TM LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM T

(1)

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI UMUM

TEKNIK ISOLASI, KULTIVASI DAN PRESERVASI KULTUR

NAMA ANNISA MEYLANA I

NIM 165100107111041 KELOMPOK QE-6

KELAS D

ASISTEN

`

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

(2)

PRELAB

Praktikum 2.2 TEKNIK ISOLASI, KULTIVASI dan PRESERVASI KULTUR

1. Mengapa dalam teknik isolasi goresan kuadran, cawan petri harus dibagi menjadi beberapa kuadran? Jelaskan!

Untuk mendapatkan kultur murni berupa koloni tunggal. Daerah inokulasi awal dan hasil gores pertama tumbuh padat. Luas beruntun kedua dari daerah 1 hasil memberikan pertumbuhan yang kurang padat. Luas beruntun ketiga dari area 2 yang menghasilkan pertumbuhan yang lemah atau sedikit. Luas beruntun keempat dari area 3 yang menghasilkan koloni tunggal (Alfred, 2011).

2. Apa tujuan dari teknik isolasi dalam dunia mikrobiologi?

Isolasi dalam mikrobiologi merupakan suatu usaha yang dilakukan untuk menumbuhkan mikroba di tempat yang bukan lingkungan alamiahnya. Penumbuhan mikroba di tempat yang bukan lingkungannya ini pada prinsipnya adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan jenis mikroba lainnya. Sehingga dapat disimpulkan bahwa tujuan teknik isolasi dalam dunia mikrobiologi adalah untuk memperoleh biakan mikroba yang tidak tercampur dengan mikroba lainnya (Sumarsih, 2011).

3. Apa tujuan transfer kultur pada agar miring? Jelaskan!

Digunakan untuk membiakan mikroba yang bersifat aerobik atau anaerobik fakultatif. Ciri-ciri kultur termasuk pembentukan warna dan bentuk pertumbuhannya dapat segera diamati di agar miring (Alfred, 2011).

4. Apa tujuan dari sub kultur dalam transfer kultur ?

Apabila kebutuhan nutrisi mikroba pada media tidak dapat atau kurang terpenuhi, maka perlu dilakukan sub kultur. Tujuan dari transfer sub kultur dalam transfer kultur yaitu supaya kebutuhan nutrisi kultur dapat terpenuhi. Dengan terpenuhinya nutrisi, maka kultur dapat tumbuh dan berkembang biak dengan baik (Alfred, 2011).

5. Ada berapa macam teknik Isolasi? Sebutkan dan jelaskan masing-masing teknik tersebut!

o Metode Streak Plate atau metode gores adalah dengan cara menggoreska ose kultur pada media padat. Tujuannya adalah untuk mendapatkan koloni terisolasi dari inokulum dengan menciptakan bidang peningkatan cairan di piring tunggal. Koloni terisolasi merupakan tiruan dari sel, yang berasal dari sel prekursor tunggal. Ketika media kultur yang diinokulasi menggunakan koloni terisolasi tunggal, kultur yang dihasilkan tumbuh dari klon tunggal kultur murni (Pelczar, 2008).

(3)

Nama Annisa Meylana I bahwa koloni yang tertanam akan jauh lebih kecil daripada mereka yang kebetulan berada di permukaan, dan harus secara hati-hati sehingga tidak ada yang diabaikan. Juga, wajib anaerob sehingga bakteri dapat tumbuh jika tertanam dalam agar-agar (Pelczar, 2008).

o Metode Spread Plate atau metode permukaan adalah metode penyebaran suspensi bakteri secara merata di atas permukaan agar-agar menggunakan batang kaca steril atau spreader sebagai perangkat penyebar (Pelczar, 2008).

6. Bagaimana cara transfer kultur dari medium cair ke agar tegak? Jelaskan!

Masukkan ose ke dalam tabung yang berisi media cair dan ambil satu ose kultur dan pastikan ada media yang terambil pada loop ose. Masukkan ose yang mengandung media ke dalam tabung yang berisi media agar tegak. Ose yang mengandung mikroba ditusukkan

pada media agar tepat pada bagian tengah hingga 1

4 ¼ dasar media, lalu tariklah ose dari media agar secara tegak ke atas (Pommerville, 2011).

7. Faktor apa sajakah yang perlu diperhatikan dalam proses kultivasi mikroba? Jelaskan!

o Temperatur

Setiap mikroba hidup dengan temperatur yang berbeda, sehingga temperatur sangat mempengaruhi pertumbuhan mikroba. Mikroba yang dapat tumbuh pada temperatur 0 C-20 C disebut mikroba yang bersifat psikofilik. Mikroba yang dapat tumbuh padaᵒ ᵒ

temperatur 20 C-45 C disebut mikroba yang bersifat mesofilik. Sedangkan mikrobaᵒ ᵒ

yang dapat hidup pada temperatur 45 C- 80 C disebut mikroba yang bersifat termofilikᵒ ᵒ

(Sanfa, 2011). o Kadar Oksigen

Mikroba dapat hidup dengan kadar oksigen yang berbeda-beda. Mikroba yang tergolong mikroba aerobik, untuk hidup ia memerlukan oksigen. Mikroba anaerobik tidak memerlukan oksigen molekuler untuk tetap bertahan hidup. Mikroba anaerobik fakultatif dapat hidup meskipun ada atau tidak ada oksigen. Mikroba mikroaerofilik dapat tumbuh apabila terdapat sedikit oksigen atmosferik. Sedangkan mikroba anaerobik obligat akan mati apabila dalam media tumbuhnya terdapat oksigen (Sanfa, 2011). o pH

pH sangat memengaruhi pertumbuhan mikroba, karenaa pH sangat menentukan aktivasi enzim. Pertumbuhan kebanyakan mikroba adalah pada pH 6,5 sampai pH 7,5. Namun beberapa dapat tumbuh dalam keadaan sangat asam atau sangat alkali (Sanfa, 2011). o Tekanan Osmosis

(4)

Nama Annisa Meylana I

o Freezing atau pembekuan merupakan metode preservasi mikroorganisme yang paling sederhana dan paling umum. Untuk pembekuan biasa tidak diperlukan alat khusus. Meskipun perlu ditambahkan cryoprotective agent untuk mendapatkan hasil yang memuaskan dengan metode pembekuan tersebut. Selain itu, suhu penyimpanan harus tetap dijaga dibawah -20°C (Sumarsih, 2011).

o Freeze – drying meliputi pemindahan air dari larutan sel yang beku dengan sublimasi dengan tekanan rendah. Cara ini merupakan metode paling efektif untuk preservasi mikroorganisme dalam waktu lama. Media yang digunakan adalah skim milk powder 20% (wt/vol) atau sukrosa 12% (wt/vol). Sebagian besar mikroba dapat bertahan dalam media preservasi liofilisasi selama 10 tahun, selain itu untuk pemindahan tidak perlu untuk ditumbuhkan lagi dalam agar miring atau dicairkan (Sumarsih, 2011).

o Subculturing yaitu dengan cara memindahkan kultur ke media agar segar secara periodik, kemudian diinkubasikan pada suhu yang sesuai untuk pertumbuhannya. Metode ini tidak menyusahkan dan tidak mahal, serta tidak memerlukan peralatan khusus. Kultur pada agar miring harus disimpan dalam lemari pendingin (5°C) dalam wadah tertutup untuk menghindarkan dari kekeringan dan meminimalkan aktivitas metabolismenya. Cara ini tidak sesuai untuk pemeliharaan strain dalam waktu lama (Sumarsih, 2011).

(5)

DIAGRAM ALIR

Nama Annisa Meylana I NIM 165100107111041

Kelas D

Kelompo k

QE-6

1. Metode Streak Plate Goresan Kuadran

Cawan berisi media

Dibuat pembagian sektor 4 kuadran

Dipijarkan ose

Diambil 1 ose kultur dari agar miring (aseptis)

Digoreskan secara zig-zag di permukaan agar sektor 1

Digoreskan secara zig-zag dari sektor 2 ke 3 dan 3 ke 4

Diberi label cawan petri

Diinkubasi suhu 30°C selama 48 jam

Hasil

2. Metode Spread Plate

Sampel

Diencerkan

Diambil suspensi sampel 0,1 ml

Diinokulasikan pada cawan yang berisi media agar padat

Diratakan sampel pada permukaan agar dengan spreader

Diberi label cawan petri

Hasil

(6)

Kelas D

Kelompo k

QE-6

Sampel

Diambil suspensi sampel 1 ml

Diinokulasikan pada cawan

Dituangkan medium agar steril bersuhu 40-50°C

Diputar mengikuti pola angka delapan

Hasil

4. Transfer Kultur dari Tabung Reaksi ke Tabung Reaksi a. Medium Agar Miring ke Medium Agar Miring

Sampel

Ose dipijarkan

Diambil 1 ose kultur dari tabung reaksi media agar miring

Diinokulasikan pada tabung reaksi berisi agar miring secara zig-zag dari bawah ke atas

Hasil

b. Medium Agar Miring ke Medium Agar Tegak

(7)

Kelas D

Kelompo k

QE-6

Dipijarkan ose

Diambil 1 ose kultur dari tabung reaksi media agar miring

Diinokulasikan pada tabung reaksi berisi agar tegak dengan menusuk tepat ¼ bagian dasar media

Hasil

c. Medium Agar Miring ke Medium Broth

Sampel

Dipijarkan ose

Diambil 1 ose kultur dari tabung reaksi berisi media agar miring

Diinokulasikan ke dalam tabung berisi media broth

Hasil

5. Teknik Preservasi Kriogenik

(8)

Kelas D

Kelompo k

QE-6

Dibuat larutan stok gliserol konsentrasi 60%

Dimasukan 0,5 ml kultur dan 0,5 ml gliserol tube steril

Divortex

Dibekukan suhu (-80°C)

(9)

DAFTAR PUSTAKA

Alfred, Brown E. 2011. Benson's Microbiological Applications 9th Ed. New York: McGraw Hill

Pelczar, Michael J. 2008. Dasar-dasar Mikroorganisme. Jakarta: Universitas Indonesia Press Pommerville, J.C. 2011. Alcamo’s Laboratory Fundamental of Microbiology. Burlington:

Jones and Bartlett Learning

Sanfa. 2011. Mikrobiologi Dasar. Malang: Penerbit Universitas Muhammadiyah Sumarsih. 2011. Mikrobiologi Umum. Jakarta: UI Press

1. Gambarlah bentuk pertumbuhan kultur yang saudara transfer pada agar miring!

Asal Isolat : Bacillus subtilis Asal Isolat : Lactobacillus casei

Keterangan : Spreading, tidak kontaminasi Keterangan : Echinulate, tidak kontaminasi

2. Gambarlah bentuk pertumbuhan kultur yang saudara transfer pada agar tegak!

(10)

Keterangan : Filiform, tidak kontaminasi Keterangan : Filiform, tidak kontaminasi

3. Gambarlah bentuk pertumbuhan kultur yang saudara transfer pada agar cair!

Keterangan : Keterangan :

4. Bandingkan pertumbuhan kultur yang anda lakukan pada agar tegak, agar miring, dan media cair.

QE6

Tipe media yang digunakan

Nama Media Pertumbuhan (+) atau (-)

Kontaminasi (+) atau (-)

Agar Tegak NA +

-Agar Miring NA +

-Broth NB +

-QE3

Tipe media yang digunakan

Nama Media Pertumbuhan (+) atau (-)

Kontaminasi (+) atau (-)

Agar Tegak MRSA +

-Agar Miring MRSA +

-Mengendap, tidak kontaminasi

(11)

Broth MRSB +

-5. Bahas data yang anda peroleh pada ketiga media yang digunakan!

Untuk media Bacillus subtilis yang diionokulasi pada media agar miring pertumbuhannya baik. Terbentuk banyak koloni yang ditandai dengan tebalnya mikroba yang terdapat pada goresan zig zag Bacillus subtilis yang tumbuh pada media agar miring sangat banyak karena pada permukaan agar miring terdapat oksigen, karena Bacillus

subtilis merupakan mikroorganisme aerob fakultatif yang membutuhkan oksigen untuk

metabolisme mikroorganisme itu sendiri. Adanya oksigen pada permukaan media agar miring mengakibatkan Bacillus subtilis yang tumbuh pada media agar miring menjadi banyak karena lingkungan tersebut sesuai dengan kondisi yang disukai mikroba Bacillus

subtilis untuk tumbuh. Pada media agar miring koloni Bacillus subtilis tidak ditemukan

kontaminasi oleh koloni mikroorganisme lain. Sedangkan untuk mikroorganisme Bacillus

subtilis yang diinokulasi pada agar tegak, Bacillus subtilis yang tumbuh sedikit yaitu

hanya pada wilayah sekitar tempat jarum ose ditusukkan pada media agar tegak. Bacillus

subtilis dapat tumbuh disekitar bekas ose ditusukkan karena lubang tersebut terdapat

oksigen yang mendukung pertumbuhan dari Bacillus subtilis.

subtilis dapat tumbuh disekitar bekas ose ditusukkan karena lubang tersebut terdapat

oksigen yang mendukung pertumbuhan dari Bacillus subtilis. Pada media agar tegak tersebut tidak ditemukan adanya kontaminasi oleh mikroorganisme lain karena tidak ditemukan titik koloni lain. Karakteristik pertumbuhan koloni pada media agar tegak tersebut adalah villose dan berbentuk tegak miring. Untuk mikroorganisme Bacillus

subtilis yang diinokulasi pada media broth, Bacillus subtilis yang tumbuh berada pada

bagian bawah media dan mengendap. Bacillus subtilis merupakan mikroorganisme aerob fakultatif, hal tersebut yang menyebabkan Bacillus subtilis dapat memanfaatkan oksigen disekitarnya untuk tumbuh, tetapi Bacillus subtilis juga termasuk organisme anaerob karena mereka mampu tidak menggunakan oksigen sebagai terminal elektrob acceptor. Pada media broth Bacillus subtilis mampu hidup mengendap pada bagian bawah media. Karakteristik pertumbuhan koloni pada media broth tersebut adalah mengendap, dan tidak ditemukan adanya kontaminasi oleh mikroorganisme lain (Pablo,2012).

Untuk media L. casei yang diionokulasi pada media agar miring pertumbuhannya baik. Terbentuk koloni yang ditandai dengan mikroba yang terdapat pada goresan zig zag

L. casei yang tumbuh pada media agar miring banyak karena pada permukaan agar

miring terdapat oksigen, karena L. casei merupakan mikroorganisme anaerob yang tidak membutuhkan oksigen untuk metabolisme mikroorganisme itu sendiri. Adanya oksigen pada permukaan media agar miring mengakibatkan L. casei tidak tumbuh pada media agar miring karena lingkungan tersebut tidak sesuai dengan kondisi yang disukai mikroba

L. casei untuk tumbuh. Pada media agar miring koloni L. casei tidak ditemukan

kontaminasi oleh koloni mikroorganisme lain. Sedangkan untuk mikroorganisme L. casei

(12)

disekitaran bekas ose ditusukkan karena lubang tersebut terdapat oksigen yang tidak mendukung pertumbuhan dari L. casei. Jadi mikroorganisme L. casei tidak tumbuh pada tempat setelah ditusukkannya jarum, dan tumbuh disekitaran tempat jarum ose ditusukkan. Pada media agar tegak tersebut tidak ditemukan adanya kontaminasi oleh mikroorganisme lain karena tidak ditemukan titik koloni lain. Karakteristik pertumbuhan koloni pada media agar tegak tersebut adalah echinulate dan berbentuk tegak. Untuk mikroorganisme L. casei yang diinokulasi pada media broth, L. casei yang tumbuh berada pada bagian bawah media dan mengendap. L. casei merupakan mikroorganisme anaerob, tetapi L. casei juga termasuk organisme anaerob karena mereka mampu tidak menggunakan oksigen sebagai terminal elektron acceptor. Pada media broth L. casei

mampu hidup mengendap pada bagian bawah media. Karakteristik pertumbuhan koloni pada media broth tersebut adalah mengendap, dan tidak ditemukan adanya kontaminasi

6. Gambar bentuk sel-sel mikroba yang saudara isolasi pada cawan petri dengan pensil warna!

Streak

Keterangan : Keterangan : Tidak terkontaminasi, small, circular, berkerut, lobate

(13)

Spread

Keterangan : Keterangan :

7. Pilihlah salah satu koloni yang terpisah, jelaskan ciri-ciri nya (lihat Gb. 8 modul praktikum) dan identifikasi bakteri tersebut.

a. Spread QE6

Bentuk Pertumbuhan Koloni Keterangan Bentuk dari atas Irregular Tidak kontam Bentuk dari pinggir Lobate Tidak kontam Bentuk penonjolan Kasar Tidak kontam Ukuran koloni Large Tidak kontam Warna Koloni Putih Tidak kontam

b. Streak QE6

Bentuk Pertumbuhan Koloni Keterangan Bentuk dari atas Irregular kontam Bentuk dari pinggir Lobate kontam Bentuk penonjolan Kasar kontam

Ukuran koloni Medium kontam

Warna Koloni Putih kontam

c. Spread QE3

Bentuk Pertumbuhan Koloni Keterangan Bentuk dari atas Irregular Tidak kontam Bentuk dari pinggir Serate Tidak kontam Bentuk penonjolan Kasar Tidak kontam

Tidak terkontaminasi, large,

(14)

Ukuran koloni Point Tidak kontam Warna Koloni Putih Tidak kontam

d. Streak QE3

Bentuk Pertumbuhan Koloni Keterangan Bentuk dari atas Circullar Tidak kontam Bentuk dari pinggir Lobate Tidak kontam Bentuk penonjolan Berkerut Tidak kontam Ukuran koloni Small Tidak kontam Warna Koloni Putih Tidak kontam

8. Bahas data yang anda peroleh dilihat dari bentuk pertumbuhan koloninya.

Pertumbuhan Koloni Bacillus subtilis

Pada mikroorganisme Bacillus subtilis yang diisolasi dari media agar miring ke cawan petri menggunakan metode streak plate dihasilkan dari koloni Bacillus subtilis yang terkontaminasi oleh mikroorganisme lain. Pada kuadran I dan II mikroorganisme yang tumbuh lebih banyak, sedangkan pada kuadran III yang tumbuh sedikit koloni, sedangkan pada kuadran IV koloni yang tumbuh lebih sedikit dari pada koloni yang tumbuh pada kuadran III dan juga terdapat kontaminasi mikroorganisme lain uang berbentuk point. Pada kuadran I jumlah koloni Bacillus subtilis yang tumbuh sangat banyak dan menyebar tebal diseluruh goresan zig zag pada kuadran I, pada kuadran II jumlah koloni Bacillus subtilis

masih terdapat banyak jumlah koloninya akan tetapi tidak setebal yang terdapat pada kuadran I. Semakin mendekati kuadran III, koloni yang tumbuh semakin sedikit, hal tersebut karena koloni Bacillus subtilis diambik dari kuadran II dan goresannya memang lebih tipis dibandingkan kuadran I dan II itu sendiri. Sementara pada kuadran IV, koloni yang tumbuh lebih sedikit dari kuadran III. Karakteristik pertumbuhan koloninya adalah koloni berbentuk medium, bentuk elevasi irregular, bentuk permukaan koloni kasar, bentuk margin lobate, dan koloni berwarna putih. Hal ini tidak sesuai dengan literatur dimana koloni yang ditumbuhkan dengan metode streak plate ini akan dihasilkan kultur murni dari tiap kuadrannya. Semakin besar kuadrannya, maka kultur mikroorganisme yang dihasilkan akan semakin murni. Dikarenakan kontaminasi atas tidak sterilnya praktikan saat menggoreskan bakteri di dalam cawan petri (Pablo,2012).

Mikroorganisme Bacillus subtilis yang diambil dari tabung reaksi yang berisi kultur ke cawan petri menggunakan metode spread plate. Metode spread merupakan metode isolasi dengan membiarkan agar steril pada cawan petri beku terlebih dahulu. Setelah membeku sempurna kultur yang telah diencerkan, dipipet dan dipindahkan ke permukaan, disebarkan pada cawan petri setelah itu diinkubasi. Setelah diinkubasi dihasilkan koloni Bacillus subtilis

yang tidak terkontaminasi dengan karakteristik pertumbuhan koloni Bacillus subtilis yaitu koloni berbentuk large, bentuk elevasi koloni irregular, bentuk permukaan koloni kasar, bentuk margin koloni lobate, dan koloni berwarna putih.

Pertumbuhan Koloni L. casei

(15)

sedangkan pada kuadran III yang tumbuh sedikit koloni, sedangkan pada kuadran IV koloni yang tumbuh lebih sedikit dari pada koloni yang tumbuh pada kuadran III. Pada kuadran I jumlah koloni L. casei yang tumbuh sangat banyak dan menyebar tebal diseluruh goresan zig zag pada kuadran I, pada kuadran II jumlah koloni L. casei masih terdapat banyak jumlah koloninya akan tetapi tidak setebal yang terdapat pada kuadran I. Semakin mendekati kuadran III, koloni yang tumbuh semakin sedikit, hal tersebut karena koloni L. casei diambik dari kuadran II dan goresannya memang lebih tipis dibandingkan kuadran I dan II itu sendiri. Sementara pada kuadran IV, koloni yang tumbuh lebih sedikit dari kuadran III. Karakteristik pertumbuhan koloninya adalah koloni berbentuk Small, bentuk elevasi circular, bentuk permukaan koloni berkerut, bentuk margin lobaate, dan koloni berwarna putih (Pablo,2012).

Mikroorganisme L. casei yang diambil dari tabung reaksi yang berisi kultur ke cawan petri menggunakan metode spread plate. Metode spread merupakan metode isolasi dengan membiarkan agar steril pada cawan petri beku terlebih dahulu. Setelah membeku sempurna kultur yang telah diencerkan, dipipet dan dipindahkan ke permukaan, disebarkan pada cawan petri setelah itu diinkubasi. Setelah diinkubasi dihasilkan koloni L. casei yang tidak terkontaminasi dengan karakteristik pertumbuhan koloni L. casei yaitu koloni berbentuk point, bentuk elevasi koloni kasar, bentuk permukaan koloni irregular bentuk margin koloni serate, dan koloni berwarna putih susu.

3. Kesimpulan apakah yang dapat ditarik dari praktikum ini ?

Tujuan dilakukan percobaan ini adalah mampu melakukan berbagai teknik transfer kultur secara aspetis, dan mampu melakukan teknik isolasi kultur dengan metode goresan kaudran. Hasil yang didapatkan dari percobaan untuk pemindahan kultur dari medium agar miring ke medium agar miring dengan asal isolate mikroorganisme yang digunakan adalah

Bacillus subtilis dan L. casei. Untuk mikroorganisme Bacillus subtilis ditumbuhkan pada

(16)

ANALISA PROSEDUR DATA HASIL PENGAMATAN A. Pembuatan media

1. Nutrien Agar

Ditimbang aluminium foil kosong pada timbangan analitik, lalu dikalibrasi, kemudian ditimbang media sebanyak 1.4 g dan dimasukkan dalam Erlenmeyer, lalu dilarutkan dengan aquadest steril sebanyak 70 mL diukur menggunakan gelas ukur, media dilarutkan dan dipanaskan di atas kompor listrik sampai homogen dan larut dengan sempurna. Erlenmeyer diangkat, tunggu sampai suhu sekitar 50 0_{C (karena jika terlalu dingin media}

akan memadat dan terlalu panas akan merusak pipet ukur). Setelah itu pipet sebanyak 7 mL ke dalam tiap-tiap tabung reaksi, tutup dengan kapas lalu disterilkan pada autoklaf pada suhu 121 0_{C selama 15 menit. Setelah autoklaf bertekanan 0 atm media yang telah}

dibuat diambil dan dibuat menjadi agar miring dengan menaruh media dengan posisi miring 450_{dan untuk media tegak menaruhnya dengan posisi tegak sampai memadat pada}

ruangan steril. NA ditimbang lagi dan dimasukkan pada Erlenmeyer dengan proses seperti diatas tanpa dilakukan proses pemipetan. Setelah media steril, media dituangkan pada cawa petri sebanyak 10-15 mL secara aseptis hingga permukaan merata. Tunggu sampai memadat dan siap digunakan. Media cawan petri dibuat 2 buah (untuk media streak plate dan spread plate) sedangkan sisanya disimpan di Laminar Air Flow untuk pembuatan media agar yang digunakan dengan metode pour plate.

2. Nutrien Broth

Ditimbang aluminium foil kosong pada timbangan analitik, lalu dikalibrasi, kemudian ditimbang media sebanyak 0.2 g dan dimasukkan dalam Erlenmeyer, lalu dilarutkan dengan aquadest steril sebanyak 25 mL diukur menggunakan gelas ukur, media dilarutkan dan dipanaskan di atas kompor listrik sampai homogen dan larut dengan sempurna. Erlenmeyer diangkat. Setelah itu pipet sebanyak 7 mL ke dalam tiap-tiap tabung reaksi, tutup dengan kapas lalu disterilkan pada autoklaf pada suhu 121 0_{C selama 15 menit.}

Setelah autoklaf bertekanan 0 atm media yang telah dibuat diambil dan diletakkan di ruangan steril.

B. Persiapan dan Aseptis Diri dan Lingkungan

Untuk prosedur mentransfer koloni, yang pertama adalah persiapkan alat dan bahan. Alat yang harus disiapkan adalah tabung reaksi sebagai tempat media, jarum ose untuk memindahkan kultur, bunsen untuk membakar peralatan supaya steril, kapas untuk menutup media maupun kultur agar tak terdapat kontaminan, alkohol 70% untuk aseptis, tissue untuk aseptis lingkungan. Bahan yang harus dipersiapkan adalah media agar miring yang berisi kultur Basillus substilis serta media agar miring, agar tegak dan media broth yang tidak terisi apapun sebagai tempat isolasi kultur untuk pengamatan.

(17)

dan basuhkan secara merata, lalu aseptis lingkungan dengan cara menyemprotkan larutan alkohol 70% ke meja praktikum dan basuh menggunakan tissue secara searah. Kemudian aseptis peralatan agar tidak terjadi kontaminasi pada media serta kultur. Sebaiknya dalam bekerja harus menggunakan sarung tangan lateks yang sudah diberi alcohol, harus memakai masker dan tidak dianjurkan berbicara.

C. Metode Streak Plate Goresan Kuadran

Pertama-tama cawan petri yang berisi media dibuat pembagian 4 sektor kuadran agar mempermudahkan terlihatnya pertumbuhan bakteri dari kuadran I sampai kuadran 4 mana yang lebih banyak ditumbuhi oleh mikroba. Kemudian dipijarkan jarum ose secara aseptis agar tidak terkena kontaminasi dari udara luar. Setelah itu diambil 1 ose kultur dari agar miring secara aseptis agar bakteri tidak terkontaminasi. Lalu goreskan di permukaan agar sektor 1 secara zig-zag. Buat goresan lagi dipermukaan agar dari sector 1 ke sector 2, dari sector 2 ke sektor 3, dari sector 3 ke sektor 4 dengan tidak memutus garis zig-zag. Jika sudah selesai, Beri label pada cawan petri. Proses tersebut dilakukan secara aseptis. Cawan petri kemudian dibungkus dengan kertas payung dan ditali menggunakan karet. lalu diinkubasi pada suhu 30 0_{C selama 48 jam untuk mengetahui pertumbuhan bakteri.}

Amati pertumbuhan mikroba 2 hari kemudian dan catat hasilnya.

D. Metode Spread Plate

Siapkan sampel yang telah diencerkan (kultur Bacillus substillis umur 48 jam). Kemudian lakukan aseptis peralatan yaitu menyemprotkan alkohol 70% pada mikropipet, keringkan menggunakan tissue secara searah. Selanjutnya ambil media yang berisi kultur, buka penutup kapas lalu sterilisasi tabung tersebut dengan membakar permukaan tabung agar tak ada kontaminan, sampel diambil 0.1 mL menggunakan mikropipet warna kuning dan mikrotip yang steril agar pengambilan sampel bisa tepat dan dilakukan secara aseptis. Ambil cawan petri yang berisi media agar steril, bakar permukaan cawan petri lalu inokulasikan pada cawan petri yang telah berisi media agar tersebut kemudian ratakan dengan spreader yang telah disterilisasi/dibakar dengan Bunsen sebanyak 3 x ulangan (aseptis). bakar kembali permukaan cawan petri menggunakan bunsen lalu tutup cawan petri dengan rapat. Beri label pada cawan petri. Proses tersebut dilakukan secara aseptis. Cawan petri kemudian dibungkus dengan kertas payung dan ditali menggunakan karet. lalu diinkubasi pada suhu 30 0_{C selama 48 jam untuk mengetahui pertumbuhan bakteri.}

Amati pertumbuhan mikroba 2 hari kemudian dan catat hasilnya.

E. Metode Pour Plate

(18)

cawan petri, lalu inokulasikan pada cawan petri kemudian tuangkan media agar yang masih dalam keadaan encer (steril) pada cawan petri yang telah berisi 1 mL kultur tersebut. bakar kembali permukaan cawan petri menggunakan bunsen lalu tutup cawan petri dengan rapat. Homogenkan dengan membentuk pola angka 8 agar media bisa merata dengan kultur tersebut. Beri label pada cawan petri. Proses tersebut dilakukan secara aseptis. Cawan petri kemudian dibungkus dengan kertas payung dan ditali menggunakan karet. lalu diinkubasi pada suhu 30 0_{C selama 48 jam untuk mengetahui pertumbuhan}

bakteri. Amati pertumbuhan mikroba 2 hari kemudian dan catat hasilnya.

F. Transfer kultur dari tabung reaksi ke tabung reaksi

Pertama-tama yang harus dilakukan adalah ambil jarum ose menggunakan tangan kanan lalu lakukan sterilisasi terlebih dahulu untuk menghindari kontaminasi. Sterilisasi jarum ose dilakukan dengan memasukkan jarum ose pada tabung reaksi yang berisi alkohol lalu dibakar diatas bunsen sampai membara atau berpijar. Lalu ulangi langkah tersebut sebanyak 3 kali. Persiapan telah selesai maka dimulailah menginokulasi kultur.

a. Medium agar miring ke medium agar miring

Sampel disiapkan, lalu ose dipijarkan agar steril. Selanjutnya ambil media agar miring yang berisi kultur, buka penutup kapas lalu sterilisasi tabung tersebut dengan membakar permukaan tabung agar tak ada kontaminan, lalu secara perlahan masukkan jarum ose pada media agar miring berisi kultur tersebut untuk mengambil koloni, diambil 1 ose (loop) kultur dari tabung berisi media agar miring dari bawah ke atas. Setelah mengambil koloni, bakar permukaan tabung reaksi tersebut dan tutup dengan kapas kembali. Pindahkan kultur pada jarum ose ke tabung reaksi media agar miring yang tidak berisi kultur dan masih steril. Buka penutup kapas pada media agar miring tersebut dan bakar permukaan tabung, lalu masukkan koloni tersebut dari bawah ke atas secara zigzag agar koloni tumbuh merata. Sesudah itu bakar kembali permukaan tabung agar tak terjadi kontaminasi dan tutup segera dengan kapas. Setelah itu sterilisasi jarum ose dengan dimasukkan pada larutan alkohol 70% dan bakar diatas bunsen. Beri label tabung reaksi. Lalu tabung reaksi dibungkus dengan kertas payung lalu diinkubasi pada suhu 30 0_C

selama 48 jam untuk mengetahui pertumbuhan bakteri lalu Amati pertumbuhan mikroba 2 hari kemudian dan catat hasilnya. Proses dilakukan secara aseptis.

b. Medium agar miring ke medium agar tegak

(19)

kembali permukaan tabung agar tak terjadi kontaminasi dan tutup segera dengan kapas. Setelah itu sterilisasi jarum ose dengan dimasukkan pada larutan alkohol 70% dan bakar diatas bunsen. Beri label tabung reaksi Lalu tabung reaksi dibungkus dengan kertas payung lalu diinkubasi pada suhu 30 0_{C selama 48 jam untuk mengetahui pertumbuhan}

bakteri lalu Amati pertumbuhan mikroba 2 hari kemudian dan catat hasilnya. Proses dilakukan secara aseptis.

c. Medium agar miring ke medium broth

Sampel disiapkan, lalu ose dipijarkan agar steril. Selanjutnya ambil media agar miring yang berisi kultur, buka penutup kapas lalu sterilisasi tabung tersebut dengan membakar permukaan tabung agar tak ada kontaminan, lalu secara perlahan masukkan jarum ose pada media agar miring berisi kultur tersebut untuk mengambil koloni, diambil 1 ose (loop) kultur dari tabung berisi media agar miring dari bawah ke atas. Setelah mengambil koloni, bakar permukaan tabung reaksi tersebut dan tutup dengan kapas kembali. Pindahkan kultur pada jarum ose ke tabung reaksi media broth yang tidak berisi kultur dan masih steril. Buka penutup kapas pada media broth tersebut dan bakar permukaan tabung, lalu masukkan koloni tersebut dengan mengaduk-aduk media agar kultur dapat terlepas dari ose. Sesudah itu bakar kembali permukaan tabung agar tak terjadi kontaminasi dan tutup segera dengan kapas. Setelah itu sterilisasi jarum ose dengan dimasukkan pada larutan alkohol 70% dan bakar diatas bunsen. Beri label tabung reaksi Lalu tabung reaksi dibungkus dengan kertas payung lalu diinkubasi pada suhu 30 0_{C selama 48 jam untuk}

(20)

F. PEMBAHASAN

1. Pada teknik isolasi, apa perbedaan koloni mikroba yang tumbuh pada masing-masing kuadran ? Mengapa demikian ? Jelaskan.

Pada teknik streak, mikroba yang tumbuh pada kuadran pertama masih berasal dari suatu koloni mikroba yang bermacam - macam serta dapat diamati juga bahwa pertumbuhannya masih sangat padat. Adapun pada kuadran kedua, jumlah kepadatan mikrobanya semakin berkurang namun masih dikategorikan cukup padat. Pada kuadran ketiga, jumlah kepadatannya semakin sedikit dan pada keempat didapatkan koloni tunggal. Hal tersebut disebabkan pada saat akan menggoreskan jarum ose ber-kultur ke tiap kuadran selanjutnya, maka jarum ose terlebih dahulu dibakar, hal tersebut dilaakukan guna mematikan mikroba yang menempel sehingga nantinya akan didapatkan koloni tunggal (Black, 2008).

2. Apa yang dimaksud dengan ”selective media” ? Mengapa media tersebut digunakan dalam teknik isolasi ? Jelaskan. Sebutkan contoh ”selective media” sebanyak 2.

Selective media merupakam suatu jenis media yang dapat menghambat kelompok mikroba tertentu namun tetap membiarkan kelompok mikroba lain untuk tetap hidup. Selective Media digunakan dalam teknik isolasi karena sesuai dengan prinsip dan tujuan teknik isolasi itu sendiri yaitu untuk mendapat kultur murni dari suatu kultur campuran, dimana bakteri murni yang didapat tetap bertahan hidup sedangkan bakteri lain yang tidak diinginkan dapat dihambat pertumbuhannya dan mati (Adnan, 2009).

Contoh Selective Media :

Mac Conkey Agar dan Gram Negative Broth (Adnan, 2009).

3. Apakah koloni yang terpisah pada teknik isolasi merupakan pertumbuhan dari satu sel mikroba ? Apakah koloni tersebut dapat dikatakan sebagai kultur murni ? Jelaskan.

Ya, koloni yang terpisah pada teknik isolasi merupakan pertumbuhan dari satu sel mikroba tersebut. Koloni tersebut dapat dikatakan sebagai kultur murni dikarenakkan koloni tersebut tumbuh dari satu sel mikroba yang terpisah dari yang lainnya setelah melewati tahapam isolasi (Walker, 2007).

4. Apa keunggulan metode Streak Plate dan Spread Plate pada teknik isolasi mikroba? Jelaskan pula tentang Loop Dilution.

Streak plate lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu.

(21)

digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh. Koloni yang dihasilkan adalah single koloni atau 1 koloni hanya dari 1 spesies saja. Selain itu kontaminan mudah dibedakan. Karena pada metode ini ose digoreskan dengan pola tertentu, maka koloni yang tumbuh diluar pola tersebut dapat dinyatakan sebagai kontaminan (Suriawiria 2015).

Metode surface plate dapat dilakukan untuk memisahkan mikrobia aerob dengan mikroba yang lain. Karena jika dituangkan pada permukaan medium, bakteri yang paling diuntungkan adalah bakteri aerob (Waluyo, 2007).

5. Apa kegunaan penambahan gliserol pada proses preservasi kultur? Jelaskan.

(22)

G. KESIMPULAN

Tujuan dilakukan percobaan ini adalah mampu melakukan berbagai teknik transfer kultur secara aspetis, dan mampu melakukan teknik isolasi kultur dengan metode goresan kaudran. Teknik isolasi yang dapat dilakukan pada agar cawan antara lain adalah metode goresan (Streak plate), metode tuang (pour plate), dan metode permukaan (spread plate).

Prinsip teknik Streak Plate atau teknik gores adalah dengan cara menggoreska ose kultur pada media padat. Tujuannya adalah untuk mendapatkan koloni terisolasi dari inokulum dengan menciptakan bidang peningkatan cairan di piring tunggal. Ada 3 cara , goresan langsung, goresan kuadra, dan goresan radian. Teknik Pour Plate atau teknik tuang dapat digunakan untuk menentukan jumlah mikroba/mL atau mikroba/gram pada spesimen. Teknik ini digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme dalam media agar dengan cara mencampurkan media cair dengan stok kultur murni. Teknik Spread Plate atau teknik menyebar merupakan teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme dengan menuangkan stok kultur atau menghapuskannya diatas media gar yang telah memadai.

Hasil yang didapatkan dari percobaan untuk pemindahan kultur dari medium agar miring ke medium agar miring dengan asal isolate mikroorganisme yang digunakan adalah

Bacillus subtilis dan L. casei. Untuk mikroorganisme Bacillus subtilis ditumbuhkan pada

(23)

Komponen Penilaian LKP:

Kompetensi Mahasiswa dan Nilai Maksimal Tiap Kompetensi

No Kompetensi Bisa Tidak

1. Mampu melakukan teknik isolasi pada media agar ke broth dan sebailknya secara aseptis dan benar :

 Aseptis ose dan mulut tabung / cawan

 Membuka sumbatan tabung / erlenmeyer secara aseptis dan benar

 Menggores agar dengan teknik yang benar 2. Mampu melakukan transfer kultur dengan goresan

kuadran :

 Menggambar kuadran pada cawan

 Aseptis ose dan mulut tabung / cawan

 Mempijarkan ose setiap kali berpindah kuadran 3. Mampu melakukan teknik preservasi untuk

membuat stok kultur

 Menghitung kebutuhan gliserol dan kultur

 Menggunakan microtube secara aseptis dan benar

 Menggunakan pipet mikro secara aseptis dan benar

 Menentukan kondisi penyimpanan kultur dengan tepat

(24)

DAFTAR PUSTAKA TAMBAHAN

Adnan, Kunta. 2009. Cara pengambilan sampel yang steril. http://www.fedcosierra.com/

2007/06/cara-pengambilan-sampel-yang-steril.html. Diakses pada 7 April 2017 jam

23:55. (4 Oktober 2009)

Black, Jacquelyn G. 2008. Microbiology: Principles Explorations. New York: John Wiley & Sons

Pablo, Julian. 2012. Living in a Microbial World. New York City: Garland Science

(25)

LAMPIRAN