vi
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 6
2.1. Piridoksin (vitamin B6) 6
2.2. Sumber dan sifat – sifat vitamin B6 7
2.3. Metabolisme dan Fungsi Biokimia Vitamin B6 7
2.4. Sistem Imun dan Sintesis Imunoglobulin Y (IgY) 11
2.5. Stabilitas IgY 16
2.6. Kebutuhan dan defesiensi piridoksin pada ayam 17
2.7. Serum 19
2.8. Hipotesis penelitian 21
BAB III METODOLOGI PENELITIAN 22
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian 22
3.2. Bahan Penelitian 22
3.3. Metodologi Penelitian 22
3.3.1. Rancangan Percobaan 22
3.3.2. Prosedur Penelitian 23
3.3.2.1.Pemeliharaan dan Pemberian Perlakuan pada Ayam 24
3.3.2.2.Pemisahan fraksi Albumin dan Globulin serum
Dengan metode penggaraman (Salting Out ) 25
3.3.2.3.Isolasi fraksi Immunoglobulin Y dengan metode
Kromatografi kolom Gel Sephadex G - 200 26
3.3.2.4.Isolasi fraksi Immunoglobulin Y dengan metode
Kromatografi kolom protein sepharos CL-4B 28
3.3.2.5.Identifikasi dan analisis fraksi Immunoglobulin dilakukan 29
Dengan Elektroforesis Gel Poliakrilamida terdenaturasi
3.3.2.6.Penentuan Kadar Immunoglobulin Y 32
vii
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 34
4.1. Hasil isolasi dan identifikasi Immunoglobulin Y(IgY) 34
4.2. Kadar IgY Serum 34
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 44
5.1. Kesimpulan 44
5.2. Saran 44
vi
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 6
2.1. Piridoksin (vitamin B6) 6
2.2. Sumber dan sifat – sifat vitamin B6 7
2.3. Metabolisme dan Fungsi Biokimia Vitamin B6 7
2.4. Sistem Imun dan Sintesis Imunoglobulin Y (IgY) 11
2.5. Stabilitas IgY 16
2.6. Kebutuhan dan defesiensi piridoksin pada ayam 17
2.7. Serum 19
2.8. Hipotesis penelitian 21
BAB III METODOLOGI PENELITIAN 22
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian 22
3.2. Bahan Penelitian 22
3.3. Metodologi Penelitian 22
3.3.1. Rancangan Percobaan 22
3.3.2. Prosedur Penelitian 23
3.3.2.1.Pemeliharaan dan Pemberian Perlakuan pada Ayam 24
3.3.2.2.Pemisahan fraksi Albumin dan Globulin serum
Dengan metode penggaraman (Salting Out ) 25
3.3.2.3.Isolasi fraksi Immunoglobulin Y dengan metode
Kromatografi kolom Gel Sephadex G - 200 26
3.3.2.4.Isolasi fraksi Immunoglobulin Y dengan metode
Kromatografi kolom protein sepharos CL-4B 28
3.3.2.5.Identifikasi dan analisis fraksi Immunoglobulin dilakukan 29
Dengan Elektroforesis Gel Poliakrilamida terdenaturasi
3.3.2.6.Penentuan Kadar Immunoglobulin Y 32
vii
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 34
4.1. Hasil isolasi dan identifikasi Immunoglobulin Y(IgY) 34
4.2. Kadar IgY Serum 34
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 44
5.1. Kesimpulan 44
5.2. Saran 44
ix
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1. Sifat dasar kelas Immunoglobulin 12
Tabel 3.1. Rincian Perlakuan Suplementasi Piridoksin 23
Pada Ayam Percobaan
Tabel 3.2. Perlakuan Sampel untuk SDS-PAGE 30
Tabel 3.3. Bahan kurva standar 33
Tabel 4.1. Nilai Rf pita protein analisis Elektroforesis 35
Tabel 4.2. Hasil absorbansi sampel 37
Tabel 4.3. Rataan hasil perhitungan kadar IgY dalam 38
satuan mg/100mL
Tabel 4.4. Daftar analisis ragam kadar IgY serum 39
viii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1. Struktur piridoksin, piridoksal, piridoksamin 6
Piridoksal posfat dan piridoksamin posfat
Gambar 2.2. Metabolisme vitamer – vitamer vitamin B6 pada 8
Pada sel hewan
Gambar 2.3. Proses pembentukan basa Schiff pada PLP 9
Gambar 2.4. Proses Metabolisme enzim piridoksal posfat 11
Gambar 2.5. Struktur immunoglobulin Y (IgY) 13
Gambar 2.7. Serum darah 19
Gambar 3.1. Diagram alir isolasi Fraksi Immunoglobulin serum 26
Dengan metode penggaraman (salting out )
Gambar 3.2. Diagram alir isolasi Fraksi Immunoglobulin Y 27
Dengan metode kromatografi kolom gel sephadex G-200
Gambar 3.3. Diagram alir isolasi fraksi Immunoglobulin Y 29
Dengan Metode kromatografi kolom protein Sepharos CL-4B
Gambar 3.4. Diagram alir Identifikasi dan analisis fraksi 31
Immunoglobulin dengan Elektroforesis Gel Poliakrilamida terdenaturasi (SDS-PAGE)
Gambar 4.1. Hasil Uji Elektroforesis (SDS-PAGE) 34
x
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Perhitungan jumlah piridoksin yang harus dicekokkan 48
Untuk ayam percobaan
Lampiran 2 Pembuatan gel elektroforesis SDS-PAGE 49
Lampiran 3 Perhitungan kadar IgY berdasarkan kurva standart 50
Lampiran 4 Pengolahan Data kadar IgY 54
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Upaya peningkatan sistem kekebalan tubuh terhadap serangan berbagai
virus atau antigen spesifik lainnya dewasa ini sangat perlu mendapat perhatian
serius. Biosintesis Immunoglobulin sebagai protein yang mempunya i aktifitas
antibodi untuk sistem kekebalan tubuh harus diupa yakan berlangsung secara
normal dengan terpenuhinya kecukupan koenzim yang dibutuhkan untuk
biosintesis tersebut. Pencegahan dan pengobatan berbagai jenis penyakit yang
ditimbulkan oleh mikroorganisme pathogen seperti virus dan bakteri, sangat perlu
mendapat perhatian dari seluruh lapisan masyarakat. pencegahan dapat dilakukan
melalui imunisasi aktif maupun imunisasi pasif. pencegahan dengan imunisasi
aktif dilakukan dengan cara memasukkan/menyuntikkan antigen tertentu kedalam
tubuh sehingga tubuh akan meresponnya dengan membentuk antibodi spesifik,
sedangkan imunisasi pasif dilakukan dengan cara mengkonsumsi bahan makanan
yang telah mengandung immunoglobulin /antibodi spesifik terhadap antigen
tertentu sehingga tubuh akan kebal terhadap serangan antigen tersebut.
Immunoglobulin merupakan protein yang mempunyai aktifitas antibodi. Protein
ini dihasilkan oleh sel – sel plasma sebagai akibat adanya interaksi antara limfosit
B peka antigen dengan antigen spesifik. Berdasarkan berat molekul dan sifat-
sifat kimianya maka dikenal lima kelas immunoglobulin yaitu IgG, IgM , IgA,
IgD dan IgE di mana setiap kelas berbeda dalam hal sus unan asam amino, berat
molekul sekaligus berbeda juga dalam hal sifat - sifat biologiknya (Kresno,1984).
Diantara tiga kelas Immunoglobulin ayam (IgA,IgM,IgY) yang analog
dengan mamalia, Immunoglobulin IgY merupakan Immunoglobulin yang tersedia
dalam jumlah banyak ditemukan dalam kuning telur dari pada serum , diturunkan
secara vertikal melalui telur dan berada dalam kuning telur ( Naraz 2003 ;
Gassman et al 1990),Rose & orlans 1981 dalam Rawendra (2005) menjelaskan
2
pertama,antibodi ditransfer dari serum kekuning telur dengan proses yang analog
dengan proses antibodi pada pada fetus melalui plasenta pada mamalia. Tahap
kedua, antibodi ditransfer dari kantung embrio kepada embrio yang sedang
berkembang. Keberadaan IgY dalam kuning telur mempunyai jarak 4 sampai 7
hari setelah antibodi dalam serum. (Carlender,2002).
Antibodi atau Imunoglobulin yang terbentuk dalam darah ayam sebagai
akibat paparan antigen tertentu, mudah ditransfer kedalam kuning telur dan
kemudian dikenal dengan nama Immuno globulin yolk (IgY). Ayam memiliki
sensitivitas tinggi terhadap protein asing sehingga dalam jumlah sedikit dapat
membangkitkan respon pembentukan antibodi (Carlender 2002 dalam Rawendra
2005).Titer antibody serum darah ayam dapat diperoleh dengan sekali vaksinasi,
namun untuk mendapatkan titer tertinggi dan dipertahankan selama lebih dari tiga
bulan, diperlukan imunisasi ulang/booster setiapa bulan (Wooley & London 1995
dalam Rawendra 2005). Berbagai penelitian telah berhasil memproduksi antibodi
atau immunoglobulin yolk (IgY) dengan memanfaatkan ayam sebagai pabrik
biologis untuk pengobatan dan pencegahan penyakit.
Salah satu upaya alternatif yang diduga dapat meningkatkan produksi
antibodi dalam serum ayam petelur adalah dengan cara pemberian suplementasi
piridoksin pada ayam petelur. Piridoksin atau vitamin B6 sebagai salah satu
vitamin yang larut dalam air, merupakan vitamin yang sangat penting dalam
proses metabolisme. Piridoksal posfat (PLP) sebagai bentuk aktif dari vitamin B6
merupakan koenzim yang serbaguna yang berperan untuk mengkatalisis berbagai
reaksi-reaksi metabolisme asam amino dan protein seperti reaksi-reaksi
transaminasi, dekarboksilasi, resemisasi,dan transsulfurasi. Salah satu peranan
piridoksin yang paling menarik adalah adanya fakta-fakta bahwa vitamin ini
berperan dalam aspek pembentukan sistem pertahanan tubuh terhadap invasi
mikroorganisme. Dari berbagai hasil penelitian telah diketahui bahwa kondisi
defisiensi piridoksin pada manusia dan berbagai spesies hewan menunjukkan
adanya kelainan-kelainan dalam system pertahanan tubuh. Total sel-sel
3
defisiensi piridoksin dibandingkan dengan keadaan normal (Kumar dan
Axelrod,1968;Debes dan Kirksey,1979;Biesel,1982). Kadar IgG dan IgM pada
subjek yang mengalami defisiensi piridoksin lebih rendah dibandingkan dengan
subjek yang diberi piridoksin dengan dosis normal dan berlebih (Silitonga,2008).
Berbagai penelitian tentang hubungan piridoksin dengan aspek kekebalan
tubuh pada hewan dan manusia telah dilaporkan. Total sel-sel pembentuk antibodi
pada tikus defisiensi piridoksin ternyata lebih sedikit dibandingkan dengan tikus
normal ( Kumar dan Axelrod, 1988). Jika induk tikus diberi ransum defisiensi
piridoksin semasa kehamilan dan laktasi, maka ditemukan bahwa jumlah limfosit
dan sel-sel pembentuk antibodi pada anak tikus tersebut lebih sedikit
dibandingkan dengan anak tikus yang induknya diberi ransum dengan tingkat
piridoksin yang normal (Debes dan Kirksey,1999). Hal ini didukung oleh hasil
penelitian Chen (2005) yang melaporkan bahwa pada kondisi defisiensi piridoksin
terjadi penurunan fungsi- fungsi immun pada kerang laut. Defisiensi piridoksin
pada hewan dan manusia , dapat menurunkan respon immun berperantara sel
(‘’cel mediated immune response’’) dan respon immun humoral terhadap berbagai jenis antigen ( Beisel, 1982). Penelitian tentang pengaruh suplementasi piridoksin
terhadap sistem kekebalan tubuh telah dilakukan Talbot (1997). Mereka
melaporkan bahwa suplementasi piridoksin pada manusia lanjut usia dapat
memperbaiki fungsi limfosit dan mensimulasi sistem kekebalan tubuh.
Studi tentang pengaruh piridoksin terhadap sintesis antibodi pada ayam
broiler telah dilakukan (Silitonga, 1992). Hasil penelitian menunjukkan bahwa
pemberian piridoksin berpengaruh terhadap titer HI (titer antibodi) dan kadar
globulin serum. Pemberian piridoksin dengan dosis 3,0 mg/kg ransum
memberikan kadar globulin paling tinggi. Penelitian selanjutnya menunjukkan
bahwa piridoksin berpengaruh nyata terhadap kadar imunoglobulin serum, kadar
DNA dan RNA organ Fabricus. Defisiensi piridoksin memberikan kadar
imunoglobulin yang paling tinggi dibandingkan dengan kelompok defisiensi
(Silitonga, 1996). Selanjutnya Silitonga (2008) telah mengidentifikasi adanya
4
maupun kelompok suplementasi. Fakta menunjukkan bahwa kadar IgG dan IgM
berbeda secara signifikan baik pada kelompok defisiensi, normal dan kelompok
suplementasi, dimana kadar IgG dan IgM pada subjek yang mengalami defisiensi
piridoksin lebih rendah dibandingkan dengan subjek yang diberi piridoksin
dengan dosis normal dan berlebih.
Menurut Carlender (2002) konsentrasi IgY kuning telur memiliki factor
perkalian 1,23 terhadap konsentrasi IgY serum. Menurut Toivanen dan Toivanen
(1987) dalam Simorangkir (1993) bahwa konsentrasi normal IgY dalam serum 5-7
mg/100 mL.Konsentrasi IgY serum ayam yang sedang mengeram adalah 2-3
mg/mL sedangkan pada kuning telurnya ditemukan 100-400 mg/mL (Kowalozyk
et al.1985 dalam Suartini 2005). Hasil yang diperoleh melalui penelitian yang
dilakukan Triwijayanti (2001), dimana konsentrasi IgY serum yang diperoleh
adalah 5,37 mg/ml dan sangat berbeda dibandingkan dengan Suartini (2005)
dengan konsentrasi IgY serum sebesar 0,9 mg/ml maupun paryati (2006) yang
memeperoleh kadar IgY sebesar 0,940 mg/ml. Adanya perbedaan hasil kadar IgY
yang diperoleh tersebut diduga disebabkan oleh perbedaan metode dan instrumen
yang digunakan. Metode purifikasi menggunakan kromatografi filtrasi gel dengan
kolom khusus IgY memberikan hasil pengukuran dengan konsentrasi IgY yang
rendah. Menurut Heytman (1995) apabila kemurnian suatu protein bertambah
maka konsentrasinya akan berkurang. Kemurnian suatu IgY tergantung dari
kemajuan metode yang digunakan.
Dengan adanya fakta- fakta tersebut diatas, diduga bahwa rendahnya
produksi IgY dalam serum ayam petelur maupun dalam kuning diakibatkan oleh
karena terganggunya proses biosintesis immunoglobulin sebagai dampak masih
kurangnya masukan piridoksin yang dikonsumsi oleh ayam petelur tersebut.
Penambahan masukan piridoksin pada ayam petelur dapat dilakukan melalui
teknik suplementasi. Berdasarkan hal tersebut diatas, penelitian ini dimaksudkan
untuk melihat apakah ada pengaruh suplemetasi piridoksin terhadap kadar IgY
serum ayam petelur. Hasil penelitian diharapakan akan diperoleh metode praktis
5
serum ayam petelur yang pada gilirannya akan dapat meningkatkan kadar IgY
pada kuning telur.
1.2. Rumusan Masalah
Dari uraian latar belakang masalah sebagaimana dikemukakan diatas, maka
disusun rumusan masalah dalam penelitian ini sebagai berikut:
1. Apakah ada pengaruh suplementasi piridoksin terhadap kadar
immunoglobulin Y (IgY ) serum ayam petelur?
2. Berapakah dosis piridoksin optimal yang harus disuplementasikan agar
diperoleh kadar IgY yang tertinggi pada serum ayam petelur?
1.3. Tujuan Penelitian
Adapun yang menjadi tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Untuk mengetahui apakah ada pengaruh suplementasi piridoksin terhadap
kadar immunoglobulin Y (IgY) serum ayam petelur.
2. Untuk mengetahui berapa dosis piridoksin optimal yang harus
disuplementasikan agar diperoleh kadar IgY yang tertinggi pada serum ayam
petelur.
1.4Manfaat penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan akan dapat bermanfaat :
1. Sebagai tambahan informasi bagi pengembangan ilmu tentang peranan
piridoksin terhadap biosintesis IgY pada ayam petelur.
2. Untuk meningkatkan produksi antibodi (IgY) pada ayam petelur.
3. Sebagai bahan masukan dan acuan bagi para pembaca, yang tertarik untuk
44
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1.Kesimpulan
1. Ada pengaruh suplementasi piridoksin terhadap kadar Immunoglobulin Y
(IgY) serum ayam petelur.dimana semakin tinggi piridoksin yang diberikan
maka Jumlah produksi immunoglobulin Y (IgY) yang terkandung dalam
serum ayam ransum secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan
produksi IgY kelompok yang tidak diberi suplementasi piridoksin maupun
yang diberi Suplementasi piridoksin dengan dosis 3,0 mg/kg ransum.
2. Rataan kadar IgY serum ayam petelur yang diberi suplementasi piridoksin
dengan dosis 0,0 mg/kg piridoksin, 3,0 mg/kg ransum dan 6,0 mg/kg ransum
berturut turut adalah 392,98 ±7,81 mg/100mL ; 458,13 ±6,00 mg/100mL dan 479,18 ±19,8 mg/100mL
5.2. Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai faktor- faktor yang
mempengaruhi tinggi rendahnya kadar IgY yang terdistribusi dalam serum
ayam petelur dengan melakukan pengembangan dan aplikasi metode dan
instrumentasi yang berbeda.
2. Perlu adanya pengembangan penelitian lebih lanjut dengan pemberian dosis
45
DAFTAR PUSTAKA
Babu, U.,Scot.,M.J.Myres.,M.Okamura.,D.Gaines.,H.F.Yancy., H.Lillehoj., RA. Heckert and RB. Raybourne.2003. Effects of live attenuated and killed salmonella vaccine on t- lymphocyte mediated immunity in laying
hens.Vet.Immun. And immunopathol.91 : 39-44
Beisel, W.R. 1992. Single nutrients and immunity.Am. J. Clin. Nutr.35: 417 -464.
Bogoyavlensky, AP.,V.E. Bersin and VP. Tolmachva. 1999.Immunogenicity of influenza glicoprotein with different forms of supramolecular organization in hens. Balt. J.lab. anim. Sci.44:99-105
Carlander, D. 2002. Avian IgY antibody, invitro and invivo. Dissertation.Acta Universitatis Upsaliensis. Upsala
Chen, H.,K.Ma, W.Zang, Z. Liufu, W. Xu, and B. Tan. 2005. Effects of dietary pyridoxine on immune responses in abalone, Haliotis discus hannai Ino. Fish & shellfish immunology. 19 (3):241-52
Conn, E.E.P.K.Stumf, G. Bruening and R.H. Doi. 1987. Outlines of Biochemistry. New York :John Weley dan Sons
Debes, S.A., and A Kirksey. 1999. Influence of dietary pyridoxine on selected immune capasities of rat dams and pups. J. Nutr.109: 744-250.
Djanah,D. 1991. Berternak Ayam. CV. Yasaguna, Surabaya.
Freed, M. (1966) Methods of vitamin Assay. New York: Inter- Science Publishers
Gries, C.L., and M.L. Scott. 1992. The pato logy of pyridoxine deficiency in chicks. J. Nutr. 102: 1259 – 1268.
Heard, G.S. and E.F. Annison (1986) Gastrointestinal absorption of vitamin B6 in the
Chicken (Gallus demseticus). J.Nutr.,116: 107-120
Heytman M.J.1995.Purifikasi immunoglobulin.Didalam : Artama WT,Penerjemah
;Burgess WG,editor,Teknologi ELISA Dalam Diagnosis dan
penelitian.Yogyakarta : UGM Press.Fakultas Kedokteran Hewan.
46
Ink, S.L., and L.M. Henderson (1984).Vitamin B6 Metabolism. Ann. Rev. Nutr.,
4:450-470
Kamelia.2005.Amonium sulfat.http://www.ns.ui.ac.id[4 Mei 2007].
Kermani, AV., T. Moll.,BR. Cho., WC.Davis and YS. Lu.2001.effects of IgY
antibodi on the development of marek’s disease. Avian Dis. 20: 32-41
Khare, M.L.,S Kumar and J. Gru.1996. immunoglobulins of the chicken antibody to newcastle Disease Virus (Muktewwar and F Strain). Polutry Sci.55-159.
Kresno, S.B 1984. Imunologi : Diagnosis dan prosedur Laboratorium. Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.
Kumar, M., and a.E. Axelrod. 1988. Cellular antibody Sythesis in Vitamin B6- deficient rats. J. Nutr. 96: 53-59
Lehninger , A.L., (1982) principles of Biochemistry. Worth Publisher, Inc
Li X., T. Nakano., HH. Sunwood., BH. Paek., HS. Chae and JS.Sim. 1998. Effects of egg and yolk weighst on yolk antibody (IgY) production in laying chickens Poult Sci. 77 : 266-270
Martin, D.W., P.A. Mayes, V.W. Rodwell and D.K. Granner., (1985). Harper’s
Review of Biochemistry. ( Alih Bahasa: Iyan Darmawan). Jakarta: penerbit E.G.C.
Moeljohardjo, D.S., 1988. Biokimia Umum II. Laboratorium Biokimia FMIPA –
Institut Pertanian Bogor
Paryati, SPY., IWT. Wibawan, RD.Soejoedono dan FH.Pasaribu. 2006. Immunoglobulin ayam sebagai anti – idiotipe terhadap rabies. J.Vet. 7 (3): 92-103
Scott, M.L., M.C., Neishem and R.J. Young., (1982) Nutrition of the chickens
(3 rded). Ithaca, New York : M.L. Scoot & Associates.
Silitonga, P.M. 1992. Pengaruh Piridoksin Terhadap Sintesis Antibodi Pada Ayam
47
Silitonga, P.M., M.Simorangkir dan M.Silitonga. 1996. Pengaruh Piridoksin
Terhadap Kadar Immunoglobulin, DNA dan RNA Pada Ayam Broiler , Laporan Hasil Penelitian Proyek PPTG-Dikti- Depdikbud.
Silitonga, P.M., dan M. Silitonga. 2008. Pengaruh piridoksin terhadap biosintesis
immunoglobulin G (IgG) dan immunoglobulin M (IgM), Jurnal
SainsIndonesia, 32 (42) 1-7
Silitonga,P.M. 2011. Statistik:Teori dan Aplikasi dalam Penelitian. Penerbit Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Medan, Medan
Simorangkir M.1993.Isolasi dan Identifikasi immunoglobulin gama (IgG) Serum ayam buras dan ayam ras dengan metode kromatografi pertukaran ion dan imunokimia [ TESIS].IPB:Program Pascasarjana,Institut Pertanian Bogor.
Soejoedono, RD., Z. hayati dan IWT. Wibawan. 2005. Pemanfaatan Telur Ayam Sebagai Pabrik Biologis: Produksi Yolk Immunoglobulin (IgY) anti plaque
dan diare dengan Titik Berat pada anti Strptococcus Mutan, Escherichia Coli
dan Salmonella Enteridis. Laporan RUT XII Kerja sama Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat IPB dengan Kementrian Riset dan Teknologi RI.
Suartha, IN., IWT. Wibawan., dan IBP. Darmono. 2006. Produksi immunoglobulin Y spesifik antitetanus pada ayam. J.Vet.7 (1); 21-28
Tizard , I.R. 1982. An Introduction to Veterinary Immunology.(M. Partodiredjo, cs).
Penerbit Universitas Airlangga, Surabaya.
Wahju, J. 1988. Ilmu Nutrisi Unggas. Gajahmada University Press,Yogyakarta
Weiss, F.G., and M.L. Scott. 1989. Influence of vitamin B6 upon reproduction and upon plasma and egg cholesterol in chickens. J. Nutr.109: 1010-1017
Yasin, S. 1988. Fungsi dan Peranan Zat – Zat Dalam Ransum Ayam Petelur.
