalam asam = x100% 0,19% 2,0010
0,0039
=
% Rata-rata kadar abu tidak larut dalam asam =
3 % 19 , 0 % 23 , 0 % 20 ,
0 + +
77
Lampiran 10. Rendemen Ekstrak Etanol Buah Andaliman
Berat simplisia kering = 860 g Berat ekstrak = 54,573 g
Rendemen = Berat Ekstrak
Berat Simplisia keringx 100 % = 54,573
78
Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sel HeLa Pada Hemositometer
Jumlah sel HeLa total (A + B + C + D) = 219 sel Jumlah sel/mL
∑sel/mL=∑ sel A+ ∑ sel B+∑ sel C + ∑ sel D
4 ×10
4
∑sel/mL =219 4 ×10
4 :
= 54,75 x 104 sel/mL
Volume Panenan Sel
Volume panenan sel =Jumlah total sel yang diperlukan Jumlah sel terhitung/mL :
Volume panenan sel HeLa = 1×10 6
54,75×104
79
Lampiran 12. Perhitungan Jumlah Sel Vero Pada Hemositometer
Jumlah Sel Vero total (A + B + C + D) = 357 sel Jumlah sel/mL
∑sel/mL=∑ sel A+ ∑ sel B+∑ sel C + ∑ sel D
4 ×10
4 :
∑���/�� =���
� ���
= 89,25 x 104 sel/mL
Volume Panenan Sel Vero :
Volume panenan sel =Jumlah total sel yang diperlukan Jumlah sel terhitung/mL
Volume panenan sel= 1×10 6
89,25×104
80
Lampiran 13. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan
Uji Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) terhadap Sel HeLa
No. Absorbansi Kontrol Sel (a)
Absorbansi kontrol Media (b)
1 0,678 0,078
2 0,678 0,080
3 0,679 0,108
Rata-Rata 0,675 0,089
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
% Hidup = Absorbansi sel dengan perlakuan –Absorbansi kontrol media
Absorbansi kontrol media sel –Absorbansi kontrol media x 100 %
Kadar Absorbansi (c)
Rata-Rata (c)
c-b a-b % Sel Hidup
% Sel Mati
1 2 3
81
Lampiran 14. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan
Uji Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) terhadap Sel Vero
No. Absorbansi Kontrol Sel (a)
Absorbansi kontrol Media (b)
1 0,844 0,062
2 0,895 0,058
3 0,819 0,054
Rata-Rata 0,853 0,058
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
% Hidup = Absorbansi sel dengan perlakuan –Absorbansi kontrol media
Absorbansi kontrol media sel –Absorbansi kontrol media x 100 %
Kadar Absorbansi
Rata-Rata (c)
c –b a -b % Sel Hidup
% Sel Mati
1 2 3
82
Lampiran 15. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.) Sel HeLa menggunakan analisa Probit SPSS 19
Confidence Limits
Probability
95% Confidence Limits for % hambat
95% Confidence Limits for log (% hambat)b
Estimate Lower
Bound Upper Bound Estimate
Lower Bound
Upper Bound
LOGITa .010 205.322 . . 2.312 . .
.020 161.316 . . 2.208 . .
.030 139.881 . . 2.146 . .
.040 126.288 . . 2.101 . .
.050 116.565 . . 2.067 . .
.060 109.102 . . 2.038 . .
.070 103.105 . . 2.013 . .
.080 98.125 . . 1.992 . .
.090 93.888 . . 1.973 . .
.100 90.213 . . 1.955 . .
.150 76.977 . . 1.886 . .
.200 68.310 . . 1.834 . .
.250 61.892 . . 1.792 . .
.300 56.781 . . 1.754 . .
.350 52.505 . . 1.720 . .
.400 48.797 . . 1.688 . .
.450 45.487 . . 1.658 . .
.500 42.462 . . 1.628 . .
.550 39.637 . . 1.598 . .
.600 36.949 . . 1.568 . .
.650 34.339 . . 1.536 . .
.700 31.753 . . 1.502 . .
.750 29.131 . . 1.464 . .
.800 26.394 . . 1.422 . .
.850 23.422 . . 1.370 . .
.900 19.986 . . 1.301 . .
.910 19.204 . . 1.283 . .
.920 18.374 . . 1.264 . .
.930 17.487 . . 1.243 . .
.940 16.526 . . 1.218 . .
.950 15.468 . . 1.189 . .
.960 14.277 . . 1.155 . .
.970 12.889 . . 1.110 . .
.980 11.177 . . 1.048 . .
.990 8.781 . . .944 . .
83
Lampiran 16. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Sel Vero menggunakan analisa Probit SPSS 19
Confidence Limits
Probability
95% Confidence Limits for % hambat
95% Confidence Limits for log(% hambat)b
Estimate
Lower
Bound Upper Bound Estimate
Lower Bound
Upper Bound
LOGITa .010 6665.759 1518.945 4092413.680 3.824 3.182 6.612
.020 4554.061 1190.006 1428220.379 3.658 3.076 6.155 .030 3576.232 1017.704 733508.110 3.553 3.008 5.865 .040 2981.662 903.815 444785.052 3.474 2.956 5.648 .050 2571.726 820.007 296324.379 3.410 2.914 5.472 .060 2267.523 754.340 209853.642 3.356 2.878 5.322 .070 2030.552 700.714 155155.999 3.308 2.846 5.191 .080 1839.466 655.612 118456.436 3.265 2.817 5.074 .090 1681.340 616.836 92717.393 3.226 2.790 4.967 .100 1547.828 582.920 74030.411 3.190 2.766 4.869 .150 1098.882 458.692 29315.309 3.041 2.662 4.467 .200 836.974 375.820 14163.256 2.923 2.575 4.151 .250 662.634 313.796 7659.651 2.821 2.497 3.884 .300 537.253 263.977 4458.745 2.730 2.422 3.649 .350 442.350 221.922 2736.813 2.646 2.346 3.437 .400 367.846 185.072 1751.676 2.566 2.267 3.243 .450 307.729 151.896 1162.669 2.488 2.182 3.065 .500 258.167 121.581 798.957 2.412 2.085 2.903 .550 216.587 93.956 568.665 2.336 1.973 2.755 .600 181.190 69.404 419.375 2.258 1.841 2.623 .650 150.673 48.592 319.723 2.178 1.687 2.505 .700 124.057 32.011 250.443 2.094 1.505 2.399 .750 100.583 19.661 199.676 2.003 1.294 2.300 .800 79.632 11.069 160.151 1.901 1.044 2.205 .850 60.653 5.513 127.292 1.783 .741 2.105 .900 43.060 2.235 97.830 1.634 .349 1.990 .910 39.641 1.792 92.069 1.598 .253 1.964 .920 36.233 1.408 86.278 1.559 .149 1.936 .930 32.824 1.079 80.412 1.516 .033 1.905 .940 29.393 .801 74.412 1.468 -.096 1.872 .950 25.916 .569 68.197 1.414 -.245 1.834 .960 22.353 .381 61.641 1.349 -.419 1.790 .970 18.637 .232 54.533 1.270 -.635 1.737 .980 14.635 .120 46.446 1.165 -.923 1.667 .990 9.999 .042 36.214 1.000 -1.378 1.559 a. A heterogenity factor is used.
84
Lampiran 17. Bagan Kerja Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Andaliman
dicuci dari pengotor sampai bersih ditiriskan
ditimbang berat basahnya
dikeringkan
ditimbang berat keringnya
dihaluskan dengan blender disimpan dalam wadah yang tertutup rapat sebelum digunakan
dimasukkan ke dalam wadah ditambahkan 2250 mL etanol 96% hingga serbuk terendam
dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil sesekali diaduk disaring
dicuci dengan etanol 96% secukupnya hingga diperoleh 3000 mL
dibiarkan selama 2 hari terlindung dari cahaya dienaptuangkan, disaring
dipekatkan dengan rotary evaporator pada temperatur tidak lebih dari 50oC
Buah Andaliman
Simplisia
300 g serbuk simplisia
Ampas Maserat I
Maserat II
Ekstrak kental Etanol Buah Andaliman Maserat I +II
85
Lampiran 18. Bagan Pembuatan Media RPMI
dimasukkan kedalam erlenmeyer ditambahkan 800 mL aquabides steril dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet
diatur pH 7,2 - 7,4 (HCl 1 N atau NaOH 1 N)
ditambahkan aquabides steril samapai 1 L dilakukan sterilisasi dengan filter vacum ditampung dalam botol steril
diberi identitas pada botol media disimpan pada suhu 2 - 80 C
RPMI Sachet 2 g Hepes 2 g NaHCO3
86
Lampiran 19. Bagan Pembuatan Media M199
dimasukkan kedalam erlenmeyer ditambahkan 800 mL aquabides steril dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet
diatur pH 7,2 - 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N)
ditambahkan aquabides steril samapai 1 L dilakukan sterilisasi dengan filter vaccum ditampung dalam botol steril
diberi identitas pada botol media disimpan pada suhu 2 - 80 C
M199 Sachet 2 g Hepes 2,2 g NaHCO3
87
Lampiran 20. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK-RPMI) dan
(MK-M199)
Media Kultur Lengkap (MK-RPMI)
dicampur
diberi identitas pada botol MK-RPMI disimpan pada suhu 2 - 80C
Media Kultur Lengkap (MK-M199)
dicampur
diberi identitas pada botol MK-M199 disimpan pada suhu 2 - 80C
Fetal Bovine Serum (FBS) (10%) Penisilin- Streptomisin (1%) Fungizon (amfoterisin B) (0,5%) RPMI ad 100%
Media Kultur Lengkap (MK-RPMI) Fetal Bovine Serum (FBS) (10%) Penisilin- Streptomisin (1%) Fungizon (amfoterisin B) (0,5%) M199 ad 100%
88
Lampiran 21. Bagan Penumbuhan Sel HeLa
diambil dari tangki nitrogen atau freezer diambil beberapa tetes
dimasukkan kedalam konikel yg berisi MK-RPMI
disentrifuge 600 rpm selama 5 menit dibuang supernatan
ditambahkan 4 mL MK-RPMI di resuspensi hingga homogen dimasukkan ke dalam flask
ditambahkan 5 mL MK-RPMI kedalam setiap flask
dihomogenkan
diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted diberi identitas pada flask
disimpan dalam inkubator CO2 5% Sel HeLa
89
Lampiran 22. Bagan Penumbuhan Sel Vero
diambil dari tangki nitrogen atau freezer diambil beberapa tetes
dimasukkan kedalam konikel yg berisi MK-M199
disentrifuge 600 rpm selama 5 menit dibuang supernatan
ditambahkan 4 mL MK-M199 di resuspensi hingga homogen dimasukkan ke dalam flask
ditambahkan 5 mL MK-M199 kedalam setiap flask
dihomogenkan
diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted diberi identitas pada flask
disimpan dalam inkubator CO2 5% Sel Vero
90
Lampiran 23. Bagan Panen Sel HeLa
dipersiapkan dan dikondisikan
diamati apakah sel telah konfluen 80%
dibuang MK-RPMI dari flask dengan mikropipet dicuci sel 2x dengan PBS
ditambahkan 400 µ L tripsin-EDTA 0,25%
diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 5 menit ditambahkan 4 mL MK-RPMI
di resuspensi dengan mikropipet
diamati sel dibawah mikroskop inverted
di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol ditransfer sel kedalam tabung konikel
Sel HeLa, alat dan bahan
91
Lampiran 24. Bagan Panen Sel Vero
dipersiapkan dan dikondisikan
diamati apakah sel telah konfluen 80%
dibuang MK-M199 dari flask dengan mikropipet dicuci sel 2x dengan PBS
ditambahkan 400 µ L tripsin-EDTA 0,25%
diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 5 menit ditambahkan 4 mL MK-M199
di resuspensi dengan mikropipet
diamati sel dibawah mikroskop inverted
di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol ditransfer sel kedalam tabung konikel
Sel Vero, alatdan bahan
92
Lampiran 25. Bagan Penghitungan SelHeLa dan Sel Vero
diambil 10 µL panenan sel
dipipetkan kedalam hemositometer dihitung jumlah sel dibawah mikroskop Kultur Sel HeLa dan Sel Vero
93
Lampiran 26. Bagan Pembuatan Larutan Uji
ditimbang sebanyak 50 mg dimasukkan ke dalam polytube dilarutkan dalam 500 µ L DMSO di vortex
dibuat pengenceran sampai diperoleh
konsentrasi 1000µg/mL; 500 µg/mL; 250 µ g/mL; 125 µg/mL;62,5 µ g/mL;31,25 µg/mL dan 15,625 µg/mL
Ekstrak Etanol
94
Lampiran 27. Bagan Pengujian Sitotoksik
ditanam pada microplate 96 sumuran dengan kepadatan 1 x 104
diinkubasi selama 24 jam dibuang medium
ditambahkan medium baru ditambahkan larutan uji diinkubasi selama 24 jam
dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam dicuci dengan PBS
ditambahkan 100 µ L MK dan 10 µ L MTT (5 mg/mL) diinkubasi selama 4-6 jam
ditambahkan SDS (sebagai stopper) dibungkus dengan aluminium foil dibiarkan selama 1 malam
dibaca serapan dengan ELISA reader pada λ 595 nm
dihitung % sel hidup
dihitung IC50 dengan analisa probit menggunakan SPSS 19
Sel HeLa dan Sel Vero
Absorbansi
95
Lampiran 28. Gambar Sel HeLa dan Sel Vero yang telah konfluen (dilihat di
bawah mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10)
Sel HeLa
96
Lampiran 29. Gambar Sel HeLa dan Sel Vero dalam kamar hitung (dilihat di
bawah mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10)
Sel HeLa
97
Lampiran 30. Gambar morfologi sel kanker serviks HeLa dan Vero (dilihat
dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10) setelah pemberian ekstrak dari konsentrasi tertinggi hingga terendah Morfologi sel kanker serviks HeLa (dilihat dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10)
Konsentrasi ekstrak 500 µg/mL Konsentrasi ekstrak 250 µ g/mL
Morfologi sel kanker serviks Vero (dilihat dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10)
98
Lampiran 31. Gambar Laminar air flow, Mikroskop Inverted, ELISA Reader
dan Inkubator CO2 5%
Laminar air flow Mikroskop Inverted
