DAN TRIS-SOYA DENGAN MODIFIKASI KARBOHIDRAT
DAN KRIOPROTEKTAN BERBEDA
ORIZA SAVITRI ARIANTIE
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
DAN TRIS-SOYA DENGAN MODIFIKASI KARBOHIDRAT
DAN KRIOPROTEKTAN BERBEDA
ORIZA SAVITRI ARIANTIE
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Biologi Reproduksi
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Penguji pada Ujian Tesis: Prof Dr Dra Raden Iis Arifiantini, MSi
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Kriopreservasi Semen Kambing Peranakan Etawah (PE) Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur dan Tris-soya dengan Modifikasi Karbohidrat dan Krioprotektan Berbeda adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2013
ORIZA SAVITRI ARIANTIE. Kriopreservasi Semen Kambing Peranakan Etawah (PE) Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur dan Tris-soya dengan Modifikasi Karbohidrat dan Krioprotektan Berbeda. Dibimbing oleh TUTY LASWARDI YUSUF dan DONDIN SAJUTHI.
Salah satu upaya perbaikan mutu genetik ternak kambing di Indonesia dilakukan melalui pemanfaatan teknologi Inseminasi Buatan (IB). Teknologi IB pada ternak kambing masih kurang diaplikasikan secara luas. Hal ini terkait berbagai kendala, salah satunya adalah kualitas semen beku yang dihasilkan. Kualitas semen beku ditentukan oleh berbagai faktor diantaranya teknik pembekuan, jenis pengencer, jenis dan konsentrasi krioprotektan yang digunakan. Saat ini semen kambing telah diproduksi oleh beberapa balai inseminasi buatan menggunakan pengencer Tris-kuning telur (TKT). Asal kuning telur diketahui adalah dari hewan yang memungkinkan dapat menstransfer bibit penyakit yang dapat memengaruhi kualitas spermatozoa. Oleh karena itu dicari alternatif pengganti kuning telur, yakni soya yang berasal dari tumbuhan. Untuk preservasi semen kambing, informasi mengenai pengencer yang mengandung ekstrak kacang kedelai belum banyak diketahui. Penggunaan disakarida (trehalosa) dan trisakarida (rafinosa) pada pengencer semen beberapa ternak diduga lebih mampu melindungi spermatozoa dalam proses pembekuan. Selain itu penambahan krioprotektan dimethilformamida (DMF) dapat digunakan sebagai krioprotektan alternatif dalam pembekuan semen kambing. Akan tetapi, mekanisme DMF untuk pembekuan semen kambing belum banyak dilaporkan. Penelitian ini dilaksanakan dua tahap: 1) preservasi semen cair mengunakan pengencer tris-kuning telur (TKT) dan tris-soya (TS) dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa dan 2) kriopreservasi semen menggunakan pengencer kuning telur dan tris-soya dengan suplementasi karbohidrat terbaik dengan tambahan krioprotektan DMF dan gliserol.
Semen dikoleksi dari tiga ekor kambing jantan dewasa menggunakan vagina buatan. Semen dievaluasi dan dibagi dalam enam bagian. Kemudian diencerkan dengan menggunakan pengencer TKT dan TS dengan suplementasi 50 mM trehalosa dan rafinosa, dengan dosis inseminasi 50x106 per 0.2 ml. Semen cair disimpan dalam lemari es (5°C). Evaluasi motilitas progresif, spermatozoa hidup dan membran plasma utuh (MPU) dari spermatozoa dilakukan setiap 12 jam hingga motilitas 50%. Pengencer TKT dan TS dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa sebagai dasar dari penelitian semen cair ditambah dengan DMF dan gliserol sebanyak 4% (v/v). Kemudian dikemas dengan straw minitub dengan konsentrasi 100x106 per 0.25 mL spermatozoa. Semen diekuilibrasi pada suhu 5°C (4 jam), kemudian dibekukan dalam uap nitrogen (N2) cair selama 10 menit,
dan disimpan dalam kontainer N2 cair (-196°C) sampai dievaluasi. Kualitas semen
memiliki konsentrasi 3608.33±657.70x106/mL, persentase motilitas 77.78±2.56%, spermatozoa hidup 85.13±4.38%, MPU 77.72±3.52% dengan abnormalitas spermatozoa 7.51±2.88%.
Secara umum motilitas spermatozoa lebih lama bertahan dalam pengencer TKT dibandingkan dengan TS. Motilitas spermatozoa dalam pengencer TKT dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa dapat bertahan sampai 50% selama 72-84 jam, dibandingkan TS bertahan selama 48-60 jam (P<0.05). Pengencer terbaik ditunjukkan oleh TKT dengan suplementasi trehalosa (52.82±3.21%) bertahan sampai 84 jam dibandingkan dengan rafinosa (52.78±4.41%) dan kontrol (51.78±4.86%) sampai 72 jam. Sebaliknya dalam TS yang disuplementasi dengan rafinosa 52.78±4.41% bertahan sampai 60 jam dibandingkan dengan trehalosa (53.33±3.54%) dan kontrol (51.11±4.86%) sampai 48 jam. Pada semua pengencer spermatozoa hidup lebih tinggi 6-9% daripada persentase motilitas spermatozoa, sedangkan persentase MPU nilainya hampir sama dengan motilitas spermatozoa.
Kualitas semen setelah pengenceran dari berbagai macam perlakuan cenderung sama dengan kualitas semen segar. Akan tetapi, kualitas semen setelah pengenceran sampai proses ekuilibrasi (4 jam) mengalami sedikit penurunan yaitu 1.69% - 2.24% namun tidak terdapat adanya perbedaan antar perlakuan (P>0.05). Kualitas semen setelah thawing pada pengencer TKT trehalosa dengan penambahan gliserol dan DMF menurun sebanyak 11.60% dan 15.00% lebih baik dibandingkan dengan TS rafinosa dengan krioprotektan yang sama penurunannya sebanyak 34.45% dan 37.60% (P<0.05) dan terdapat perbedaan antar perlakuan TKT trehalosa dan TS rafinosa baik dengan penambahan gliserol maupun DMF (P<0.05). Kualitas semen setelah thawing pada penelitian cukup tinggi. Motilitas spermatozoa pada pengencer TKT trehalosa dengan penambahan gliserol menunjukkan peranan yang lebih baik (65.07±5.38%) dengan nilai RR (83.65%) yang lebih tinggi dibandingkan dengan TKT trehalosa DMF (61.67±5.55%) dengan nilai RR (79.29%) (P>0.05). Sedangkan dalam pengencer TS rafinosa, penambahan DMF lebih memperkuat daya kerja TS rafinosa dengan persentase motilitas spermatozoa (42.22±8.13%) dengan nilai RR (54.28%) yang lebih tinggi dibandingkan dengan gliserol (39.07±5.38%) dengan nilai RR sebesar 50.23% (P>0.05). Secara umum rataan persentase motilitas spermatozoa dengan penambahan krioprotektan gliserol maupun DMF pada pengencer TKT trehalosa (63.37%) dengan rataan RR (81.47%) lebih unggul dibandingkan dengan rataan TS rafinosa (40.65%) dengan rataan RR (52.26%) (P<0.05).
Kesimpulan dari penelitian ini adalah pengencer TS dapat digunakan sebagai pengencer semen cair kambing dan suplementasi rafinosa memperpanjang daya hidup spermatozoa dalam TS sampai 60 jam, sedangkan suplementasi trehalosa memperpanjang daya hidup spermatozoa dalam TKT sampai 84 jam. Pengencer TKT trehalosa dengan penambahan gliserol menunjukkan peranan yang lebih baik dalam melindungi kualitas spermatozoa pada saat pembekuan dibandingkan dengan pengencer TS rafinosa dengan penambahan DMF.
ORIZA SAVITRI ARIANTIE. Cryopreservation of Buck Etawah Crossbreed Semen Using Tris-egg yolk and Tris-soya Diluents with Carbohydrate Modified and Different Cryoprotectant. Supervised by TUTY LASWARDI YUSUF and DONDIN SAJUTHI.
Artificial Insemination (AI) is known as a technology to improve the genetic quality of goats in Indonesia. AI in goat is still limited in its practical use; this is related to a variety of constraints, which one of those would be the guarded quality of frozen semen. The quality of frozen semen is determined by various factors, including the freezing techniques, the diluents and cryoprotectants. Buck frozen semen produced by AI centers usually use Tris-egg yolk (TEY) diluent. Egg yolk of animal origin has been recognized as a highly potential media allowing transfer microorganism to female tract through AI. Therefore, some research studies have been focusing to find another diluents using soy extract as an alternative of diluent. Preservation of buck semen using soy extract contains plant phospolipid has not been well studied. Dissacharide (trehalose) or trissacharide (raffinose) acts as an energy source as well as an extracellular cryoprotectants in diluents of frozen semen; these would aid in protecting the sperm during freezing process. Dimethylformamide (DMF) has smaller molecules than glycerol may act as a beneficial cryoprotectant when it is added into the diluents, showing a better effect in protecting the sperm membrane during freezing. This study was conducted in two steps: 1) Preserved liquid semen using tris-egg yolk (TEY) and tris-soya (TS) diluents with either trehalose and raffinose supplementation; 2) Produced frozen semen using TEY and TS with supplementation of the combination showing the best results in step 1. Both diluents used DMF and glycerol as the cryoprotectants.
Semen were collected from three sexually mature bucks using artificial vagina, evaluated and divided into six aliquot treatment groups. Each of aliquot diluted with TEY and TS supplemented with 50 mM trehalose or raffinose, which contain 50x106 sperm concentration per 0.2 mL volume. All of them kept in refrigerator in 5°C. The progressive motility, viability and plasma membrane intact (PMI) were evaluated every 12 hours up to the time when only 50% of sperm display motility.
The combination of trehalose or raffinose based showing the best results in analysis during the step 1 was added with TEY and TS diluents, supplemented with glycerol and DMF cryoprotectants in frozen semen process. Extended semen were kept in minitub straw, containing 100x106 sperm/0.25 mL. Equilibration time was 4 hours in 5°C, then freeze in N2 vaporated for 10 minutes in styrofoam
box.
(51.78±4.41%) and control (51.11±4.86%) for 72 hours. The viability of sperm evaluation showed 6-9% higher than sperm motility percentage, while the percentage of PMI gave similar percentage as sperm motility.
The quality of semen after dilution were similar among treatments compared with fresh semen quality and there were no differences between treatments (P>0.05). However, the influence of equlibration process for 4 hours kept in refrigerator slightly decrease to sperm motility (1.69%-2.24%) but there were no difference between treatments (P>0.05). The quality of semen post thawed, sperm motility were decreased in TEY trehalose added glycerol and DMF cryoprotectants (11.60% and 15.00%) better than in TS raffinose with similar cryoprotectants (34.45% and 37.60%) (P<0.05) and there were difference between TEY trehalose and TS raffinose added DMF and glycerol cryoprotectants (P<0.05). The sperm motility after thawed using TEY trehalose added glycerol cryoprotectant showed higher percentage (65.07±5.38%) with recovery rate (RR) 83.65% compared TEY trehalose added DMF (61.67±5.55%) with RR 79.29%. In contrast result, sperm in TS raffinose with DMF, can maintain sperm motility better (42.22±8.13%) than added with glycerol cryoprotectant (39.07±5.38%) (P<0.05).
In conclusion, Tris-soya can be use as a liquid diluents for buck semen and supplemented raffinose can maintained viability of sperm up to 60 hours, whereas the supplemented of trehalose to TEY diluent gave higher sperm motility, viability and PMI up to 84 hours. Glycerol cryoprotectant added to TEY diluents showed a better role to protected sperm in frozen semen process, compared TS diluents with DMF.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah dan pengutipan tersebut tidak merugikan
kepentingan IPB.
Nama : Oriza Savitri Ariantie NRP : B352100031
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof Dr drh Tuty Laswardi Yusuf, MS Prof drh Dondin Sajuthi, MST PhD Ketua Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana
Biologi Reproduksi
Prof Dr drh Mohamad Agus Setiadi Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Puji dan syukur penulis sampaikan kepada Allah SWT, yang telah memberikan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penelitian dan penulisan tesis Kriopreservasi Semen Kambing Peranakan Etawah (PE) Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur dan Tris-soya dengan Modifikasi Karbohidrat dan Krioprotektan Berbeda dapat diselesaikan. Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat menyelesaikan pendidikan Program Magister Sains pada Program Studi Biologi Reproduksi, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Selama penelitian hingga selesainya tesis ini penulis banyak mendapat bantuan dari berbagai pihak, untuk ini penulis sampaikan terima kasih. Terutama,
penulis menyampaikan terima kasih yang tulus kepada Komisi Pembimbing Prof Dr drh Tuty Laswardi Yusuf, MS dan Prof drh Dondin Sajuthi, MST PhD
atas bimbingan yang telah diberikan. Terima kasih juga kepada Prof Dr Dra Raden Iis Arifiantini, MSi sebagai penguji dari luar komisi atas masukan untuk perbaikan tesis ini. Terima kasih kepada manajemen Koperasi Kambing Perah, Cikarawang, Bogor yang telah mengijinkan pemakaian kambing Peranakan Etawah (PE). Terima kasih dan penghargaan setinggi-tingginya kepada kedua orang tua bapak Ir Susdy Matamien Nawi, mama Hartini, adik-adik tersayang Rio Aria Nugraha dan Muhammad Mirza Hidayat yang senantiasa memberikan doa, semangat dan dukungan kepada penulis selama ini. Tak lupa penulis berterima kasih kepada seluruh staf dan pegawai di Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Bondan Ahmadi, SE, bapak Herry, mas Yatna, mas Ucup, bapak Endah, bapak Adang, mas Gholib, Purwo Siswoyo SPt dan teman-teman satu penelitian yang tergabung dalam tim Program Unggulan Fakultas FKH IPB (Anggraita Putra, Azmi F Bangkit dan Bachtiari Hary Pravitasari), serta semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna. Namun demikian, penulis berharap tesis ini bermanfaat bagi para pembaca dan perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi pada umumnya.
Bogor, Januari 2013
DAFTAR TABEL iv
DAFTAR GAMBAR iv
DAFTAR LAMPIRAN iv
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Kerangka Pemikiran 2
Tujuan Penelitian 3
Manfaat Penelitian 3
Hipotesis 4
TINJAUAN PUSTAKA 5
Semen Kambing 5
Plasma Semen 5
Spermatozoa 6
Metabolisme Spermatozoa 7
Faktor-Faktor Penyebab Kerusakan Sel Spermatozoa Selama Proses
Kriopreservasi 9
Komponen Pengencer dan Pengenceran Semen Kambing 11
Ekuilibrasi, Pembekuan dan Thawing 18
METODE PENELITIAN 19
Tempat dan Waktu Penelitian 19
Materi Penelitian 19
Prosedur Percobaan 19
Preservasi Semen Cair Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur dan Tris-soya dengan Suplementasi Trehalosa dan Rafinosa 20 Kriopreservasi Semen Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur
Trehalosa dan Tris-soya Rafinosa dengan Penambahan Krioprotektan
Dimethilformamida (DMF) dan Gliserol 21
Rancangan Penelitian dan Analisis Data 22
HASIL DAN PEMBAHASAN 23
Kualitas Semen Segar 23
Preservasi Semen Cair Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur dan Tris-soya dengan Suplementasi Trehalosa dan Rafinosa 25 Kriopreservasi Semen Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur Trehalosa dan Tris-soya Rafinosa dengan Penambahan Krioprotektan
Dimethilformamida (DMF) dan Gliserol 30
SIMPULAN DAN SARAN 36
Simpulan 36
Saran 36
DAFTAR PUSTAKA 36
1 Komposisi kacang kedelai dan kuning telur 13 2 Komposisi bahan pengencer semen cair dengan suplementasi trehalosa
dan rafinosa 21
3 Komposisi bahan pengencer semen beku dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa dengan tambahan krioprotektan dimethilformamida
(DMF)dan gliserol 22
4 Rataan nilai karakteristik semen segar 23 5 Pengaruh pengencer tris-kuning telur dan tris-soya dengan
suplementasi trehalosa dan rafinosa terhadap persentase motilitas spermatozoa, persentase spermatozoa hidup dan persentase membran
plasma utuh (MPU) 27
6 Selisih perbedaan persentase spermatozoa hidup dan membran plasma utuh (MPU) dengan motilitas spermatozoa hingga 50% 28 7 Pengaruh dimethilformamida(DMF) dan gliserol dalam pengencer
tris-kuning telur trehalosa dan tris-soya rafinosa terhadap kualitas
spermatozoa 31
DAFTAR GAMBAR
1 Alur Kegiatan Penelitian 4
2 Spermatozoa dengan bagian-bagiannya (Toelihere 1985) 7
3 Trehalosa 14
4 Rafinosa 14
5 Dimethilformamida (DMF) dan gliserol 16
6 Spermatozoa hidup dan mati dengan pewarnaan eosin-nigrosin (a) spermatozoa hidup dan (b) spermatozoa mati 24
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi Melilea sari kedelai bubuk dan struktur 20 asam amino
menurut Kimball (1998) 43
2 Buffered Formol-Saline solution 44
3 Pewarna Eosin-Nigrosin (Barth dan Oko 1989) 44 4 Larutan hipoosmotik (Revell dan Mrode 1994) 44 5 Spermatozoa dengan membran plasma utuh dan tidak utuh 45 6 Pewarna Williams (Arifiantini et al. 2006) 45
7 Abnormalitas primer 46
8 Abnormalitas sekunder 46
9 Struktur umum lipoprotein (Pamela et al. 2008; Botham dan Mayes
2009) 47
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu upaya perbaikan mutu genetik ternak kambing di Indonesia dilakukan melalui pemanfaatan teknologi Inseminasi Buatan (IB). Namun teknologi IB pada ternak kambing masih kurang diaplikasikan secara luas. Hal ini terkait berbagai kendala diantaranya mengembangbiakannya masih dilakukan secara alami, ketepatan waktu inseminasi, teknik inseminasi dan kualitas semen beku yang dihasilkan. Kualitas semen beku ditentukan oleh berbagai faktor diantaranya teknik pembekuan, jenis pengencer, jenis dan konsentrasi krioprotektan yang digunakan. Saat ini semen kambing telah diproduksi oleh beberapa balai inseminasi buatan menggunakan pengencer Tris-kuning telur (TKT).
Rendahnya kualitas semen diduga akibat keberadaan enzim Phospholipase A yang disebut juga egg yolk coagulating enzyme yang ada di dalam bulbourethral gland secretion (BUS) yang terkandung dalam plasma semen kambing (Paulenz et al. 2005). Enzim ini dapat menghidrolisis fosfolipid dari kuning telur menjadi
lysophospholipid seperti lysolecithin yang toksik pada spermatozoa dan dapat
menyebabkan reaksi akrosom dini sehingga spermatozoa lebih cepat rusak. Sementara itu kuning telur dan susu mengandung fosfolipid dalam pengencer yang sangat dibutuhkan karena melindungi spermatozoa dari cold shock pada saat pendinginan ataupun pembekuan (Amirat et al. 2004). Sehingga kuning telur yang sudah lazim digunakan ditambahkan kedalam pengencer, dibandingkan dengan soya karena soya diperkirakan dapat menyamai fungsi dari kuning telur.
Pada ternak kambing hasil pembekuan masih terlihat rendah. Salah satu faktor keberhasilan pembekuan semen ditentukan oleh krioprotektan ekstraseluler seperti
polyvynilpirrolidone (PVP), gula dengan molekul besar seperti sukrosa, trehalosa,
rafinosa dan laktosa, protein dan lipoprotein, kuning telur dan susu serta krioprotektan intraseluler seperti gliserol (gliserin), dimethilsufoxida (DMSO), dimethilformamida (DMF), 1.2 prepanadiol dan etilen glikol.
Arifiantini dan Yusuf (2010) melaporkan modifikasi pengencer Tris-soya untuk preservasi semen beku sapi FH, menunjukkan secara in vitro motilitas spermatozoa dalam pengencer Tris soya setelah thawing lebih rendah dari pengencer tris kuning telur tetapi secara in vivo, angka konsepsi tris soya lebih tinggi dibandingkan pengencer tris kuning telur.
Karbohidrat merupakan salah satu komponen yang harus ada dalam pengencer semen untuk memenuhi kebutuhan nutrisi spermatozoa. Fruktosa dan glukosa merupakan karbohidrat (monosakarida) yang umum diberikan pada pengencer semen cair maupun semen beku pada berbagai ternak. Karbohidrat dapat berfungsi ganda dimana karbohidrat sederhana seperti glukosa dan fruktosa dibutuhkan sebagai sumber energi, sedangkan karbohidrat molekul besar dapat berfungsi sebagai krioprotektan ekstraseluler (Souhoka et al. 2009). Trehalosa (disakarida) menghasilkan 2 molekul glukosa. Sedangkan rafinosa (trisakarida) menghasilkan masing-masing 1 molekul galaktosa, glukosa dan fruktosa. Trehalosa dan rafinosa dapat menyimpan cadangan energi dalam jumlah yang lebih banyak, sehingga dapat digunakan oleh spermatozoa dalam waktu yang lebih lama. Penggunaan disakarida (trehalosa), trisakarida (rafinosa) dan oligosakarida pada pengencer semen beberapa ternak diduga lebih mampu melindungi spermatozoa dalam proses pembekuan (Molinia et al. 1994; Yildiz et al. 2000). Penggunaan trehalosa dan EDTA pada pembuatan semen beku domba dilaporkan dapat meningkatkan persentase motilitas spermatozoa dibandingkan dengan hanya menggunakan fruktosa (Aisen et al. 2000).
Penambahan krioprotektan dapat melindungi spermatozoa dari efek yang mematikan selama proses pembekuan dengan memodifikasi kristal-kristal es yang terbentuk dalam medium sewaktu pembekuan menjadi lebih kecil sehingga mampu menghambat kerusakan membran sel secara mekanis pada waktu penurunan suhu (cooling rate) (Tambing et al. 2000). Dimethilformamida (DMF) mempunyai kemampuan yang baik untuk melindungi sel terhadap pembekuan (Medeiros et al. 2002b). Dimethilformamida (DMF) dapat digunakan sebagai krioprotektan alternatif dalam pembekuan semen kambing (Bezerra et al. 2011). Amida telah menunjukan potensinya sebagai krioprotektan karena memiliki toksisitas dan viskositas yang lebih rendah dan memiliki bobot molekul yang rendah pula jika dibandingkan dengan gliserol (Medeiros et al. 2002b). Akan tetapi, mekanisme DMF untuk pembekuan semen kambing belum banyak dilaporkan.
Penelitian ini dilaksanakan dua tahap, yakni: 1) preservasi semen cair mengunakan pengencer tris-kuning telur dan tris-soya dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa dan 2) kriopreservasi semen menggunakan pengencer tris-kuning telur dan tris-soya dengan suplementasi karbohidrat terbaik dengan tambahan krioprotektan dimethilformamida (DMF) dan gliserol.
Kerangka Pemikiran
semen. Kemampuan tris-soya (lesitin nabati) dalam menggantikan kuning telur (lesitin hewani) dengan modifikasi trehalosa (C12H22O11) yang merupakan gula
nonpereduksi golongan disakarida (α-D-glukopiranosil-(1Æ1)-α-D-glukopiranosida) dari dua molekul glukosa yang terikat melalui ikatan α-1.1 dan mengandung antioksidan, serta rafinosa (C18H32O16) yang merupakan gula pereduksi golongan
trisakarida (α-D-galaktopiranosil-(1Æ6)-α-D-glukopiranosida-β-D-fruktofuranosil) dari satu molekul galaktosa dan glukosa yang terikat melalui ikatan α-1.6, serta satu molekul fruktosa yang diduga mampu menyimpan cadangan energi lebih lama selama proses penyimpanan didalam semen cair serta berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma karena berfungsi sebagai krioprotektan ekstraseluler dan digunakan sebagai dasar untuk pembuatan semen beku. Kualitas semen beku, selain ditentukan oleh unsur buffer dan karbohidrat, juga ditentukan oleh keberadaan krioprotektan. Dimethilformamida (CH3)2NCHO merupakan pelarut polar aprotik
terdiri dari komponen amida telah menunjukan potensinya sebagai krioprotektan dan diharapkan dapat menggantikan gliserol (C3H5(OH)3) karena memiliki toksisitas
yang yang lebih rendah serta memiliki bobot molekul (73.09) dan viskositas yang lebih rendah pula jika dibandingkan dengan gliserol (dengan bobot molekul 92.05). Selain itu penambahan metil (CH3) kedalam molekul amida dapat meningkatkan permeabilitas membran sperma, menjaga integritas akrosom dan meningkatkan efisiensi kriopreservasi, sehingga diperkirakan dapat mempertahankan permeabilitas membran selama proses pembekuan.
Berdasarkan uraian diatas maka penelitian ini dilakukan dalam dua tahap penelitian, yakni: 1) preservasi semen kambing mengunakan pengencer tris-kuning telur dan tris-soya dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa dan 2) kriopreservasi semen kambing mengunakan pengencer tris-kuning telur dan tris-soya dengan suplementasi karbohidrat terbaik dengan tambahan krioprotektan dimethilformamida (DMF) dan gliserol (Gambar 1).
Tujuan Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dengan tujuan :
1) Membandingkan efektivitas pengencer tris-kuning telur dan tris-soya dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa yang akan digunakan untuk memilih jenis
pengencer terbaik dalam mengoptimalkan proses pembekuan semen kambing, 2) Membandingkan manfaat penggunaan dimethilformamida (DMF) dan gliserol
sebagai krioprotektan untuk pengencer tris-kuning telur dan tris-soya dengan suplementasi karbohidrat terbaik yang digunakan dalam mengoptimalkan pembekuan semen.
3) Melihat hubungan antara spermatozoa motil, spermatozoa hidup dan membran plasma utuh.
Manfaat Penelitian
Hipotesis
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah :
1) Suplementasi rafinosa akan memperbaiki kualitas semen cair dan semen beku kambing dalam pengencer tris-kuning telur dan tris-soya dibandingkan trehalosa, 2) Krioprotektan dimethilformamida (DMF) lebih efektif dalam mempertahankan
kualitas semen beku kambing dibandingkan gliserol.
KOLEKSI SEMEN
Evaluasi
Makroskopis & Mikroskopis
(syarat: motilitas > 70%, konsentrasi > 2500x106/mL, abnormalitas < 10%)
PRESERVASI SEMEN
Tris-soya Tris-kuning telur
Trehalosa 50 mM Rafinosa 50 mM
KRIOPRESERVASI SEMEN
Gliserol 4% DMF 4%
Ekuilibrasi (3 – 5 °C)
Pembekuan (N2 cair)
Thawing Evaluasi
(motilitas)
Evaluasi
(motilitas, hidup mati, membran plasma utuh)
T a h a p I
Gambar 1 Alur Kegiatan Penelitian Evaluasi
(motilitas, hidup mati, membran plasma utuh)
T a h a p II Tris-soya Tris-kuning telur
Karbohidrat Terbaik
TINJAUAN PUSTAKA
Semen Kambing
Kambing Peranakan Etawah (PE) merupakan persilangan antara kambing Etawah yang berasal dari India yang disebut kambing Jamnapari dengan kambing lokal (kacang) yang asli Indonesia. Ciri khas kambing PE adalah telinganya panjang terkulai ke bawah, lembek, menggantung dan ujungnya agak melipat. Bentuk dahi dan hidungnya cembung, dan dagu berjanggut, dibawah leher terdapat gelambir, tanduk pendek berdiri agak kebelakang dengan ujung sedikit melingkar. Kambing PE memiliki badan yang besar, tinggi tubuh sekitar 85 cm dengan bobot badan sekitar 60 kg, bulu tumbuh panjang dibagian leher, pundak, punggung dan paha, bulu paha panjang dan tebal. Warna bulu umumnya belang hitam, belang coklat, coklat bertotol putih, putih totol coklat atau putih totol hitam (Pamungkas et al. 2009).
Semen merupakan suspensi cairan seluler yang terdiri atas spermatozoa sebagai gamet jantan dan sekreta yang berasal dari kelenjar-kelenjar kelamin pelengkap pada saluran reproduksi hewan jantan. Cairan yang terkandung dalam plasma semen yang dihasilkan pada saat ejakulat disebut plasma semen (Ogbuewu et al. 2010).
Plasma Semen
Semen Kambing terdiri atas dua bagian yaitu plasma semen dan spermatozoa. Plasma semen merupakan cairan yang disekresikan terutama oleh kelenjar vesikularis dan kelenjar aksesoris lainya. Plasma semen berfungsi sebagai medium perjalanan spermatozoa dari lingkungan saluran reproduksi jantan ke traktus reproduksi betina selama ejakulasi, sebagai medium aktivasi bagi spermatozoa non motil dan menyediakan penyangga serta kaya akan makanan yang penting untuk hidup spermatozoa setelah deposisi ke traktus reproduksi betina. Plasma semen berwarna kuning yang disebabkan oleh sekresi riboflavin dari kelenjar vesikularis. Plasma semen yang komponen terbesarnya adalah air (75%), merupakan cairan netral dengan tekanan isotonik serta berisi substansi organik dan inorganik sebagai cadangan makanan dan perlindungan bagi spermatozoa. Cairan isotonik plasma semen terutama dipertahankan oleh substansi organik seperti fruktosa, sorbitol, inositol, asam sitrat, gliserilfosforikolin, fosfolipid, prostaglandin, dan protein.
Fruktosa merupakan sumber energi terbesar untuk spermatozoa dalam semen (Morrell 2010). Bearden et al. (2004) menyatakan bahwa komponen plasma semen
terdiri dari glycosaminoglycan (GAG), yang merupakan suatu protein, natrium, dan klorin sebagai bahan anorganik, penyangga dan sebagai sumber energi bagi spermatozoa baik yang digunakan secara langsung seperti fruktosa dan sorbitol, maupun secara tidak langsung digunakan yaitu glyceryl phosphoryln choline (GPC). Sedangkan menurut Garner dan Hafez (2000) di dalam plasma semen terdapat asam sitrat dalam konsentrasi tinggi, ergotionin, fruktosa, GPC dan sorbitol yang berfungsi sebagai energi cadangan apabila substrat yang lain telah habis. Selain itu terdapat pula asam amino, asam askorbat, protein, lipid, asam lemak dan beberapa enzim.
permeabilitas membran plasma spermatozoa, 2) Vitamin berperan melindungi membran plasma spermatozoa dari kerusakan selama proses pembekuan semen, dengan jalan mengikat radikal oksigen sehingga mencegah terbentuknya peroksida lipid yang dapat menghambat glikolisis maupun motilitas, 3) kalium, natrium dan klorida sangat diperlukan untuk menjaga integritas fungsional membran plasma spermatozoa dan berperan pula untuk mempertahankan di dalam dan di luar sel spermatozoa, 4) kalsium berperan dalam menginduksi motilitas dan hiperaktivitas spermatozoa, 5) bikarbonat berperan sebagai agen penyangga untuk mencegah penurunan pH semen selama proses penyimpanan, 6) fruktosa dimanfaatkan oleh spermatozoa sebagai sumber energi, baik dalam kondisi anaerob (penyimpanan) dan aerob (saluran reproduksi betina) (Purdy 2006a).
Spermatozoa
Spermatozoa merupakan gamet jantan yang diproduksi oleh tubuli seminiferi testis. Struktur spermatozoa terdiri atas tiga bagian yaitu kepala, bagian tengah, dan ekor, dimana kepala berbentuk oval memanjang, lebar dan pipih sebagai pembawa materi genetik (DNA) yang berperan dalam menerjemahkan informasi genetik yang dibawa oleh spermatozoa dan ekor sebagai alat penggeraknya (Garner dan Hafez 2000).
Spermatozoa sebagai hasil akhir proses spermatogenesis merupakan sel yang berbentuk memanjang dengan bagian kepala sedikit pipih dan ekor yang panjang (Garner dan Hafez 2000) (Gambar 2). Untuk proses fertilisasi, spermatozoa harus mempunyai cukup energi untuk pergerakan, protein dan senyawa lain yang penting selama dalam saluran kelamin betina, dan plasma membran yang baik sehingga dapat melakukan fertilisasi tepat waktu (Purdy et al. 2010).
Ukuran kepala spermatozoa pada kambing bervariasi antar jenis, namun secara normal panjang 8 sampai 10 µm, lebar 4 µm dan tebal 1 µm (Evan dan Maxwell 1987). Sedangkan pada kambing Osmanabadi (India) dilaporkan panjang dan lebar kepala spermatozoa 8.96 µ dan 4.45 µ, panjang dan lebar bagian tengah ekor spermatozoa masing-masing 12.70 µ dan 0.75 µ dan panjang ekor spermatozoa 36.37 µ. Ekor spermatozoa merupakan bagian yang terakhir dan terpanjang dari spermatozoa, yang terbagi atas leher, bagian tengah, bagian utama dan bagian ujung. Bagian leher spermatozoa kurang jelas bentuknya dan pada bagian ini pula akan terlihat bagaimana kepala spermatozoa mudah terlepas dari bagian badan dan ekor. Bagian tengah merupakan bagian yang paling lebar dari ekor spermatozoa dan dikelilingi oleh selubung mitokondria. Bagian utama merupakan bagian terpanjang dari ekor spermatozoa dan mengandung banyak mesin penggerak (propelling machinery) serta mempunyai selubung yang berserat. Bagian ujung ekor relatif pendek dan tidak mempunyai selubung (Evans dan Maxwell 1987).
Ekor spermatozoa terdiri atas bagian leher (neck), tengah (midle), principal dan ujung (end) (Garner dan Hafez 2000). Bagian leher menghubungkan kepala dengan ekor. Ekor spermatozoa mengandung serabut-serabut fibril (axial filament) yang tersusun secara radial. Axial filament ini tersusun mulai dari sentriol atas dan berjalan
sampai dengan ujung ekor. Susunannya dari luar ke tengah adalah 9 filamen besar, 9 pasang filamen kecil dan 2 filamen kecil di pusat (Bearden et al. 2004).
Serabut-serabut ini bertanggung jawab terhadap pergerakan spermatozoa. Pada middle piece serabut-serabut tersebut diselubungi oleh mitokondria yang tersusun secara heliks mengelilingi sumbu memanjang. Mitokondria merupakan tempat metabolisme yang menghasilkan energi. Pada principal piece, serabut-serabut yang ada hanya 2 filamen pusat dikelilingi 9 pasang filamen kecil. Sedangkan pada end piece hanya mengandung 2 filamen pusat yang diselubungi membran.
Gambar 2 Spermatozoa dengan bagian-bagiannya (Toelihere 1985)
Metabolisme Spermatozoa
berbagai enzim yang terdapat di dalamnya. Secara umum, sel spermatozoa akan mengubah substrat menjadi energi melalui dua jalur, yaitu jalur glikolisis dan jalur siklus Krebs. Pada kondisi anaerob, spermatozoa akan mengubah glukosa, fruktosa dan manosa menjadi energi dan asam laktat melalui jalur Embden-Meyerhof (glikolisis) yang terjadi di dalam sitosol (Toelihere 1985). Kondisi ini penting bagi spermatozoa untuk bertahan hidup selama penyimpanan untuk keperluan inseminasi buatan karena metabolisme anerobik berjalan lambat. Sedangkan pada kondisi aerob, spermatozoa akan mengubah laktat atau piruvat hasil perombakan fruktosa untuk menghasilkan karbon dioksida dan air melalui jalur siklus Krebs (siklus asam sitrat) yang terjadi di dalam mitokondria (Morel 1999). Pada kondisi tanpa substrat eksogen, spermatozoa akan menggunakan plasmalogen (glikolipid) membran sebagai sumber energi jangka pendek (Garner dan Hafez 2000).
Menurut Garner dan Hafez (2000), energi untuk motilitas spermatozoa berasal dari perombakan adenosin trifosfat (ATP) di dalam membran mitokondria melalui reaksi-reaksi penguraiannya menjadi adenosin difosfat (ADP) dan adenosin monofosfat (AMP). Pengubahan ATP menjadi ADP menghasilkan energi sebanyak 7000 kalori/mol (Bearden et al. 2004), dengan reaksi sebagai berikut:
ATP + H2O ADP + H3PO4 + energi (7000 kalori/mol)
ADP + H2O AMP + H3PO4 + energi (7000 kalori/mol)
Dalam keadaan normal energi yang dilepaskan dapat dipakai sebagai energi mekanik atau energi kimia, jika tidak digunakan akan menghilang sebagai panas. Apabila pemberian energi berupa senyawa phosphor (P–P) di dalam ATP dan ADP habis, maka kontraksi fibril-fibril spermatozoa akan terhenti dan sperma tidak bergerak. Supaya spermatozoa dapat bergerak kembali maka ATP dan ADP harus dibangun lagi. Reaksi tersebut dapat berlangsung bolak-balik sehingga pergerakan spermatozoa dapat berlangsung. Untuk Membangun kembali ATP dari ADP atau ADP dari AMP dengan penambahan gugus phosphoryl diperlukan sumber energi dari luar. Sebagian besar aktifitas sumber energi fisiologi tersebut didapat dari karbohidrat dan lemak (Garner dan Hafez 2000).
Metabolisme karbohidrat sederhana (glukosa dan fruktosa) pada keadaan anaerob menghasilkan 2 ATP atau setara dengan 14000 kalori. Reaksi ini memperlihatkan kemampuan spermatozoa untuk menjaga daya tahannya pada waktu penyimpanan. Selain menghasilkan ATP, hasil akhir metabolisme karbohidrat tersebut juga dihasilkan asam laktat. Asam laktat ini dapat menyebabkan penurunan pH semen yang nantinya akan berpengaruh terhadap motilitas dan viabilitas spermatozoa. Pada keadaan aerob (ada oksigen) jalur reaksi metabolisme glukosa dan fruktosa menjadi 19 kali lebih tinggi dalam menghasilkan energi yaitu 38 ATP atau sama dengan 266000 kalori dan hasil sampingan berupa karbon dioksida serta air. Selain karbohidrat sebagai sumber energi bagi spermatozoa di dalam plasma semen juga terdapat glyceryl phosphoryl choline (GPC) yang dapat dimetabolisir melalui jalur yang sama seperti pada fruktosa maupun glukosa (Bearden et al. 2004).
Faktor-Faktor Penyebab Kerusakan Sel Spermatozoa Selama Proses Kriopreservasi
Fenomena utama selama proses kriopreservasi yang dapat menurunkan viabilitas sel spermatozoa, yaitu kejutan dingin (cold shock) dan perubahan intraseluler akibat pengeluran air yang berkaitan dengan pembentukan kristal es. Selain itu ada faktor tambahan, yakni peroksidasi lipid dan faktor antibeku pada plasma semen seperti egg-yolk coagulating enzyme, triglyserol lipase dan faktor anti motilitas. Kerusakan umum pada sel spermatozoa selama proses kriopreservasi akibat adanya fenomena tersebut adalah kerusakan mekanik yang ditandai dengan kerusakan organel sitoplasma atau pecah karena ekspansi es, konsentrasi larutan menjadi toksik dan tebal akibat adanya dehidrasi dari suspensi media baik intra maupun ekstraseluler dan perubahan fisik serta kimiawi diantaranya presipitasi, denaturasi, koagulasi dari protein, disosiasi ion dan kehilangan sifat-sifat absorpsi atau sifat-sifat pengikat air (Paulenz et al. 2005). Dijelaskan lebih lanjut bahwa khusus pada semen kambing, keberadaan faktor koagulan pada plasma semen seperti egg-yolk coagulating enzyme dan triglycerol lipase sangat sensitif terhadap proses kriopreservasi sehingga akan menurunkan viabilitas setelah thawing.
Cold Shock (kejutan dingin). Kejutan mencakup kerusakan pada membran
seluler dan perubahan dalam fungsi metabolik, yang kemungkinan disebabkan oleh perubahan dalam susunan struktur membran (Medeiros et al. 2002a). Kejutan dingin terjadi karena adanya penurunan temperatur secara mendadak dari temperatur tubuh ke temperatur rendah (di bawah 0οC) sehingga akan menurunkan viabiltas sel. Fenomena kejutan dingin berkaitan dengan fase transisi dari membran lipid yang menyebabkan terjadinya fase pemisahan dan penurunan sifat-sifat permeabilitas secara selektif dari membran biologik sel hidup (Watson 2000). Dijelaskan lebih lanjut bahwa tingkat sensitivitas sel terhadap kejutan dingin dipengaruhi oleh tingkat pendinginan dan interval suhu.
Efek kejutan dingin pada spermatozoa adalah penurunan aktivitas flagella, kerusakan organel intraseluler dan kerusakan membran sel (Drobnis et al. 1993). Ada dua tipe kerusakan pada sel akibat kejutan dingin dapat terjadi secara langsung dan tidak langsung yang bersifat laten (Gazali dan Tambing 2002). Dijelaskan lebih lanjut bahwa kerusakan langsung akan memengaruhi struktur dan fungsi seluler, misalnya penurunan proses metabolisme spermatozoa, sedangkan kerusakan tidak langsung sulit untuk diamati dan baru terlihat setelah proses pencairan kembali. Pengaruh utama dari kejutan dingin terhadap sel spermatozoa ialah penurunan motilitas dan daya hidup, perubahan permeabilitas dan perubahan komponen lipid pada membran. Jumlah spermatozoa motil mengalami penurunan disertai pelepasan enzim, perpindahan ion melewati membran dan penurunan kandungan lipid seperti fosfolipid dan kolestrol yang sangat berperan dalam mempertahankan integritas membran plasma, serta penurunan kemampuan sel spermatozoa untuk mengkontrol aliran Ca2+ (Ogbuewu et al. 2010).
kemungkinan berkaitan dengan perubahan tekanan osmotik dalam fraksi yang tidak mengalami pembekuan (Watson 2000).
Perubahan fisik di dalam sel selama kriopreservasi ada kaitannya dengan
cooling rate atau derajat penurunan suhu. Prinsip utama cooling rate adalah
kecepatan optimal yang dapat memberi kesempatan air keluar dari sel secara kontinyu bertahap sebagai respon sel terhadap kenaikan konsentrasi larutan ekstraseluler yang semakin tinggi diantara kristal-kristal es yang terbentuk. Jika cooling rate berlangsung lambat, air akan banyak keluar dari sel untuk mencapai keseimbangan potensial kimiawi air intra dan ekstraseluler serta terjadi dehidrasi untuk menghindari pembekuan intraseluler. Apabila medium pengencer didinginkan dibawah titik beku, maka kristal-kristal es bernukleasi dan air akan berkristalisasi sebagai es (Watson 2000). Jika cooling rate cepat, keseimbangan potensial air akan terganggu dan sel intraseluler membeku dan cooling rate yang sangat cepat akan menyebabkan pembentukan kristal es intraseluler dimana mempunyai energi permukaan yang besar dan tidak stabil serta cenderung membentuk kristal-kristal es yang besar, akibatnya akan bersifat letal terhadap sel (Gazali dan Tambing 2002).
Efek yang ditimbulkan pada sel spermatozoa akibat pembentukan kristal-kristal es adalah penurunan motilitas dan viabilitas spermatozoa, peningkatan pengeluaran enzim-enzim intraseluler ke luar sel, dan kerusakan pada organel-organel sel, seperti lisosom dan mitokondria (Gazali dan Tambing 2002). Dijelaskan lebih lanjut bahwa jika lisosom pecah akan mengeluarkan asam hidrolase sehingga akan mencerna bagian sel yang lain, sedangkan mitokondria rusak menyebabkan putusnya rantai oksidasi. Organel mitokondria mempunyai peranan sebagai sumber energi yang akan menggertak mikrotubul sehingga terjadi pergesekan diantara mikrotubul dan akibatnya spermatozoa dapat bergerak secara bebas (motil progresif).
Radikal Bebas dan Peroksidasi Lipid. Radikal bebas yang merupakan senyawa oksigen reaktif atau Reactive oxygen Species (ROS) adalah molekul atau oksidan yang sangat reaktif walaupun derajat kekuatannya berbeda-beda karena memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan dalam orbital luarnya, sehingga dapat bereaksi dengan molekul sel dengan cara mengikat elekron dari molekul sel tersebut, yang mengakibatkan reaksi berantai yang dapat menghasilkan radikal bebas baru, seperti superoksida dismutase (SOD) dan nitric oxide (NO). Dengan demikian radikal bebas dapat mengganggu integritas sel dan dapat bereaksi dengan komponen-komponen sel, baik komponen struktural/ molekul-molekul penyusun membran maupun komponen fungsional/ enzim-enzim dan DNA. Radikal bebas dapat menyebabkan reaksi berlanjut sampai radikal bebas itu dihilangkan oleh reaksi dengan radikal bebas lain atau sistem anti oksidan (Zhu et al. 2010). Tingginya komposisi spermatozoa dengan asam lemak tidak jenuh memiliki konsekuensi yang tidak menguntungkan karena menjadi rentan terhadap peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid yang meluas menimbulkan perusakan oksidatif terhadap asam lemak tidak jenuh ganda atau lipid yang memiliki lebih dari dua ikatan kovalen karbon-karbon (Gogol et al. 2009). Dijelaskan lebih lanjut bahwa kerusakan yang terjadi tergantung pada terdapatnya oksigen. Prinsip dasarnya bahwa oksigen adalah esensial, namun kelebihan oksigen menyebabkan kerusakan peroksidasi.
yang kesemuanya mengakibatkan kerusakan membran sel yang parah dan membahayakan (Ogbuewu et al. 2010). Efek peroksidasi pada spermatozoa beberapa mamalia berupa hilangnya motilitas secara permanen, penghambatan fruktolisis dan respirasi, pengikatan enzim intraseluler dan kerusakan struktur membran plasma, terutama pada bagian akrosom sehingga juga menurunkan fertilitasnya (Anghel et al. 2009).
Faktor Antibeku pada Plasma Semen. Faktor antibeku yang terdapat dalam plasma semen mamalia ialah egg-yolk coagulating enzyme. Egg-yolk coagulating
enzyme (EYCE) merupakan salah satu enzim antibeku yang terdapat pada plasma
semen kambing. EYCE diduga ialah enzim fosfolipase A yang disekresikan oleh kelenjar bulbouretralis (kelenjar cowper). Bila bereaksi dengan kuning telur yang terdapat dalam media pengencer akan mengakibatkan kematian spermatozoa. Enzim fosfolipase A menguraikan lesitin dari kuning telur menjadi lisolesitin dan asam lemak tak jenuh yang bersifat toksik (Paulenz et al. 2005). Menurut Ari dan Daskin (2010), pembentukan lisolesitin terjadi karena fosfolipase A memutus gugus R2 dari lesitin yang digantikan oleh asam oleat suatu asam lemak tak jenuh. Toksisitas dari EYCE bergantung pada pH, suhu, konsentrasi plasma semen, musim produksi semen, dan kandungan kuning telur. Terdapat hubungan linear antara aktivitas penggumpalan dengan konsentrasi EYCE dalam jumlah terbatas pada plasma semen ataupun pada kelenjar bulbouretralis (Leboeuf et al. 2000).
Komponen Pengencer dan Pengenceran Semen Kambing
Untuk menjamin kebutuhan fisik dan kimia sehingga spermatozoa dapat mempertahankan kelangsungan hidupnya selama proses kriopreservasi maka harus ditambahkan bahan pengencer. Syarat bahan pengencer antara lain mengandung unsur-unsur yang hampir sama dengan sifat fisik dan kimia semen, tidak boleh mengandung zat-zat yang bersifat racun baik terhadap spermatozoa maupun terhadap seluran kelamin hewan betina dan tetap mempertahankan serta tidak membatasi daya fertilitas spermatozoa (Purdy 2006a).
Bahan pengencer semen mempunyai fungsi, antara lain sebagai sumber energi, melindungi spermatozoa terhadap kerusakan akibat pendinginan yang cepat (anti cold shock), sebagai penyangga (buffer) yang mencegah efek membahayakan terhadap perubahan pH akibat terbentuknya asam laktat, mempertahankan tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit, menghambat pertumbuhan bakteri, menambah volume semen, dan melindungi sel spermatozoa selama proses pembekuan
(krioprotektan). Secara umum bahan pengencer terdiri atas tiga bagian, yakni 1) bahan dasar seperti kuning telur dan susu, 2) bahan penyangga (buffer), seperti
natrium-kalium bikarbonat, asam sitrat, tris dan 3) bahan tambahan, seperti gliserol dan antibiotik (Hafez 2000).
Bufer Tris
Tris (Tris hydroxymethyl aminomethane) banyak digunakan sebagai pengencer semen beku pada sapi, yang memiliki toksisitas yang rendah dan sistem penyangga yang baik, akan tetapi telah banyak pula peneliti menggunakan pengencer tris untuk pengenceran semen kambing baik untuk keadaan cair maupun beku. Pengencer harus berisikan beberapa agen protektif untuk melindungi spermatozoa selama proses kriopreservasi, antara lain kuning telur untuk melindungi membran sel selama pendinginan sampai suhu 5oC dan krioprotektan yang melindungi spermatozoa terhadap kerusakan membran selama pembekuan (Khalifa dan El-Saidy 2006a). Dijelaskan lebih lanjut bahwa tris aminomethan bersama asam sitrat yang berperan sebagai penyangga untuk mempertahankan perubahan pH akibat terbentuknya asam laktat hasil metabolisme spermatozoa juga berperan untuk mempertahankan tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit. Gazali dan Tambing (2002) menyatakan bahwa tris memiliki kelebihan sebagai pengencer karena memiliki kapasitas sebagai penyangga yang baik dan mampu mempertahankan tekanan osmotik karena mengandung garam-garam dan asam amino.
Kacang Kedelai
Menurut Aboagla dan Terada (2004a), yang menyatakan bahwa anti cold
shock, perlu ditambahkan dalam bahan pengencer agar dapat melindungi
spermatozoa pada saat perubahan suhu dari suhu ruang (28oC) pada saat pengolahan ke suhu ekulibrasi (5oC). Anti cold shock yang umum ditambahkan adalah kuning telur ataupun kacang kedelai yang dapat melindungi spermatozoa membran spermatozoa pada saat pendinginan dan pembekuan. Khasiat utama kuning telur ataupun kacang kedelai adalah kandungan lesitin (phosphatidyl choline) yang bersifat membran couting untuk tetap mempertahankan konfigurasi normal dari
phospholipid bilayer yang merupakan susunan utama membran spermatozoa. El-Keraby et al. (2010) menyatakan bahwa kacang kedelai mengandung lesitin lebih
unggul daripada kuning telur, selain itu kuning telur memiliki kecenderungan terkontaminasi bakteri lebih besar daripada kacang kedelai. Lesitin dari kacang kedelai merupakan pilihan yang tepat sebagai sumber lesitin bahan pengencer semen dimasa yang akan datang (Aires et al. 2003). Kacang kedelai telah dilaporkan mampu menekan stres oksidatif (Ogbuewu et al. 2010). Kacang kedelai yang belum
maupun yang sudah mengalami penyulingan memiliki kandungan fosfolipid (Aku et al. 2007) (Tabel 1).
Lesitin kacang kedelai memiliki bahan-bahan yang mirip dengan lesitin pada kuning telur yang digunakan untuk perlindungan terhadap cold shock pada saat kriopreservasi (Thun et al. 2002; Aires et al. 2003). Meskipun lesitin dari bahan nabati seperti lesitin dari kacang kedelai banyak tersedia, akan tetapi lesitin dari kuning telur masih banyak digunakan untuk pembekuan semen (Aires et al. 2003; Santiago-Moreno et al. 2008).
Kuning Telur
kuning telur terdapat kandungan fosfolipid, kolesterol dan low density lipoprotein yang berfungsi melindungi spermatozoa dari kejutan dingin selama proses pembekuan.
Kuning telur mempunyai sifat sebagai penyangga tekanan osmotik sehingga spermatozoa lebih toleran terhadap lingkungan yang hipotonik atau hipertonik (Khalifa dan El-Saidy 2006b). Hal ini karena kuning telur mengandung beberapa senyawa yang penting untuk kelangsungan hidup spermatozoa selama penyimpanan. Komposisi fosfolipid kuning telur menurut Juneja et al. (1994) dan Dong et al. (2006) tersaji pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi kacang kedelai dan kuning telur
Komposisi Kacang kedelai Kuning telur
(Aku et al. 2007) (Juneja et al.
1994)
(Dong et al. 2006)
Fosfatidil kolin (lesitin) 17.50% - 23.00% 80.80% 77%
Fosfatidil etanolamin 15.00% - 20.00% 11.70% 18%
Glikolipid 13-16% - -
Diduga komponen yang berperan aktif dalam melindungi membran spermatozoa selama pembekuan adalah fraksi dengan berat jenis rendah, yaitu low density lipoprotein (LDL) (Moussa et al. 2002). Low density lipoprotein menyusun sekitar 2/3 dari total bahan padat kuning telur ayam. Senyawa ini mempunyai berat jenis 1.019-1.063 g/mL, molekulnya bulat (spherical) dengan diameter 20-25 nm, dan mempunyai inti lipid (trigliserida nonpolar dan ester kolesterol) yang dikelilingi oleh lapisan fosfolipid dan protein dimana bagian ujung polarnya kontak dengan aquous phase (Botham dan Mayes 2009; Moussa et al. 2002). Low density
lipoprotein tersusun atas 85-90% lipid (69% trigliserida, 26% fosfolipid dan
5% kolesterol) dan 10-15% protein. Botham dan Mayes (2009) menyelaskan lebih lanjut bahwa LDL tersusun atas 79% lipid (dengan komponen utama kolestrol) dan 21% protein, protein utama yang membentuk LDL adalah Apo-B (apolipoprotein-B). Didalam lipoprotein terdapat empat kelas utama lipid terdiri dari 16% triasilgliserol, 30% fosfolipid, 14% kolestrol, 36% ester kolesteril serta sedikit asam lemak rantai-panjang tak teresterifikasi (asam lemak bebas) (4%). Holt (2000) menyatakan bahwa penggunaan konsentrasi akhir kuning telur dengan persentase yang berbeda berkisar antara 0-20%, namun sebagian besar melaporkan kesuksesan inseminasi menggunakan semen beku dengan konsentrasi kuning telur sebesar 20% pada bahan pengencer.
Karbohidrat
inkubasi, mempertahankan tekanan osmotik cairan dan bertindak sebagai krioprotektan. Kemampuan jenis karbohidrat dalam melindungi sel spermatozoa tergantung pada suhu penyimpanan semen, berat molekul dari jenis karbohidrat dan tipe dari penyangga yang digunakan dalam pengencer. Sebagai sumber energi selama dalam preservasi dan kriopreservasi, kedalam media pengencer ditambahkan senyawa karbohidrat. Beberapa yang biasa ditambahkan adalah monosakarida (glukosa dan fruktosa), disakarida (laktosa, sukrosa dan trehalosa) dan oligosakarida (rafinosa). Trehalosa (C12H22O11) yang merupakan gula nonpereduksi golongan
disakarida (α-D-glukopiranosil-(1Æ1)-α-D-glukopiranosida) dari dua molekul glukosa yang terikat melalui ikatan α-1.1 (Gambar 3) dan mengandung antioksidan (Best c1990), Trehalosa bukan merupakan gula pereduksi, karena 2 atom karbon anomerik berikatan satu sama lain. Rafinosa (C18H32O16) yang merupakan gula
pereduksi golongan trisakarida (α-D-galaktopiranosil-(1Æ6)-α-D-glukopiranosida-
β-D-fruktofuranosil) dari satu molekul galaktosa dan glukosa yang terikat melalui ikatan α-1.6, serta satu molekul fruktosa (Gambar 4) (Bender dan Mayes 2009).
Gambar 3 Trehalosa
Gambar 4 Rafinosa
Penggunaan disakarida (trehalosa) dan trisakarida (rafinosa) pada pengenceran semen beberapa ternak diduga lebih mampu melindungi spermatozoa dalam proses pembekuan (Yildiz et al. 2000). Trehalosa dan rafinosa adalah karbohidrat dengan molekul besar yang berfungsi sebagai krioprotektan ekstraseluler (Crowe dan Crowe 2000). Penggunaan trehalosa dan ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) pada pembuatan semen beku domba dilaporkan dapat meningkatkan persentase spermatozoa motil dibandingkan dengan hanya menggunakan fruktosa (Aisen et al. 2000). Pengencer tris sitrat yang mengandung trehalosa dapat meningkatkan viabilitas spermatozoa pada saat pembekuan dan pencairan kembali semen beku
kambing. Selain itu trehalosa juga dapat meningkatkan kelangsungan hidup sel spermatozoa selama penyimpanan dalam nitrogen cair, serta dapat meningkatkan fluiditas membran akibat transisi suhu yang dapat menyebabkan membran sperma dapat bertahan pada suhu rendah (Aboagla dan Terada 2003).
Beberapa laporan mengungkapkan informasi tris-kuning telur sebagai pengencer terbaik untuk pengawetan semen sapi FH (Friesian Holstein) (Arifiantini dan Purwantara 2010), ram (Nel-Themaat et al. 2006; Paulenz et al. 2003; Purdy 2006b; Soylu et al. 2007), kerbau (Rasul et al. 2000; Sukhato et al. 2001), kambing (Fukui et al. 2008; Purdy 2006a), kambing Spanish Ibex (Santiago-Moreno et al. 2008), anjing (Hermansson dan Linde-Forsberg 2006; Schafer-Somi et al. 2006), gajah (Graham et al. 2004). Arifiantini et al. (2005), menggunakan Tris Raffinosa-kuning telur, Tris Fruktosa-Raffinosa-kuning telur dan bahan pengencer komersial berbasis soya lechitin untuk pengawetan semen sapi FH (Friesian Holstein). Keunggulan penambahan trehalosa telah dilaporkan pada semen tikus (Sztein et al. 2001), sapi (Woelders et al. 1997), anjing (Yildiz et al. 2000), domba (Aisen et al. 2002), kambing (Aboagla dan Terada 2004b) dan babi (Hu et al. 2009). Sedangkan keunggulan rafinosa juga telah dilaporkan pada semen kambing Angora (Salamon dan Ritar 1982) dan tikus (Holt 2000).
Krioprotektan
Krioprotektan adalah zat kimia non elektrolit yang berfungsi mereduksi pengaruh letal proses pemaparan kriopreservasi sel diantaranya baik yang berupa efek larutan maupun pembentukan kristal es ekstra maupun intraseluler sehingga
dapat menjaga viabilitas sel setelah kriopreservasi (Purdy 2006a). Leboeuf et al. (2000) menjelaskan bahwa krioprotektan dapat dikelompokan
berdasarkan perpaduan antara sifat fisik kimia (besar molekul, polaritas dan koligatif) dengan sifat biologis membran sel yang semipermeabel maka dapat dibagi menjadi dua bagian yaitu krioprotektan ekstraseluler dan intraseluler, yang termasuk
krioprotektan intraseluler yakni gliserol (gliserin), dimethylsulfoxide (DMSO), 1.2 prepanadiol dan etilen glikol. Sedangkan yang termasuk krioprotektan
ekstraseluler adalah polyvynilpirrolidone (PVP), gula dengan molekul besar seperti sukrosa, rafinosa dan laktosa, protein dan lipoprotein, kuning telur dan susu.
Berdasarkan cara kerjanya krioprotektan dikelompokan menjadi penetrating
(bekerja di dalam dan di luar sel) dan non-penetrating (hanya di luar sel) (Best c1990). Sedangkan berdasarkan bahan yang terkandung didalamnya
krioprotektan diklasifikasikan menjadi dua golongan, yaitu golongan alkohol (seperti etilen glikol dan gliserol) dan golongan amida (seperti dimethilformamida, asetamida dan methilformamida) (Alvarenga et al. 2005). Fungsi krioprotektan adalah mencegah terbentuknya kristal-kristal es akibat dehidrasi sel yang berlebihan dari dalam sel dan menstabilkan membran plasma sel sehingga dapat melindungi kerusakan fisik maupun fungsional spermatozoa selama proses pembekuan dan memodifikasi struktur kristal sehingga tidak merusak organel-organel sel (Gazali dan Tambing 2002).
Krioprotektan intraseluler gliserol (C3H5(OH)3) (Gambar 5) merupakan
meningkatkan daya tahan spermatozoa. Efek lain gliserol adalah mencegah pengumpulan molekul H2O dan mencegah kristalisasi es pada daerah titik beku
larutan. Gliserol akan berdifusi, menembus dan memasuki spermatozoa dan akan digunakan untuk aktivitas metabolisme oksidatif, menggantikan sebagian air yang bebas dan mendesak keluar elektrolit-elektrolit, menurunkan konsentrasi elektrolit intraseluler dan mengurangi daya merusaknya terhadap spermatozoa dengan jalan memodifisir kristal-kristal es yang terbentuk (Tambing et al. 2000).
Dimethilformamida (DMF) (CH3)2NCHO Gliserol (C3H5(OH)3)
Gambar 5 Dimethilformamida (DMF) dan gliserol
Gliserol telah menjadi krioprotektan yang paling banyak digunakan untuk pembekuan semen (Leboeuf et al. 2000). Namun demikian amida juga telah menunjukan potensi yang baik sebagai krioprotektan, karena memiliki toksisitas
yang yang lebih rendah dan memiliki bobot molekul yang rendah pula (Medeiros et al. 2002b). Bezerra et al. (2011) menyatakan bahwa amida memiliki
toksisitas yang lebih rendah dan dapat menjaga integritas akrosom. Amida telah diusulkan sebagai krioprotektan alternatif untuk pembekuan semen, terutama untuk semen dari pejantan yang lebih sensitif terhadap efek racun dari gliserol karena amida memiliki bobot molekul (73.09) dan viskositas yang lebih rendah dibandingkan dengan gliserol (dengan bobot molekul 92.05) dan untuk permeabilitas membran yang lebih tinggi sehingga dapat mengurangi kemungkinan kerusakan sel yang disebabkan oleh tekanan osmotik. Selain itu penambahan metil (CH3) kedalam
molekul amida dapat meningkatkan permeabilitas membran sperma dan meningkatkan efisiensi kriopreservasi. Purdy (2006a) menyatakan bahwa walaupun gliserol agak beracun bagi spermatozoa dan dapat menyebabkan kerusakan osmotik, gliserol adalah krioprotektan yang paling banyak digunakan untuk pembekuan semen. Penggunaan dimethilformamida (DMF) tidak lebih unggul daripada gliserol jika digunakan sebagai krioprotektan untuk semen kambing (Bezerra et al. 2011).
Dimethilformamida (DMF) termasuk kedalam kelompok polar aprotik. DMF memiliki titik didih 153°C, konstanta dielektrik 38 dan massa jenis 0.944 g/mL (Pelarut 2011). DMF di digolongkan sebagai senyawa amida dan memiliki sifat basa lemah (Bixara 2009). Dimethilformamida (DMF) merupakan pelarut aprotik polar yang digunakan dalam pembekuan kering. Pelarut aprotik polar adalah pelarut yang tidak memiliki proton untuk ikatan hidrogen pada inti dan akan melarutkan lebih banyak kation daripada anion. Dengan demikian anion tersebut kurang terikat oleh molekul pelarut dan lebih banyak tersedia untuk reaksi, sehingga semakin polar suatu pelarut maka energi aktivasi untuk ionisasi akan semakin rendah dan derajat reaksinya akan semakin cepat (Alvarenga et al. 2005). Dimethilformamida
merupakan salah satu cryoprotectant agent (CPA) dengan konstanta dielektrik yang tinggi (Best c1990). Konstanta dielektrik merupakan suatu ukuran kemampuan zat untuk memisahkan daya tarik antara partikel bermuatan listrik yang berlawanan (Best c1990).
Dimethilformamida (DMF) merupakan derivat acyl dan mempunyai rumus struktur (CH3)2NCHO (Gambar 5). Acyl terdiri atas sepasang grup fungsional
dimana sebuah karbonil bergabung dengan oksigen, halogen, sulfur atau atom elektronegatif lainnya. Derivat acyl yang penting adalah asam klorida, ester dan amida yang mendekati struktur asam karboksilat. N,N dimethilformamida adalah amida yang dihasilkan N-alkil tersubtitusi atau N,N-dialkil tersubtitusi, dan amida relatif stabil terhadap air (Fessenden dan Fessenden 2006). Dijelaskan lebih lanjut oleh Fessenden dan Fessenden (2006), DMF merupakan pelarut aprotik polar, polar berarti mengutub dimana satu atom mempunyai keelektronegatifan yang substansial lebih besar dari atom lainnya. Semakin elektronegatif suatu atom, semakin besar tarikannya terhadap elektron sehingga tidak cukup bagi atom untuk memecahkannya menjadi ion. Atom ini mempunyai bagian elektron yang besar dan menghasilkan suatu ikatan dengan distribusi elektron yang tidak merata.
Pelarut aprotik adalah pelarut yang tidak memiliki proton terhadap nukleofilik (Pine et al. 1988), sedangkan nukleofilik adalah anion yang mengikat suatu halida dalam suatu rekasi substitusi. Umumnya suatu nukleofil ialah spesi apa saja yang tertarik kesuatu pusat positif dan merupakan suatu basa lewis dan zat yang dapat memberikan sepasang elektron. Wade (2000) menjelaskan bahwa DMF yang merupakan pelarut yang bersifat polar aprotik (tidak mempunyai atom -H untuk ikatan hidrogen) dengan konstanta dielektrik dan moment dipol yang tinggi. Jadi meskipun DMF melarutkan tidak bekerja membentuk ikatan hidrogen dengan anion. DMF dapat melarutkan garam-garam terutama melalui kation larutan melalui daya tarik pada ujung dipol C=O. Ujung positif dari dipol dilindungi di dalam molekul dan dapat melarutkan anion tetapi sangat lemah. Pine et al. (1998) menjelaskan bahwa amida dapat dengan mudah terbentuk dari senyawa yang sesuai yang memiliki gugus amino dan gugus karboksilat. Oleh karena itu amida mudah bereaksi dengan asam karboksilat di dalam reaksi asam-basa sehingga menghasilkan garam amonium. (Fessenden dan Fessenden 2006) menyatakan bahwa hidrolisis suatu amida dalam larutan asam berlangsung dalam suatu cara yang serupa dengan hidrolisis suatu ester. Oksigen karbonil diprotonasi, karbon karbonil diserang oleh H2O, proton diserah
terimakan, dan suatu amina dibuang. Amina ini kemudian bereaksi dengan H+ dan menghasilkan garam amina. Pembentukan garam amina menjelaskan bahwa H+ bersifat pereaksi, bukan katalis.
Krioprotektan ideal untuk pembekuan spermatozoa harus memiliki bobot molekul yang kecil, mudah larut dalam air dan memiliki toksisitas yang rendah (Alvarenga et al. 2005). Gliserol dapat masuk ke dalam spermatozoa sapi dalam waktu 3 sampai 4 menit (Arifiantini dan Supriatna 2007). Dimethilformamida (DMF) 2% merupakan krioprotektan yang lebih baik dibandingkan gliserol atau kombinasi DMF dan gliserol (Vidament et al. 2002). Dimethilformamida 5% juga mempunyai kemampuan melindungi sel terhadap pembekuan lebih baik dibandingkan dimethil asetamida, methil formamida atau gliserol dengan konsentrasi yang sama (Medeiros et al. 2002b).
Penambahan gliserol ke dalam pengencer dapat mengurangi tingkat kerusakan akibat pembekuan. Gliserol merupakan bahan osmotik aktif yang menyebabkan penambahan secara temporer dikarenakan perubahan volume sel dan berkurangnya kadar air didalam sel. Manfaat utama dari gliserol adalah secara intraseluler memberikan efek langsung terhadap membran plasma. Gliserol mengubah sifat koligatif air untuk menurunkan titik beku, sehingga memberikan waktu yang lebih lama bagi air untuk keluar dari sel sebelum pembekuan dan pembekuan kristal es yang dapat merusak organel intraseluler (Leboeuf et al. 2000).
Antibiotik
Pengendalian pertumbuhan mikroba merupakan langkah penting dalam mencegah penyebaran penyakit reproduksi melalui penggunaan semen dan untuk meningkatkan efisiensi reproduksi ternak. Komponen bahan pengencer seperti kuning telur dapat meningkatkan pertumbuhan mikroba, sehingga penambahan antibiotik pada bahan pengencer semen efektif untuk mengontrol pertumbuhan mikrobiologis (Mitchell dan Doak 2004).
Dalam beberapa kasus, jaringan testis dan kelenjar kelamin pelengkap merupakan daerah yang bebas bakteri dan kontaminasi bakteri cenderung terjadi dari ejakulat selama proses koleksi semen. Antibiotik perlu ditambahkan pada pengencer sejak komponen bahan pengencer dan semen berada pada temperatur 15-16°C yang mendorong pertumbuhan bakteri gram negatif seperti Escherichia coli dan Salmonella. Kontaminasi bakteri terutama mengarah kepada serangkaian perubahan termasuk berkurangnya motilitas spermatozoa, aglutinasi, peningkatan perubahan akrosom dan penurunan pH ke level asam (5.6-6.4) (Althouse et al. 2004).
Ekuilibrasi, Pembekuan dan Thawing
Ekulibrasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh spermatozoa untuk menyesuaikan diri sebelum pembekuan, yang dilakukan dengan cara menempatkan straw yang berisi semen pada temperatur 5oC selama empat jam. Leboeuf et al. (2000) menyatakan bahwa ekulibrasi dilakukan selama 1.5-4 jam pada temperatur 4–5 oC. Setelah ekuilibrasi selesai dilakukan, tahap selanjutnya yang dilakukan adalah pembekuan semen. Pembekuan semen dilakukan secara hati-hati dengan cara meletakkan straw pada uap nitrogen (N2) cair pada jarak 3 cm di atas permukaan N2
cair selama 10 menit dengan mengunakan boks styrofoam. Semen beku tersebut disimpan dalam kontainer N2 cair (-196oC) sampai dilakukan evaluasi (Purdy 2006a).
METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Unit Rehabilitasi Reproduksi (URR), Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor dan Koperasi Kambing Perah, Cikarawang, Bogor. Penelitian ini dilakukan pada bulan November 2011 sampai dengan April 2012.
Materi Penelitian Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan diperlakukan sesuai dengan etika penelitian. Hewan yang dipergunakan sebagai sumber semen adalah tiga ekor kambing jantan dewasa Peranakan Etawah (PE) dengan umur berkisar antara 2-3.5 tahun dengan bobot badan 40–50 kg. Ternak ditempatkan dalam kandang individu yang dilengkapi dengan tempat pakan dan minum. Pakan yang diberikan berupa hijauan rumput gajah segar 20% per bobot badan dan konsentrat 2% per bobot badan dengan pemberian dua kali dalam sehari, serta air minum yang diberikan secara ad libitum.
Syarat pejantan yang digunakan, yakni memiliki kualitas semen yang baik, dengan kriteria: motilitas lebih dari 70%, konsentrasi lebih dari 2500x106/mL dan abnormalitas tidak lebih dari 10%.
Peralatan dan Bahan Penelitian
Alat penampungan semen berupa: satu unit vagina buatan, alat evaluasi semen berupa: mikroskop, kamar hitung neubauer, gelas objek, gelas penutup, mikropipet, eppendorf, meja pemanas, mikro pipet dan pH indikator, dan alat pembuatan semen cair dan semen beku berupa: stirer, sentrifuse, tabung sentrifuse, pipet ukur, bulb, straw, kontainer nitrogen cair, dan siller. Bahan yang digunakan adalah buffer tris (hydroxymethyl aminomethane) yang terdiri dari: kuning telur, sari kedelai (PT. Melilea), trehalosa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), rafinosa (BDH Chemical Ltd Poole England), Gliserol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), dimethilformamida (DMF) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), milli-Q water dan nitrogen cair.
Prosedur Percobaan Penelitian ini dilaksanakan dalam dua bagian, yaitu :
1. Preservasi semen cair menggunakan pengencer tris-kuning telur dan tris-soya dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa.
Preservasi Semen Cair Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur dan Tris-soya dengan Suplementasi Trehalosa dan Rafinosa
Persiapan Media Pengencer
Pengencer kuning telur dan soya menggunakan dasar pengencer tris-buffer. Pembuatan buffer tris mengandung 2.98 g Tris-hydroxymethyl-aminomethane, 1.65 g asam sitrat monohidrat dan 2 g D-fruktosa. Ketiga bahan tersebut dilarutkan dalam 100 mL milli-Q water. Pengencer tris-soya terdiri atas 2.5% sari kedelai (Melilea (Lampiran 1)) dilarutkan dalam tris-buffer, sedangkan pengencer tris-kuning telur terdiri atas 20% kuning telur dilarutkan dalam tris-buffer kemudian kedua pengencer tersebut disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 447 x g dan bagian supernatannya diambil dan digunakan sebagai pengencer. Suplementasi dengan trehalosa atau rafinosa sebanyak 50 mM ditambahkan ke dalam pengencer tersebut.
Koleksi dan Evaluasi Semen
Penampungan semen dilakukan dengan menggunakan vagina buatan satu kali dalam seminggu dengan tiga kali penampungan masing-masing terdiri dari dua ejakulat (dua kali penampungan dalam satu periode penampungan).
Evalusi semen dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi makroskopis mencakup volume, warna, konsistensi dan pH.
- Volume
- Derajat keasamaan (pH): diukur menggunakan indikator pH. - Konsistensi: dibedakan antara kental dan sedang.
- Warna: dibedakan menjadi krem dan putih susu.
Kriteria kualitas semen yang baik adalah konsistensi kental dan berwarna krem.
Evaluasi secara mikroskopis meliputi gerakan massa, motilitas, konsentrasi, spermatozoa hidup, morfologi abnormalitas dan membran plasma utuh (MPU). - Gerakan massa: dibedakan berdasarkan kecepatan berpindahnya gerakan sperma
dengan klasifikasi sangat baik (+++) dan baik (++).
- Motilitas spermatozoa: persentase gerakan progresif individu dengan kriteria sangat baik (≥ 90%), baik (70-85%) dan sedang (<60-70%).
- Konsentrasi spermatozoa: menggunakan larutan formolsaline (Lampiran 2). Jumlah spermatozoa per mL dihitung dengan menggunakan kamar hitung
neubauer, hasilnya dikalikan 106 jumlah dari 5 kotak.
- Persentase spermatozoa hidup: menggunakan zat warna eosin-nigrosin (Lampiran 3). Spermatozoa dihitung minimal 200 sel berdasarkan perhitungan dari kira-kira 10 lapang pandang. Sperma yang hidup berwarna transparan dan yang mati berwarna merah pada bagian kepala.
- Membran plasma utuh (MPU) spermatozoa: menggunakan larutan hypoosmotic swelling test (HOS-test) (Lampiran 4). Membran plasma utuh ditandai dengan ekor spermatozoa yang melingkar, dan membran yang tidak utuh ditandai dengan ekor yang lurus (Lampiran 5). Spermatozoa dihitung minimal 200 sel berdasarkan perhitungan kira-kira dari 10 lapang pandang.
abnormalitas primer dan abnormalitas sekunder. Spermatozoa dihitung minimal 200 sel berdasarkan perhitungan kira-kira 10 lapang pandang.
Preservasi Semen
Semen segar dari ejakulat 1 dan 2 dipool menjadi satu dan dibagi menjadi enam bagian dan diencerkan masing-masing dengan pengencer yang berbeda (Tabel 2), dengan dosis inseminasi 50x106 per 0.2 ml. Semen yang telah diencerkan dikemas dalam tabung dan disimpan dalam lemari es (5°C). Kualitas semen yang diuji adalah motilitas progresif, persentase hidup dan membran plasma utuh dari spermatozoa, setiap 12 jam sampai motilitas spermatozoa 50%. Volume pengencer dihitung dengan dosis IB.
Tabel 2 Komposisi bahan pengencer semen cair dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa
Komposisi Pengencer Tris-kuning telur Tris-soya
Kontrol Tre Raf Kontrol Tre Raf
Tris buffer (mL) 8 8 8
Kuning telur (mL) 2 2 2
Sari kedelai (soya) (g) 0.25 0.25 0.25
Trehalosa (g) 0.17 0.17
Rafinosa (g) 0.29 0.29
Total (g/mL) 10 10 10
Total (mL/mL) 10 10 10
Antibiotik
Penisilin (µl/mL) 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Streptomisin (mg/mL) 1 1 1 1 1 1
Osmolaritas (mOsm/kg) 273 302 309 307 345 349
pH 6.40 6.40 6.40 6.40 6.40 6.40
Tre: trehalosa; Raf: rafinosa.
Kriopreservasi Semen Menggunakan Pengencer Tris-kuning telur Trehalosa dan Tris-soya Rafinosa dengan Penambahan Krioprotektan
Dimethilformamida(DMF) dan Gliserol Persiapan Media Pengencer
Pengencer tris-soya dengan suplementasi rafinosa dan tris-kuning telur dengan suplementasi trehalosa sebagai dasar dari penelitian semen cair ditambah dengan krioprotektan dimethilformamida (DMF) dan gliserol sebanyak 4% (v/v) (Tabel 3).
Kriopreservasi Semen
Syarat kualitas semen dibekukan antara lain adalah motilitas spermatozoa lebih dari 70%, konsentrasi lebih dari 2500 juta/mL dan abnormalitas kurang dari 10%.
mengunakan boks sterofoam. Semen beku tersebut disimpan dalam kontainer N2 cair
(-196oC) sampai dilakukan evaluasi.
Tabel 3 Komposisi bahan pengencer semen beku dengan suplementasi trehalosa dan rafinosa dengan tambahan krioprotektan dimethilformamida (DMF) dan gliserol
Komposisi Pengencer
Tris-kuning telur
trehalosa
Tris-soya rafinosa
DMF Gliserol DMF Gliserol
Tris Buffer (mL) 7.6 7.6
Gliserol (mL) 0.4 0.4
DMF (mL) 0.4 0.4
Kuning telur (mL) 2 2
Sari kedelai (soya) 0.25 0.25
Trehalosa (g) 0.17 0.17
Rafinosa (g) 0.29 0.29
Total (g/mL) 10 10
Total (mL/mL) 10 10
Penisilin (µl/mL) 1000 1000 1000 1000
Streptomisin (mg/mL) 1 1 1 1
Osmolaritas (mOsm/kg) 860 700 1210 1220
pH 6.40 6.40 6.40 6.40
DMF: dimethilformamida.
Kualitas semen hasil pembekuan diketahui dengan cara melakukan pencairan kembali (thawing) dengan air hangat bersuhu 37oC selama 30 detik, dengan melihat persentase motilitas progresif, persentase hidup mati dan keutuhan membran plasma dari spermatozoa.
Keberhasilan pembekuan juga dinilai dari recovery rate (RR), yaitu jumlah spermatozoa yang berhasil pulih dari proses pembekuan yang dihitung menurut Garner dan Hafez (2000) dengan rumus:
Rancangan Penelitian dan Analisis Data
Penelitian tahap I dan II dirancang dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial. Setiap perlakuan pada penelitian tahap I dan II terdiri dari tiga ulangan (semen dari tiga ekor kambing PE jantan dan setiap ulangan terdiri dari tiga sampel semen).
