NAMA NIM
KELOMPOK KELAS ASISTEN
JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
PRELAB
Tanggal Praktikum Jumat, 28 April 2017
Praktikum 3.4 TEKNIK ENUMERASI LANGSUNG
1. Bagaimana cara menghitung mikroba secara langsung menggunakan haemocytometer? Sebutkan dan jelaskan tahapannya!
Haemocytometer memiliki 5 ruang hitung, dimana pada setiap ruang terdapat 16 kotak akan tetapi ruang hitung di bagian tengah terdapat 25 kotak. Sel yang mati yang berada pada batas luar sebelah atas dan berada di sebelah kanan tidak dihitung. Sedangkan sel yang berada pada batas kiri ikut dihitung (Gunasekaran, 2007). Untuk menghitung mikroba pada hemocytometer pertama dibersihkan kaca slide demgam air mengalir kemudian dibersihkan dengan tisu. Pembersihan ruang hitung bisa juga dilakukan dengan alcohol. Setelah itu, diletakkan gelas penutup diatas slide kemudian di jepit dengan penjepit kanan dan kiri. Disiapkan suspensi mikroba yang akan dihitung. Kemudian geser mikroba sebanyak 2 tetes kemudian di teteskan pada tepi gelas penutup. Suspense akan menyebar ke ruang hitung. Dibiarkan beberapa saat agar mikroba stabil. Diletakkan haemocytometer pada meja mikroskop dan dihitung jumlah sel (Harmita, 2008).
Pada perhitungan menggunakan rumus (Gunasekaran, 2007).
Jumlah sel / ml¿ jumlah sel rata−ratatiap petak ×1000× faktor pengenceran luas petak(m m2)×ked a laman petak(mm)
2. Apakah yang harus dilakukan, jika mikroba yang terlihat di Haemocytometer terlalu banyak? Jelaskan
dengan jumlah yang ditumbuhkan. Sedangkan jumlah koloni dapat dihitung dengan rumus jumlah koloni dikalikan dengan 1/faktor pengenceran (Cheesbrough, 2010).
3. Sebutkan ukuran kotak dalam haemocytometer dan tuliskan rumus yang digunakan untuk menghitung mikroba menggunakan haemocytometer
Haemocytometer adalah alat uang digunakan untuk menghitung koloni mikroba yang berupa slide kaca tebal berbentuk persegi panjang. Ruang hitung yang dipakai adalah ruang hitung yang memiliki garis improved Neubauer. Luas kotak pada ruang hitung secara keseluruhan adalah 9mm2. Ruang hitung tersebut dibagi lagi menjadi 9 kotak besar, jadi
masing-masing memiliki luas 1mm2. 9 ruang bidang tersebut masih dibagi lagi menjadi 16
bidang sedang dengan luas masing-masing bidang adalah ¼ mm2 x ¼ mm2. Untuk bidang
besar yang letaknya di tengah, bidang dibagi menjadi 25 kotak kecil dan kemudian 1 bidang tersebut dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Sehingga, jumlah kotak secara keseluruhan ada 400 kotak. Pada perhitungan menggunakan rumus (Harmita, 2007).
Jumlah sel / ml¿ jumlah sel rata−ratatiap petak ×1000× faktor pengenceran luas petak(m m2)× kedalaman petak
DIAGRAM ALIR
Nama
NIM
Kelas
Kelompo k
Penggunaan Haemocytometer
Haemositometer
Dibilas dengan aquades dan alkohol
Dikeringkan dengan tissue
Diteteskan kultur tepat pada petak haemocytometer
Ditutup dengan kaca penutup dengan kemiringan 450
Diletakkan pada meja mikroskop
Diamati dengan perbesaran paling rendah untuk menemukan petak perhitungan pertama
Diamati dengan perbesaran lebih tinggi untuk menentukan fokus
Dihitung jumlah tiap kotak
Dilakukan perhitungan dengan rumus
Hasil Suspensi kultur
S. cerevisiae
Digojog
TINJAUAN PUSTAKA
Kultur Saccharomyces cerevisiae
Mikroorganisme ini termasuk pada kingdom jamur dengan spesialisasi khamir dengan nama dagang ragi yang telah digunakan pada pembuatan tape singkong maupun tape ketan dan pembuatan wine (minuman beralkohol) yang ditambahkan pada bahan tersebut dalam kondisi anaerob membentuk etanol pada hasil reaksi yang memberikan sifat rasa asam
Saccharomyces cereviceae dapat diproduksi menjadi ragi, baik untuk pembuatan roti ataupun minuman beralkohol. Pada pembuatan roti digunakan S. Cereviceae yang memiliki sifat antara lain menghasilkan CO2 yang tinggi serta mampu menghasilkan tekstur roti yang
baik. Sementara pada proses fermentasi alkohol memiliki sifat antara lain penghasil etanol yang tinggi. Pada fermentasi menggunakan kultur murni diperlukan penyiapan inokulum secara khusus dan dibutuhkan biaya yang relatif tinggi (Restu, 2009).
Nama
NIM
Kelas
Kelompo k
PERTANYAAN
1. Tuliskan hasil pengamatan jumlah sel menggunakan Haemacytometer (Data Kelas) (Data ini adalah data 25 kotak besar)
a. Saccaharomyces cerevisiae umur 24 jam pengenceran 10-1
2 3 1 0 1
1 2 3 6 4
1 3 1 3 2
0 4 4 3 3
2 2 1 2 2
Perhitungan:
∑
sel rata−rata= jumlah totalmikroorganisme yang teramatijumlahkotak∑
sel rata−rata=5625=2,24∑
selml=∑
sel rata−rata x1000x fp luas petak(mm¿¿2)x kedalaman(mm)¿¿2,24×1000×10 −1
0,02×0,1
¿112.000sel/ml
Nama
NIM
Kelas
Kelompo k
b. Saccaharomyces cerevisiae umur 48 jam pengenceran 10-1 (Tukar Data)
39 0 0 0 0
31 42 69 81 85
51 47 50 103 63
43 58 59 86 87
23 52 42 72 77
Perhitungan:
∑
sel rata−rata= jumlah totalmikroorganisme yang teramatijumlahkotak∑
sel rata−rata=126025 =50,04∑
selml=∑
sel rata−rata x1000x fp luas petak(mm¿¿2)x kedalaman(mm)¿¿50,04×1000×10 −1
0,02×0,1
¿252.000selml
2. Hitunglah rata-rata jumlah sel serta jumlah sel dalam bahan/ml.
S. cerevisiae
24 jam
FP = 10
–1Rata-rata jumlah sel:
¿5625
= 2,24
Jumlah sel dalam bahan/ml:
∑
selml=
∑
sel rata−rata x1000x fpluas petak(mm2)x kedalaman(mm)
=
2,240,02x1000x0,01x10−1= 112.000 sel/ml
= 112 x 10
3sel/ml
S. cerevisiae
48 jam
FP = 10
-1Rata-rata jumlah sel:
=
126025= 50,4
Jumlah sel dalam bahan/ml =
∑
selml=
∑
sel rata−rata x1000x fpluas petak(mm2)x kedalaman(mm)
=
50,40,04x1000x0,01x10−1= 252.000sel/ml
Nama
NIM
Kelas
Kelompo k
3. Bahas data yang anda peroleh.
Dari data hasil pengamatan yang telah diperoleh, jumlah sel
per ml untuk kultur S. cerevisiae 48 jam adalah 252 x 103 sel/ml.
tiap petak kecil dikalikan kedalaman petak. Luas petak kecil adalah
sebesar 0,04 mm2 didapat dari 1
25x16=4001 , dan kedalaman standar
dari petak adalah 0,1 mm. Sehingga didapatkan hasil jumlah sel per ml untuk kultur S. cerevisiae 48 jam dengan faktor pengenceran 1
adalah sebesar 252 x 103 sel/ml.
Dari data hasil pengamatan tuker data yang telah diperoleh, jumlah sel per ml untuk kultur S. cerevisiae 24 jam adalah 112 x
103 sel/ml. Hasil ini didapatkan dari penghitungan sel tiap kotaknya
menggunakan mikroskop perbesaran 400x, seharusnya memakai perbesaran 40x terlebih dahulu namun media tersebut tidak terlihat jadi sukar untuk dihitung, maka praktikan langsung memakai perbesaran 400x sebab media tersebut tampak jelas di mikroskop sehigga mudah sekali untuk dihitung. Jumlah sel secara keseluruhan dari 25 petak adalah 56 sel dengan rata-rata jumlah sel tiap petak adalah 2,24. Hasil ini kemudian dimasukkan ke dalam rumus penghitungan jumlah sel per ml, yaitu rata-rata jumlah sel
dikalikan 1000 dikalikan faktor pengenceran yaitu sebesar 10-1
karena dilakukan pengenceran terlebih dahulu dengan perbandingan kultur : pepton adalah 1 : 9. Kemudian hasil tersebut dibagi dengan luas tiap petak kecil dikalikan kedalaman petak. Luas
petak kecil adalah sebesar 0,04 mm2 didapat dari 1
25x16=4001 , dan
kedalaman standar dari petak adalah 0,1 mm. Sehingga didapatkan hasil jumlah sel per ml untuk kultur S. cerevisiae 24 jam dengan
faktor pengenceran 10-1 adalah sebesar 112 x 103 sel/ml.
Dari percobaan serta pembahasan data diatas, didapatkan
bahwa jumlah sel per ml kultur S. cerevisiae pengenceran 10-1 48
Nama
pengenceran dengan 10-2 akan tetapi tidak tau kenapa kultur kami
ada yang salah, maka dari itu akhirnya kelompok kami meminjam haeocytometer kelompok lain dengan melakukan perhitungan sendiri.
4. Tuliskan kesimpulan yang anda peroleh pada praktikum ini!
Teknik enumerasi langsung ini merupakan teknik yang digunakan untuk menghitung jumlah sel mikroba secara langsung menggunakan haemocytometer dengan bantuan mikroskop. Prinsip dari teknik enumerasi langsung pada praktikum ini adalah menghitung jumlah sel dengan menggunakan mikroskop dengan bantuan haemocytometer. Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui dan menghitung jumlah sel yeast yang telah diinkubasi selama 24 jam dan 48 jam, sehingga dapat diketahui jumlah sel Saccaharomyces cerevisiae per ml. Dalam haemocytometer terdapat 9 kotak besar dan 1 kotak besar terdiri dari 25 kotak sedang dan 1 kotak sedang terdiri dari 16 kotak kecil.
Dari data hasil percobaan diatas, dapat disimpulkan bahwa kultur Saccaharomyces cerevisiae yang berumur 24 jam menghasilkan
jumlah sel sebanyak 112 x 103 sel per ml lebih sedikit dari kultur
Saccaharomyces cerevisiae yang berumur 48 jam yang hanya
menghasilkan jumlah sel sebanyak 252 x 103 sel per ml.
5. Sebutkan kelebihan dan kelemahan dalam penghitungan mikroba menggunakan haemocytometer!
Menurut (Adds, 2008) kelemahan dan kelebihan menggunakan teknik enumerasi langsung sebagai berikut
Kelebihan :
3. Hasil yang diperoleh mudah langsung didapat setelah dimasukkan dalam rumus
4. Dapat digunakan apabila data yang diinginkan harus cepat diperoleh
Kekurangan :
1. Hasil yang didapatkan kurang akurat karena setiap pengamatan memiliki daya hitung berbeda dan juga cara menghitung yang berbeda tiap orang maka hasil yang didapatkan bersifat subyektif. 2. Tidak dapat membedakan sel yang mati karena semua yang
terlihat akan dihitung.
3. Alat yang digunakan mudah rusak sehingga menggunakannya harus berhati hati dalam melakukan praktikum.
6. Jika pada pengamatan sel menggunakan haemocytometer diperoleh data sebagai berikut, hitunglah jumlah sel yeast per ml bahan!
No. Petak Jumlah sel No. petak Jumlah sel
bantuan haemocytometer. Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui dan menghitung jumlah sel yeast yang telah diinkubasi selama 24 jam dan 48 jam, sehingga dapat diketahui jumlah sel Saccaharomyces cerevisiae per ml. Dalam haemocytometer terdapat 9 kotak besar dan 1 kotak besar terdiri dari 25 kotak sedang dan 1 kotak sedang terdiri dari 16 kotak kecil.
Dari data hasil percobaan diatas, dapat disimpulkan bahwa
kultur Saccaharomyces cerevisiae yang berumur 24 jam
menghasilkan jumlah sel sebanyak 251 x 103 sel per ml lebih sedikit
dari kultur Saccaharomyces cerevisiae yang berumur 48 jam yang
hanya menghasilkan jumlah sel sebanyak 250 x 103 sel per ml. Dari
percobaan serta pembahasan data diatas, didapatkan bahwa jumlah
sel per ml kultur S. cerevisiae pengenceran 10-1 48 jam lebih sedikit
dari pada yang 24 jam. Hal ini tidak sesuai dengan literatur mungkin dikarenakan waktu inkubasi terlalu lama dari S. cerevisiae , tidak memperhatikan suhu serta pHnya optimalnya pada media yang tetap adalah + 20 jam, dan humen error . Seharusnya kelompok
kami melakukan pengenceran dengan 10-2 akan tetapi tidak tau
Nama
NIM
Kelas
Kelompo k
Komponen Penilaian :
Jenis Penilaian Nilai
Maksimal
Nilai yang diperoleh
Diagram Alir 10
Data Hasil Pengamatan 10
Pembahasan laporan 70
Kesimpulan 10
TOTAL 100
Kompetensi Mahasiswa dan Nilai Maksimal Tiap Kompetensi
No Kompetensi Bisa Tidak
1. Mampu membuat preparat untuk enumerasi langsung
2. Mampu menentukan petak yang digunakan pada pembacaan haemocytometer
3. Mampu menghitung jumlah mikroba menggunakan haemocytometer
4. Mampu menghitung jumlah mikroba per ml bahan
ANALISA PROSEDUR
Nama dapat tersebar atau tercampur secara merata ke seluruh larutan karena pada tabung reaksi tempat penumbuhan S. cerevisiae selalu terdapat endapan kultur dibawah tabung reaksi, sebelum diambil S. cerevisiae divortex terlebih dahulu lalu diambil larutannya sebanyak 1 ml, caranya yaitu nyalakan bunsen dengan menggunakan korek, pegang tabung reaksi berisi kultur yang telah divortex di tangan kiri dan mikropipet yang telah disterilisasi dengan menggunakan alkohol dan pada ujungnya telah terpasang mikrotip 1 ml di tangan kanan, kemudian membuka sumbat kapas tabung reaksi dengan cara menjepit sumbat menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan lalu ditarik, setelah sumbat kapas dilepaskan, mulut tabung reaksi dipanasi sebentar pada atas api bunsen, kemudian tombol pada ujung atas mikropipet ditekan separuh dan mikropipet dimasukan ke dalam tabung reaksi kultur hingga seperempat mikrotip, tombol kemudian dilepaskan dan mikropipet dikeluarkan, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar sekali lagi dan selanjutnya ditutup kembali dengan menggunakan sumbat kapas dan diletakkan di rak tabung. Tabung reaksi lain yang berisi pepton dengan label 1 dipegang dengan menggunakan tangan kanan, sumbat kapas penutupnya dibuka, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar di atas bunsen, mikropipet selanjutnya dimasukkan setengah tabung reaksi, tombol pada ujung atas ditekan penuh hingga semua cairan di dalam mikrotip keluar, mikropipet dikeluarkan dari tabung reaksi, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar sekali lagi kemudian ditutup dengan menggunakan sumbat kapas dan diletakkan di rak tabung sehingga didapatkan S. cerevisiae 24 jam dengan
pengenceran 10-1, mikrotip pada ujung mikropipet dilepaskan dan
dipisahkan di dalam gelas beker.
yang telah divortex di tangan kiri dan mikropipet yang telah disterilisasi dengan menggunakan alkohol dan pada ujungnya telah terpasang mikrotip 1 ml di tangan kanan, kemudian membuka sumbat kapas tabung reaksi dengan cara menjepit sumbat menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan lalu ditarik, setelah sumbat kapas dilepaskan, mulut tabung reaksi dipanasi sebentar pada atas api bunsen, kemudian tombol pada ujung atas mikropipet ditekan separuh dan mikropipet dimasukan kedalam tabung reaksi larutan 24 jam (FP 1) hingga seperempat mikrotip, tombol kemudian dilepaskan dan mikropipet dikeluarkan, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar sekali lagi dan selanjutnya ditutup kembali dengan menggunakan sumbat kapas dan diletakkan di rak tabung. Tabung reaksi lain yang berisi pepton dengan label 24 jam (FP 1) dipegang dengan menggunakan tangan kanan, sumbat kapas penutupnya dibuka, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar diatas bunsen, mikropipet selanjutnya dimasukkan setengah tabung reaksi, tombol pada ujung atas ditekan penuh hingga semua cairan didalam mikrotip keluar, mikropipet dikeluarkan dari tabung reaksi, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar sekali lagi kemudian ditutup dengan menggunakan sumbat kapas dan diletakkan di rak tabung sehingga didapatkan S. cerevisiae 24 jam dengan pengenceran 1, mikrotip pada ujung mikropipet dilepaskan dan dipisahkan didalam gelas beker. Setelah itu, hasil pengenceran 24 jam 1 divortex terlebih dahulu sebelum diamati pada alat haemocytometer gunanya untuk agar larutan tersebut tercampur secara merata.
Kemudian lakukan pengenceran 48 jam 10-1, mula-mula tabung reaksi
Nama kelingking dan jari manis tangan kanan lalu ditarik, setelah sumbat kapas dilepaskan, mulut tabung reaksi dipanasi sebentar, kemudian tombol pada ujung atas mikropipet ditekan separuh dan mikropipet dimasukan kedalam tabung reaksi kultur hingga seperempat mikrotip, tombol kemudian dilepaskan dan mikropipet dikeluarkan, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar sekali lagi dan selanjutnya ditutup kembali dengan menggunakan sumbat kapas dan diletakkan di rak tabung. Tabung reaksi
lain yang berisi pepton dengan label 10-1 dipegang dengan menggunakan
tangan kanan, sumbat kapas penutupnya dibuka, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar diatas bunsen, mikropipet selanjutnya dimasukkan setengah tabung reaksi, tombol pada ujung atas ditekan penuh hingga semua cairan didalam mikrotip keluar, mikropipet dikeluarkan dari tabung reaksi, mulut tabung reaksi dipanaskan sebentar sekali lagi kemudian ditutup dengan menggunakan sumbat kapas dan diletakkan di rak tabung
sehingga didapatkan S. cerevisiae 48 jam dengan pengenceran 10-1,
mikrotip pada ujung mikropipet dilepaskan dan dipisahkan didalam gelas
beker. Setelah itu, hasil pengenceran 48 jam 10-1 divortex terlebih dahulu
sebelum diamati pada alat haemocytometer gunanya untuk agar larutan tersebut tercampur secara merata.
Nama
NIM
Kelas
Kelompo k
cahaya yang diinginkan serta titik dimana perhitungan sampel kultur akan dimulai berupa pojok, batas-batas antar kotak kecil (16) adalah berupa 1 garis tipis, batas-batas antar kotak besar (25) adalah 3 garis tipis, dan batas antara kotak besar dengan sisi luar adalah 3 garis tipis yang setelahnya tidak terdapat garis vertikal maupun horizontal lagi. Untuk menentukan pojokkan dapat diatur dengan menggunakan pengatur vertikal horizontal yang terhubung ke meja preparat. Setelah dirasa pas, kemudian pupil cam yang telah terhubung pada perangkat laptop dan proyektor dipasangkan pada mikroskop dengan cara melepaskan salah satu lensa okuler dan menggantikannya dengan menggunakan pupil cam sehingga sampel kultur yang diamati dapat dihitung dengan mudah dengan cara mengular agar memudahkan pendataan.
Untuk pengamatan sampel larutan 48 jam 10-1, Pertama terlebih
dahulu mensterilisasi haemocytomer dan cover glassnya, cara yang dilakukan adalah memegang haemocytometer dengan erat dan kuat namun tetap berhati-hati, membilas haemocytometer dengan menggunakan aquades pada kedua permukaannya, dibersihkan dengan menggunakan tisu secara searah supaya tidak lecet dipermukaannya karena dapat mempengaruhi hasil, menyemprotkan alkohol 70% ke haemocytometer pada kedua permukaanya, alkohol disemprotkan untuk melarutkan zat-zat organik seperti karbohidrat, lemak dan protein serta kultur yang mungkin masih menempel pada permukaan haemocytometer, kembali dibersihkan dengan menggunakan tisu kering baru secara searah dan kemudian diletakkan ditisu bersih yang telah disediakan. Selanjutnya adalah mensterilisasi cover glass haemocytometer dengan cara yang sama seperti saat mensterilisasi haemocytometernya. Setelah disterilisasi
tabung reaksi 48 jam dengan pengenceran 10-1 dipegang ditangan kiri dan
diatas api bunsen, pipet tetes kemudian dimasukkan untuk mengambil
sampel larutan kultur 48 jam dengan pengenceran 10-1, larutan yang berisi
Nama
NIM
Kelas
Kelompo k
DAFTAR PUSTAKA
Cheesbrough, M. 2010. District Laboratory Practice in Tropical Countries. Cambridge: Cambridge University Press
Gunasekaran, P. 2007. Laboratory Manual in Microbiology. New Delhi: New Age International (P) Limited
Harmita, 2008. Buku Ajar Analisis Hayati. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC