VALIDASI METODE ANALISIS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR AMBROXOL HIDROKLORIDA, SALBUTAMOL SULFAT, DAN TEOFILIN DALAM
SEDIAAN RACIKAN KAPSUL
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Ravindra Arbi Putra NIM: 188114018
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2022
i
VALIDASI METODE ANALISIS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR AMBROXOL HIDROKLORIDA, SALBUTAMOL SULFAT, DAN TEOFILIN DALAM
SEDIAAN RACIKAN KAPSUL
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Ravindra Arbi Putra NIM: 188114018
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2022
ii
Persetujuan Pembimbing
VALIDASI METODE ANALISIS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR AMBROXOL HIDROKLORIDA, SALBUTAMOL SULFAT, DAN TEOFILIN DALAM
SEDIAAN RACIKAN KAPSUL
Skripsi yang diajukan oleh:
Ravindra Arbi Putra NIM: 188114018
Telah disetujui oleh
Pembimbing Utama
(apt. Michael Raharja Gani, M. Farm.) Tanggal 22 Juni 2022
iii
PENGESAHAN SKRIPSI
VALIDASI METODE ANALISIS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR AMBROXOL HIDROKLORIDA, SALBUTAMOL SULFAT, DAN TEOFILIN DALAM
SEDIAAN RACIKAN KAPSUL
Oleh:
Ravindra Arbi Putra NIM: 188114018
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma pada tanggal: 18 Juli 2022
Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Dekan
(Dr. apt. Yustina Sri Hartini)
Panitia Penguji: Tanda Tangan
1. Dr. Florentinus Dika Octa Riswanto, M. Sc. ………...
2. apt. Dina Christin ayuning Putri, M. Sc. ………...
3. apt. Michael Raharja Gani, M. Farm. ………...
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi peraturan perundang-undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 22 Juni 2022
Ravindra Arbi Putra
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN
PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:
Nama : Ravindra Arbi Putra Nomor Mahasiswa : 188114018
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
Validasi Metode Analisis Kromatografi Lapis Tipis Densitometri pada Penetapan Kadar Ambroxol Hidroklorida, Salbutamol Sulfat, dan Teofilin dalam Sediaan Racikan Kapsul.
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me- ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.
Atas kemajuan teknologi informasi, saya tidak berkeberatan jika nama, tanda tangan, gambar atau image yang ada di dalam karya ilmiah saya terindeks oleh mesin pencari (search engine), misalnya google.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal: 22 Juni 2022 Yang menyatakan
( Ravindra Arbi Putra )
vi PRAKATA
Puji dan Syukur kepada Tuhan Yang Maha ESA atas semua berkat dan rahmat-Nya yang telah diberikan kepada penulis untuk menyusun naskah skripsi yang berjudul “Validasi Metode Analisis Kromatografi Lapis Tipis pada Penetapan Kadar Ambroxol Hidroklorida, Salbutamol Sulfat, dan Teofilin dalam Sediaan Racikan Kapsul” sehingga dapat diselesaikan. Naskah skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian payung yang berjudul Penetapan Kadar Teofilin, Salbutamol Sulfat, dan Ambroxol Hidroklorida dalam Sediaan Racikan Kapsul dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis Densitometri.
Penulis mendapatkan banyak dukungan dan bantuan pada proses penyusunan naskah skripsi ini dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis sangat berterima kasih kepada berbagai pihak berikut:
1. Ibu Dr. apt. Yustina Sri Hartini selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma.
2. Ibu Dr. apt. Christine Patramurti selaku Ketua Program Studi Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma.
3. apt. Michael Raharja Gani, M. Farm. selaku dosen pembimbing skripsi dan Dosen Pembimbing Akademik (DPA) yang telah meluangkan waktunya untuk memberikan saran, bantuan, dan nasihat selama proses penelitian dan penyusunan naskah skripsi hingga selesai.
4. Dr. Florentinus Dika Octa Riswanto, M. Sc. selaku dosen penguji atas kritik dan saran yang diberikan selama proses penyusunan skripsi.
5. apt. Dina Christin Ayuning Putri, M. Sc. selaku dosen penguji atas kritik dan saran yang diberikan selama proses penyusunan skripsi.
6. Mas Bimo sebagai laboran yang telah memberikan bantuan saat melakukan penelitian di Laboratorium Kimia Analisis Instrumen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
7. Papa, Mama, dan Mas Agas yang selalu mendoakan, memberikan dukungan, saran, motivasi, dan nasehat dalam segala hal yang sangat
vii
membangkitkan semangat pantang menyerah dalam proses penyusunan skripsi.
8. Laurenza Celine yang telah memberikan dukungan dan semangat untuk penulis di setiap waktu selama proses perkuliahan dan penyusunan naskah skripsi.
9. Rekan penelitian skripsi Bella dan Sondang yang berjuang dan belajar bersama serta mendukung dan membantu dalam proses penelitian dan penyusunan naskah skripsi.
10. Teman-teman FSMA 2018 atas kebersamaan dan memberikan semangat selama proses perkuliahan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
11. Semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu per satu oleh penulis karena telah memberikan dukungan, semangat, bantuan, kritik, dan saran.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dan kesalahan yang diperbuat dalam penulisan naskah skripsi ini. Oleh karena itu, penulis menerima segala bentuk kritik dan sran yang diberikan agar naskah skripsi ini menjadi lebih baik dan bermanfaat dalam pengembangan ilmu pengetahuan bidang farmasi.
Penulis memohon maaf atas setiap bentuk kesalahan dalam naskah skripsi ini.
Penulis
viii DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... iv
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ... v
PRAKATA ... vi
DAFTAR ISI ... viii
DAFTAR TABEL ... x
DAFTAR GAMBAR ... xi
DAFTAR LAMPIRAN ... xii
ABSTRAK ... xiii
ABSTRACT ... xiv
BAB I. PENDAHULUAN ... 1
A. Latar Belakang ... 1
B. Rumusan Masalah ... 3
C. Keaslian Penelitian ... 3
D. Tujuan Penelitian ... 4
E. Manfaat Penelitian ... 4
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ... 5
A. Sediaan Racikan Kapsul ... 5
B. Ambroxol Hidroklorida ... 5
C. Salbutamol Sulfat ... 6
D. Teofilin ... 7
E. KLT Densitometri ... 8
F. Validasi Metode ... 9
G. Landasan Teori ... 12
H. Hipotesis ... 13
BAB III. METODE PENELITIAN... 14
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 14
B. Variabel Penelitian ... 14
C. Definisi Operasional... 14
D. Bahan Penelitian... 15
E. Alat Penelitian ... 15
F. Tata Cara Penelitian ... 15
G. Analisis Hasil ... 18
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 20
A. Selektivitas ... 24
B. Linieritas ... 27
C. Akurasi dan Presisi ... 29
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ... 32
A. Kesimpulan ... 32
B. Saran ... 32
DAFTAR PUSTAKA ... 33
LAMPIRAN ... 35
ix
BIOGRAFI PENULIS ... 60
x
DAFTAR TABEL
Tabel I. Parameter yang diperlukan untuk validasi ... 10
Tabel II. Kriteria perolehan kembali ... 11
Tabel III. Kriteria parameter presisi ... 12
Tabel IV. Rf baku, Rf sampel, dan nilai Resolusi (Rs) ... 25
Tabel V. Penentuan akurasi dan presisi secara interday ... 29
Tabel VI. Penentuan akurasi dan presisi secara intraday ... 31
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur ambroxol hidroklorida ... 5
Gambar 2. Struktur salbutamol sulfat ... 6
Gambar 3. Struktur teofilin ... 7
Gambar 4. Aktivasi gugus silanol setelah pemanasan ... 21
Gambar 5. Spektra baku ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin ... 22
Gambar 6. Interaksi fase diam dan fase gerak dengan analit (a). Salbutamol sulfat; (b). Teofilin; (c). Ambroxol hidroklorida ... 23
Gambar 7. Kromatogram baku dan sampel... 23
Gambar 8. Pola spektra ambroxol hidroklorida ... 24
Gambar 9. Pola spektra salbutamol sulfat ... 24
Gambar 10. Pola spektra teofilin ... 24
Gambar 11. Kurva baku ambroxol hidroklorida ... 27
Gambar 12. Kurva baku salbutamol sulfat ... 27
Gambar 13. Kurva baku teofilin... 27
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Sertifikat Analisis Ambroxol Hidroklorida ... 37
Lampiran 2. Sertifikat Analisis Salbutamol Sulfat ... 38
Lampiran 3. Sertifikat Analisis Teofilin ... 49
Lampiran 4. Kromatogram Linieritas Replikasi 3 ... 40
Lampiran 5. Perhitungan Selektivitas ... 43
Lampiran 6. Penimbangan Akurasi & Presisi ... 44
Lampiran 7. Kromatogram Akurasi & Presisi ... 44
Lampiran 8. Penentuan Akurasi dan Presisi secara Intraday ... 54
Lampiran 9. Penentuan Akurasi dan Presisi secara Interday ... 56
Lampiran 7. Kromatogram Sampel Akurasi & Presisi ... 57
Lampiran 8. Contoh Perhitungan Akurasi & Presisi ... 57
xiii ABSTRAK
Ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin merupakan kombinasi obat racikan untuk pasien dengan asma bronkial yang sampai saat ini belum memiliki bentuk sediaan jadi di Indonesia. Maka dari itu penetapan kadar perlu dilakukan untuk mengetahui kadar tiap kapsul yang diracik, Metode validasi dalam rangkaian penetapan kadar berguna untuk menilai metode yang digunakan optimal dan valid guna menetapkan kadar kandungan zat aktif ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin.
Validasi metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) densitometri dilakukan dengan pembuatan kurva baku, penentuan linieritas dan rentang dengan 5 konsentrasi pada masing-masing senyawa, penentuan selektivitas antara baku dan sampel racikan, penentuan akurasi dan presisi menggunakan sampel racikan yang dilakukan secara intraday dan interday sebanyak 3 replikasi. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan validasi metode yang didasarkan pada parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas, rentang, akurasi, dan presisi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode KLT densitometri sudah memenuhi parameter validasi yaitu linieritas dan rentang (nilai r ≥ 0,99), selektivitas (nilai Rs ≥ 1,5), akurasi (nilai %recovery 90-107% untuk konsentrasi 100 ppm, 95-105% untuk konsentrasi 1.000 ppm, 97- 103% untuk konsentrasi 10.000 ppm), dan presisi (nilai CV 5,3% untuk 100 ppm; 3,7% untuk 1.000 ppm;
2,7% untuk 10.000 ppm).
Kata kunci: ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, teofilin, KLT densitometri, validasi metode analisis
xiv ABSTRACT
Ambroxol hydrochloride, salbutamol sulfate, and theophylline are a combination drug formulation for patients with bronchial asthma which until now do not have finished dosage forms in Indonesia. Therefore, assay is needed to determine the compound content of each capsule that is formulated. The validation method in assay research is useful for assessing the optimal and valid research method used to determine the content of the active substances ambroxol hydrochloride, salbutamol sulfate, and theophylline.
Validation of the densitometric Thin Layer Chromatography (TLC) method performs by making standard curves, determining linearity and range with 5 concentrations in each compound, determining the selectivity between the standard and the combination drug formulation sample, determining accuracy and precision using mixed formulation samples researched intraday and interday as many as 3 replications. This study aims to validate methods based on validation parameters, such as selectivity, linearity, range, accuracy, and precision.
The results showed that the TLC densitometry method had met the validation parameter requirements, such as linearity and range (r value 0.99), selectivity (Rs value ≥ 1.5), accuracy (%recovery value 90-107% for concentration 100 ppm, 95- 105% for concentration 1,000 ppm, 97-103% for concentration 10,000 ppm), and precision (CV value 5.3% for 100 ppm; 3.7% for 1,000 ppm; 2.7% for 10,000 ppm).
Keywords: ambroxol hydrochloride, salbutamol sulfate, theophylline, TLC densitometry, validation of analytical methods
1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang
Ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin merupakan kombinasi obat untuk pasien dengan asma bronkial. Kombinasi obat ini dilakukan pada sediaan kapsul racikan agar harga lebih terjangkau dan dapat meningkatkan kepatuhan pasien mengkonsumsi obat yang diberikan oleh dokter (Safitri et al., 2019). Meskipun demikian sampai saat ini kombinasi ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, danteofilin di Indonesia masih belum ditemukan dalam sediaan obat jadi. Maka dari itukombinasi ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin masih dibuat dalam bentuk sediaan racikan. Kapsul merupakan bentuk sediaan padat yang terdiridari satu macam obat atau lebih yang dimasukkan ke dalam cangkang kapsul gelatin keras ataupun lunak yang dapat larut didalam tubuh (Murtini, 2016). Sediaan racikan kapsul memiliki keuntungan memudahkan dalam penggunaannya karena dapat diberikan campuran kombinasi bahan obat, selain itu juga dapat menutupi rasa dan bau obat yang tidak enak (Murtini, 2016).
Meskipun demikiansediaan racikan kapsul juga memiliki kelemahan yaitu kapsul memiliki kemungkinan tidak bisa digunakan untuk pasien anak, dan kemungkinan dosis yang tidak seragam (Safitri et al., 2019).
Menurut Putra et al, 2017., peresepan obat dalam bentuk racikan (serbuk, serbuk terbagi, kapsul racikan) di rumah sakit pada kota-kota diIndonesia masih diminati oleh dokter, terutama pada sediaan puyer dan kapsul racikan. Hal ini dikarenakan beberapa obat dengan kekuatan utuh untuk dosis dewasa dengan komposisi dan dosis tertentu tidak tersedia dalam bentuk sediaan jadi. Dalam penulisan resep biasanya pembagian serbuk terbagi dalam pembuatan sediaan puyer maupun kapsul racikan dibagi secara merata dikertas perkamen secara visual. Cara visual merupakan metode pembagian yang palingbanyak dilakukan saat peracikan karena cepat dan praktis, namun cara ini memiliki banyak kelemahan, antara lain kurang dapat menjamin keseragaman dalam tiap puyer dan kapsul racikan (Andriani et al., 2014). Oleh karena itu, jumlah kapsul yang diinginkan akan mempengaruhi pembagian serbuk dalam kapsul racikan sehingga
diperoleh bobot sediaan yang seragam (Putra et al., 2017), sehingga dibutuhkan penetapan kadar untuk mengetahui kadar zat aktif yang mempengaruhi mutu dan keamanan obat.
Pada penelitian ini digunakan metode KLT densitometeri untuk penetapan kadar karena metode ini merupakan salah satu metode analisis untuk menganalisis analit dalam sampel yang mengandung banyak matriks. KLT densitometri memiliki prinsip pemisahan berdasarkan interaksi antara fase diam dan fase gerak dengan analit (Lade et al., 2014). KLT densitometri memiliki keuntungan dengan tidak memerlukan waktu dan biaya yang berlebih serta mudah untuk mendapatkan pelarutnya (Lade et al., 2014), jika dibandingkan dengan HPLC, KLT memiliki keuntungan memungkinkan pemisahan paralel dan penentuan kuantitatif banyak sampel secara bersamaan dan juga lebih mudah dalam penggunaannya (Pyka, 2014). Pada penelitian ini digunakan metode KLT densitometri karena dapat memisahkan analit dengan matriks lain dan dapat menganalisis gugus kromofor yang terdapat pada ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin.
Penelitian ini merupakan rangkaian dalam penelitian penetapan kadar ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin pada sediaan kapsul dengan metode KLT densitometri yang meliputi optimasi, validasi metode analisis dan penetapan kadar. Pada rangkaian ini, peneliti mengambil bagian dalam tahap validasi metode analisis dengan KLT densitometri untuk penetapan kadar ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin dalam bentuk sediaan kapsul. Metode penetapan kadar ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin dalam bentuk sediaan kapsul ini diperoleh dari hasil optimasi yang termasuk dalam rangkaian penelitian ini. Dalam metode penetapan kadar perlu adanya validasi metode analisis. Validasi metode merupakan hal yang penting dilakukan sebelum metode diaplikasikan agar hasil yang didapatkan memenuhi standar reliabilitas, akurasi, dan presisi sesuai tujuan yang diharapkan dan juga memberikan jaminan untuk memenuhi parameter-parameter validasi, yaitu selektivitas, linieritas, rentang, akurasi, dan presisi.
3
B. Rumusan Masalah
Apakah metode KLT densitometri dalam analisis ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin dalam sediaan racikan kapsul memenuhi parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas, rentang, akurasi, dan presisi?
C. Keaslian Penelitian
Hasil penelusuran publikasi penelitian-penelitian sebelumnya terkait validasi analisi senyawa ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat dan teofilin:
1. Penelitian yang dilakukan oleh Sharma Ekta A. dan Shah Nehal J. pada tahun 2012 yang berjudul Development and Validation of High- Performance Thin Layer Chromatography Method for Simultaneous Estimation of Ambroxol Hydrochloride and Desloratadine Hydrochloride in Their Combined Tablet Dosage Form.
2. Penelitian yang dilakukan oleh L. Kalyani dan Chava V. N. Rao pada tahun 2017 yang berjudul Development and Validation of Stability- indicating RP-HPLC method for the simultaneous analysis of Salbutamol, Theophylline and Ambroxol.
3. Penelitian yang dilakukan oleh Lestyo Wulandari, Yuni Retnaningtyas, dan Diyanul Mustafidah pada tahun 2013 yang berjudul Development and Method Validation Densitometry Thin Layer Chromatography for The Simulationeous Determination of Theophylline and Ephedrinehydrochloride in Tablet Dosage Form.
Pada penelitian sebelumnya digunakan metode kromatografi lapis tipis kinerja tinggi dan metode kromatografi cair kinerja tinggi untuk menganalisis senyawa ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin. Pada penelitian ini digunakan metode kromatografi lapis tipis densitometri karena dapat memisahkan analit dengan matriks lain dan memiliki fleksibilitas besar dalam memilih fase gerak, biaya murah, dapat digunakan untuk penetapan kadar senyawa aktif baik yang berasal dari bahan alam maupun senyawa kimia sintesis.
D. Tujuan Penelitian
Validasi metode KLT Densitometri dilakukan agar dapat memenuhi parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas, rentang, akurasi, dan presisi dalam analisis ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin dalam sediaan racikan kapsul.
E. Manfaat Penelitian 1. Manfaat Teoretis
Memberikan pengetahuan ilmiah tentang penggunaan metode KLT densitometri dalam penetapan kadar ambroxol hidroklorida, salbutamolsulfat, dan teofilin dalam sediaan racikan kapsul, yang didapatkan memenuhi standar reliabilitas, akurasi, dan presisi.
2. Manfaat Praktis
Melakukan validasi metode dengan KLT densitometri dalam penetapan kadar ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin dalam sediaan racikan kapsul dengan hasil yang sesuai dengan parameter validasi, yaitu selektivitas, linieritas, rentang, akurasi, dan presisi.
5 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA A. Sediaan Racikan Kapsul
Kapsul adalah sediaan padat yang terdiri dari satu macam obat atau lebih atau bahan inert lainnya yang dimasukan ke dalam cangkang kapsul gelatin keras atau lunak yang dapat larut. Cangkang umumnya terbuat dari gelatin tetapi dapat juga terbuat dari pati atau bahan lain yang sesuai (Murtini, 2016). Kebanyakan kapsul yang diedarkan dipasaran biasanya obat untuk ditelan, walaupun ada kapsul yang utuk disisipkan ke dalam rektum (Murtini, 2016). Peresepan obat dalam bentuk racikan (serbuk, serbuk terbagi, kapsul racikan) di apotek maupun rumah sakit masih diminati oleh dokter. Terutama sediaan kapsul racikan. Hal ini dikarenakan beberapa obat dengan kekuatan utuh untukdosis dewasa dengan komposisi dan dosis tertentu tidak tersedia dalam bentuk sediaan jadi (Putra et al., 2017). Obat ini dapat dipersiapkan dalam bentuk kapsul racikan untuk mempermudah penggunaan obat pada pasien (Putra et al.,2017). Sediaan kapsul memiliki keuntungan dapat menutupi rasa dan bau obat yang kurang enak (Jasmiadi, 2013). Sediaan kapsul juga dapat memudahkan dalam penggunaannya karena dapat diberikan campuran kombinasi bahan obatdan dosis yang lebih tepat sesuai dengan kebutuhan individu (Andriani et al., 2014). Sediaan kapsul juga memiliki kekurangan yaitu memungkinkan untuk susah ditelan dan menyebabkan ketidakpatuhan pada anak dan usia lanjut terutama pada pasien yang tidak memiliki akses ke air minum (Safitri et al., 2019).
B. Ambroxol Hidroklorida
Gambar 1. Struktur ambroxol hidroklorida (Sharma and Shah, 2012)
Obat golongan mukolitik merupakan obat batuk yang bekerja dengan cara mengencerkan sekret saluran pernafasan dengan jalan memecah benang-benang mukoprotein dan mukopolisakarida dari sputum (Yosmar et al., 2015). Agen mukolitik berfungsi dengan cara mengubah viskositas sputum melalui aksi kimia langsung pada ikatan komponen mukoprotein (Yosmar et al., 2015). Ambroxol hidroklorida memiliki rumus molekul C13H18Br2N2O (European Pharmacopoeia, 2019). Pada Gambar 1. struktur ambroxol hidroklorida menunjukkan adanya gugus fungsi hidroksil, gugus fungsi sikloheksana, gugus fungsi amin sekunder, dan gugus fungsi 2,4-dibromo-benzal-amin. Ambroxol hidroklorida merupakan serbuk kristal berwarna putih atau kekuningan (European Pharmacopoeia, 2019).
Memiliki kelarutan sedikit larut dalam air, larut dalam metanol, praktis tidak larut dalam metilen klorida (European Pharmacopoeia, 2019). Penyimpanan yang aman untuk ambroxol hidroklorida yaitu pada tempat yang terlindungi dari cahaya (European Pharmacopoeia, 2019).
C. Salbutamol Sulfat
Gambar 2. Struktur salbutamol sulfat
Obat simpatomimetik selektif β2 ini memiliki manfaat yang besar dan bronkodilator dengan agonis reseptor β2-adrenergik kerja pendek dan sangat selektif terhadap reseptor di otot bronkial yang paling efektif dengan efek samping yang minimal pada terapi asma (Patel and Parmar, 2018; Yosmar et al., 2015). Salbutamol Sulfat mengandung tidak kurang dari 98,5% dan tidak lebih dari 101,0% dengan rumus molekul (C13H21NO3)2.H2SO4, dihitung terhadap zat anhidrat (Kemenkes RI, 2020). Pada Gambar 2. struktur salbutamol sulfat menunjukkan adanya gugus fungsi butil amino, gugus fungsi hidroksil, dan gugus
7
fungsi fenol. Salbutamol sulfat merupakan serbuk putih atau hampir putih, yang mudah larut dalam air, sukar larut dalam etanol, kloroform dan dalam eter (Kemenkes RI, 2020). Kondisi penyimpanan yaitu dalam wadah tertutup baik, tidak tembus cahaya (Kemenkes RI, 2020).
D. Teofilin
Gambar 3. Struktur teofilin (Kalyani & Rao, 2017)
Teofilin merupakan obat asma yang cukup banyak digunakan dan mempunyai lingkup terapi sempit, yaitu jarak antara dosis terapi dengan dosis toksis sangat dekat, teofilin digunakan untuk mengatasi obstruksi saluran nafas (Wulandari et al., 2013). Bronkodilator yang digunakan untuk asma dan untuk mengatasi penyakit paru obstruksi kronik yang stabil, secara umum tidak efektif untuk eksaserbasi penyakit paru obstruksi kronik (Yosmar et al., 2015). Teofilin mengandung satu molekul air hidrat atau anhidrat. Mengandung tidak kurang dari 97,0% dan tidak lebih dari 102,0% dengan rumus molekul C7H8N4O2, dihitung terhadap zat kering (Kemenkes RI, 2020). Pada Gambar 3. struktur teofilin menunjukkan adanya gugus fungsi keton, gugus fungsi amin sekunder,dan gugus fungsi amin tersier. Teofilin merupakan serbuk hablur, putih, tidak berbau, rasa pahit, dan stabil di udara (Kemenkes RI, 2020). Teofilin memilikikelarutan yang sukar larut dalam air, tetapi lebih mudah larut dalam air panas, mudah larut dalam larutan alkali hidroksida, dan dalam amonia, agak sukar larutdalam etanol, dalam kloroform, dan dalam eter (Kemenkes RI, 2020). Kondisi penyimpanan yang baik untuk teofilin adalah dalam wadah yang tertutupdengan baik (Kemenkes RI, 2020).
E. KLT Densitometri 1. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah metode pemisahan komponen didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas) yang menyebabkan terjadinya perbedaan migrasi dari masing-masing komponen (Srivastava, 2011). Perbedaan distribusi terjadi karena interaksiantara 2 fase, yaitu analit dengan fase diam dan/atau analit dengan fase gerak (Wulandari, 2011). Selain itu ada beberapa faktor yang mempengaruhi laju migrasi, yaitu faktor pendorong migrasi meliputi gaya gravitasi, elektrokinetik, dan hidrodinamik dan faktor penghambat migrasi meliputi friksi molekul elektrostatik, adsorbsi, kelarutan, ikatan kimia dan interaksi ion (Wulandari, 2011).
Terdapat berbagai metode pemisahan pada kromatografi yaitu:
a. Pemisahan berdasarkan polaritas
Senyawa-senyawa dalam sampel terpisah karena terdapat perbedaan polaritas. Afinitas analit terhadap fase diam dan fase gerak tergantung kedekatan polaritas analit terhadap fase diam dan fase gerak (like dissolve like). Analit akan cenderung larut dalam fase dengan polaritas yang sama.
b. Pemisahan berdasarkan muatan ion
Pemisahan berdasarkan muatan ion dipengaruhi oleh jumlah ionisasi senyawa, pH lingkungan dan keberadaan ion lain. Pemisahan terjadi karena perbedaan arah dan kecepatan gerakan senyawa serta intensitas muatan ion.
c. Pemisahan berdasarkan ukuran molekul
Pemisahan terjadi karena perbedaan difusi senyawa-senyawa melewati pori-pori fase diam dengan ukuran pori-pori yang bervariasi.
d. Pemisahan berdasarkan bentukan spesifik Pemisahan senyawa
9
berdasarkan bentukan yang spesifik melibatkan ikatan kompleks yang spesifik antara senyawa sampel dengan fase diam.
(Srivastava, 2011) KLT adalah salah satu jenis kromatografi planar dengan fase diam tersebar disebuah plat datar KLT memiliki beberapa keuntungan yaitu analisis yang cepat pada campuran yang sederhana, biaya yang digunakan murah dan fleksibel pada berbagai jenis sampel (Lade et al., 2014).
2. Densitometri
Densitometri merupakan metode analisis instrumental penentuan analit secara kualitatif maupun kuantitatif berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik (REM) dengan noda analit pada fase diam KLT. Penentuan kualitatif dilakukan dengan membandingkan nilai Rf analit dengan standar.
Penentuan kuantitatif dilakukan dengan membandingkan luas area noda analit dengan luas area noda standar pada fase diam yang diketahui konsentrasinya atau menghitung densitas noda analit dan membandingkannya dengan densitas noda standar (Wulandari, 2011). Interaksi radiasi elektromagnetik (REM) merupakan intensitas cahaya yang mengenai molekul senyawa dalam noda. Apabila pada fase diam tidak ada noda, maka cahaya yang jatuh akan dipantulkan kembali, tetapi jika cahaya tersebut dijatuhkan pada plat yang terdapat noda dari suatu senyawa, maka sebagian cahaya akan diserap dan sebagian akan dipantulkan. Sinar yang direfleksikan atau diteruskan ditangkap oleh pengganda foton (photomultiplier) berfungsi menggandakan sinar yang datang sehingga menghasilkan elektron yang terbaca oleh sistem computer sebagai data output (Wulandari, 2011).
F. Validasi Metode
Validasi merupakan proses mengkonfirmasikan kinerja dan karakteristik suatu metode analisis (AOAC International, 2019). Validasi metode bertujuan untuk menjamin bahwa prosedur analisis yang ada memenuhi standar reliabilitas, akurasi, dan presisi sesuai tujuan yang diharapkan. Validasi dilakukan pada operator khusus, laboratorium, dan peralatan tertentu dalam rentang periode
waktu tertentu. Validasi adalah proses yang hanya dapat dilakukan setelah suatu metode sudah dioptimasi (AOAC International, 2019).
Validasi dibagi menjadi beberapa kategori berdasarkan jenis sampel yang akan dianalisis. Kategori 1 merupakan prosedur analisis untuk penetapan kadar komponen utama dalam bahan baku obat dan sediaan obat jadi atau bahan aktif lainnya seperti pengawet. Kategori 2 merupakan prosedur analisis untuk penetapan kadar cemaran dalam bahan baku obat atau hasil degradasinya dalam sediaan obat jadi. Kategori 3 merupakan prosedur analisis untuk penetapan kinerja dan kualitas sediaan obat jadi, seperti uji disolusi dan uji pelepasan obat.
Kategori 4 merupakan prosedur analisis untuk tes identifikasi. Parametervalidasi yang digunakan dipilih berdasarkan metode analisis dan kategori yangdigunakan (AOAC International, 2019). Penelitian ini termasuk dalam kategori 1 karena senyawa ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin merupakan komponen utama dalam bahan baku obat kombinasi dalam bentuk kapsul.
Parameter validasi yang digunakan dipilih berdasarkan metode analisis dan kategori yang digunakan (USP, 2019).
Tabel I. Parameter yang diperlukan untuk validasi (USP, 2019) Parameter
Validasi Metode Analisis
Kategori 1
Kategori 2 Kategori 3
Kategori 4 Kuantitatif Kualitatif
Akurasi Ya Ya * * Tidak
Presisi Ya Ya * Ya Tidak
Selektivitas Ya Ya Ya * Ya
Batas Deteksi Tidak Tidak Ya * Tidak
Batas Kuantifikasi
Tidak Ya Tidak * Tidak
Linearitas Ya Ya Tidak * Tidak
Rentang Ya Ya * * Tidak
Dalam validasi metode analisis terdapat beberapa parameter-parameter yang harus dipenuhi untuk menunjukkan metode yang digunakan sudah valid.
Berikut adalah parameter-parameter dalam validasi metode analisis:
a. Selektivitas
Selektivitas adalah parameter yang mengukur sejauh mana metode dapat mengukur analit dari matriks atau bahan lain yang berpotensi menganggu.
11
Dalam analisis menggunakan metode KLT densitometri, nilai aktivitas ditentukan berdasarkan perhitungan daya resolusi. Batas minimum nilai resolusi untuk analisi kuantitatif adalah 1,5 (AOAC International, 2019).
b. Linieritas dan rentang
Linieritas adalah parameter yang kemampuan metode analisis untuk memperoleh hasil uji secara langsung, dengan konsentrasi analit dalam rentang konsentrasi tertentu. Linieritas diuji dengan mengukur 5 atau lebih standar konsentrasi dan dihitung dengan metode sttistik menggunakan persamaan regresi. Nilai rekomendasi linieritas dilihat dari nilai koefisien variasi (r) kurang dari 0,99 (AOAC International, 2019). Rentang metode adalah batas kadar terendah dan tertinggi analit yang terbukti dapat ditetapkan dengan kecermatan dan linieritas yang dapat diterima. Suatu rentang yang berasal dari beberapa konsentrasi standar diperlukan untuk menyusun kurva kalibrasi (AOAC International, 2019).
c. Akurasi
Akurasi adalah parameter yang menggambarkan kedekatan hasil uji yang diperoleh dari prosedur analisis dengan nilai yang sebenarnya. Penilaian akurasi dilakukan dengan menghitung perolehan kembali pada rentangkonsentrasi yang dianalisi. Batas minimum rentan konsentrasi yang dianalisi adalah 3 konsentasi yaitu konsentrasi rendah, medium, dan tinggi.
Nilai rekomendasi akurasi yang dianjurkan seperti pada Tabel II.
Tabel II. Kriteria perolehan kembali (AOAC International, 2019) Analit (%) Unit Perolehan kembali
(%)
100 100% 98-102
10 10% 98-102
1 1% 97-103
0,1 0,1% 95-105
0,01 100ppm (mg/kg) 90-107
0,001 10ppm (mg/kg) 80-110
0,0001 1ppm (mg/kg) 80-110
0,00001 100ppb (µg/kg) 80-110
0,000001 10ppb (µg/kg) 60-115
0,0000001 1pbb (µg/kg) 40-120
d. Presisi
Presisi adalah parameter yang menyatakan tingkat kesesuaian antara hasil pengujian sampel yang dilakukan berulang kali dari sampel yang sama pada kondisi tertentu. Presisi biasanya dinyatakan sebagai relatif standar deviasi (RSDr) atau koefisien variasi dari serangkaian pengukuran. Pengujian presisi perlu minimal tiga konsentrasi berbeda dan tiga kali pengulangan dari setiap konsentrasi. Nilai rekomendasi presisi yang dianjurkan seperti pada Tabel III:
Tabel III. Kriteria parameter presisi (AOAC International, 2019)
Analit (%) Unit RSDr (%)
100 100% 1,3
10 10% 1,9
1 1% 2,7
0,1 0,1% 3,7
0,01 100ppm (mg/kg) 5,3
0,001 10ppm (mg/kg) 7,3
0,0001 1ppm (mg/kg) 11
0,00001 100ppb (µg/kg) 15
0,000001 10ppb (µg/kg) 21
0,0000001 1pbb (µg/kg) 30
G. Landasan Teori
Peresepan obat dalam bentuk racikan (serbuk, serbuk terbagi, kapsul racikan) dirumah sakit pada kota-kota di Indonesia masih diminati oleh dokter,terutama pada sediaan puyer dan kapsul racikan. Hal ini disebabkan beberapa obat dengan kekuatan utuh untuk dosis dewasa dengan komposisi dan dosis tertentu yang diinginkan tidak tersedia dalam bentuk sediaan yang sudah jadi. Cara visual merupakan metode pembagian yang paling banyak dilakukan saat peracikan karena cepat dan praktis, namun cara ini memiliki banyak kelemahan, antara lain kurang dapat menjamin keseragaman bobot dalam tiap puyer dan kapsul racikan.
Obat kombinasi yang digunakan yaitu ambroxol hidroklorida yang merupakan obat golongan mukolitik yang bekerja dengan cara mengencerkan sekret saluran pernafasan. Salbutamol sulfat merupakan obat golongan β2 agonis sebagai bronkodilator paling efektif dan paling minimal. Teofilin yang merupakan
13
obat golongan metil-xantin yang memiliki efikasi yang lebih rendah dibandingkan kortikosteroid dan β2 agonis yang lainnya, selain itu juga merupakan bronkodilator poten dengan aksi antiinflamasi yang ringan.
Validasi metode analisis untuk obat kombinasi ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin adalah KLT densitometri. KLT densitometri merupakan salah satu metode analisis untuk menganalisis analit dalam sampel.
Metode KLT densitometri ini digunakan karena dapatmemisahkan analit dengan matriks lain pada ambroxol hidroklorida, salbutamolsulfat, dan teofilin. Validasi metode merupakan hal yang penting dilakukan sebelum metode diaplikasikan agar hasil yang didapatkan memenuhi standar reliabilitas, akurasi, dan presisi sesuai tujuan yang diharapkan dan juga memberikan jaminan untuk memenuhi parameter-parameter validasi, yaitu selektivitas, linieritas, rentang, akurasi, dan presisi.
H. Hipotesis
Metode KLT densitometri merupakan metode analisis yang selektif, akurat, presisi, linier, dan memiliki rentang yang telah memenuhi syarat parameter validasi untuk menetapkan kadar ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin dalam sediaan racikan kapsul.
14 BAB III
METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan bersifat non eksperimental deskriptif karena tidak terdapat manipulasi dan perlakuan terhadap subjek uji.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas adalah sistem KLT yang telah dioptimasi, yaitu jenis dan komposisi fase gerak.
2. Variabel terikat adalah parameter validasi, yaitu selektivitas, linieritas, rentang, akurasi, dan presisi.
3. Variabel pengacau terkendali adalah kemurnian pelarut dan pH pelarut yang digunakan.
C. Definisi Operasional
1. Sistem KLT yang digunakan yaitu fase diam (plat silika gel 60 F254) dan fase gerak campuran metanol, etil asetat, kloroform, dan amonia 25%.
2. Kadar ambroxol hidroklorida, salbutamolsulfat, teofilin dalam % b/b.
3. Parameter selektivitas, yaitu mampu memisahkan dan mengkuantifikasi kadar yang akan digunakan darisenyawa-senyawa yang mengganggu proses analisis.
4. Parameter linieritas dan rentang, yaitu merupakan suatu metode analisa untuk menunjukkan secara langsung antara respon detektor dan perubahan konsentrasi analit.
5. Parameter akurasi, yaitu suatu metode untuk memperoleh nilai yang sebenarnya (ketepatan pengukuran).
6. Parameter presisi, yaitu parameter yang menunjukkan kedekatan suatu seri pengukuran dengan sampelnya.
15
D. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel racikan kapsul campuran, baku salbutamol sulfat (kemurnian lebih dari 99%, Dexa Medika), ambroxol hidroklorida (kemurnian lebih dari 99%, Ifars Pharmaceutical), dan teofilin (kemurnian lebih dari 99%, Dexa Medika), methanol p.a grade (E.Merck), etil asetat p.a grade (E.Merck), kloroform p.a grade (E.Merck), amonia 25% p.a grade (E.Merck), kertas saring (Whatman filter paper 0,45), plat silika gel 60 F254 (E. Merck).
E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah KLT scanner (CAMAG TLC scanner 3 CAT NO. 027.6485 SER. No. 160602), automatic sampler (CAMAG Linomat 5 No. 170610), seperangkat komputer (AOC), bejana kromatografi (CAMAG, flat bottom chamber 20 x 20 cm), neraca semi mikro (SCALTEC SBC 22, max 60/120 g, min 0,001 g), neraca ultra mikro (RADWAG UYA 2.3Y, max 2 g), oven (POSTBUS 7018-3502 KA ultrech), syringe, mikropipet (Socorex) dan alat-alat gelas yang umum digunakan dalam penelitian (Pirex).
F. Tata Cara Penelitian 1. Pemilihan dan pengambilan sampel
Sampel kapsul racikan dengan zat aktif ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin diambil di Rumah Sakit X dengan resep sebagai berikut:
R/ Teofilin pulvis 1,8 g
Ambroxol tab 30 mg 30 tab
Salbutamol 4 mg 30 tab
M f pulv caps no 60 S b d d 1 caps
2. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol,etil asetat, kloroform, dan amonia 25% dengan perbandingan (12,4%; 19,8%;
65,3%; 2,5%) dan jarak elusi 8 cm yang telah dioptimasi (Donabella, 2022).
3. Aktivasi plat KLT
Fase diam yang digunakan adalah plat silika gel 60 F254 yang dipanaskan dalam oven selama 30 menit pada suhu 110°C.
4. Penjenuhan bejana
Dijenuhkan dengan fase gerak yang dimasukkan dalam bejana yang sudah diberi kertas saring bagian tepinya secara keseluruhan, kemudian bejana ditutup dan ditunggu hingga fase gerak menyerap sampai ujung atas kertas saring.
5. Pembuatan larutan baku stok dan seri a. Ambroxol hidroklorida
Sejumlah 15 mg baku ambroxol hidroklorida ditimbang kurang lebih dan dimasukkan dalam labu takar 10 mL lalu ditambahkan metanol hingga tanda batas untuk membuat larutan stok ambroxol hidroklorida 1500 ppm.
Larutan stok ambroxol hidroklorida 1500 ppm diambil sebanyak 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL; 2,5 mL lalu masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 10mL dan diencerkan hingga tanda batas menggunakan metanol sehingga didapatkan seri larutan baku ambroxol hidroklorida 150 ppm;
300 ppm; 450 ppm; 600 ppm; 750 ppm.
b. Salbutamol sulfat
Sejumlah 2 mg baku salbutamol sulfat ditimbang kurang lebih dan dimasukkan dalam labu takar 10 mL lalu ditambahkan metanol hingga tanda batas untuk membuat larutan stok salbutamol sulfat 200 ppm.
Larutan stok salbutamol sulfat 200 ppm diambil sebanyak 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL; 2,5 mL lalu masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL dan diencerkan hingga tanda batas menggunakan metanol sehingga didapatkan seri larutan baku salbutamol sulfat 20 ppm; 40 ppm; 60 ppm; 80 ppm; 100 ppm.
17
c. Teofilin
Sejumlah 30 mg baku teofilin ditimbang kurang lebih dan dimasukkan dalam labu takar 10 mL lalu ditambahkan metanol hingga tanda batas untuk membuat larutan stok teofilin 3000 ppm. Larutan stok teofilin 3000 ppm diambil sebanyak 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL; 2,5 mL lalu masing- masing dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL dan diencerkan hingga tanda batas menggunakan metanol sehingga didapatkan seri larutan teofilin 300 ppm; 600 ppm; 900 ppm; 1200 ppm; 1500 ppm.
6. Preparasi sampel
Sebanyak 10 sampel kapsul racikan ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin ditimbang masing-masing ambroxol hidroklorida 15 mg, 2 mg salbutamol sulfat, 30 mg teofilin kemudian dicampur dan digerus dengan mortir. Kemudian ditimbang seksama lebih kurang bobot yang setara dengan 15 mg ambroxol hidroklorida, 2 mg salbutamol sulfat, dan 30 mg teofilin.
Sampel dilarutkan menggunakan metanol dalam labu takar 10 mL dan kemudian disaring menggunakan kertas saring. Larutan yang telah disaring dipipet sebanyak 0,6 mL lalu dimasukkan kedalam labu takar 10 mL dan diencerkan denganmetanol hingga tanda batas. Sampel dibuat sebanyak 6 kali replikasi.
7. Penentuan Selektivitas
Larutan baku stok dan sampel racikan dari Rumah Sakit X yang sudah dilarutkan diambil 5,0 μL ditotolkan menggunakan autosampler pada plat KLT yang sudah diaktivasi lalu dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan fase gerak. Setelah elusi pada tahap optimasi plat dikeluarkan dan dikeringkan dengan cara di angin-anginkan. Plat yang sudah kering dianalisis pada densitometer pada panjang gelombang maksimal, diamati nilai Rf dan dihitung nilai Rs.
8. Pembuatan kurva baku, penentuan linieritas, dan rentang
Seri larutan baku teofilin 300; 600; 900; 1200; 1500 ppm, ambroxol hidroklorida 150; 300; 450; 600; 750 ppm, salbutamol sulfat 20; 40; 60; 80; 10 ppm masing-masing ditotolkan dengan volume penotolan 5,0 µL pada plat
KLT dengan fase diam silika gel 60 F254 lalu dikeringkan dan dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi fase gerak. Setelah mencapai jarak rambat 8 cm, lempeng dikeluarkan dan dikeringkan. Plat hasil pengembangan kemudian diukur AUC dengan densitometer. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Hubungan antara AUC dan konsentrasi dinyatakan sebagai y = bx + a, dimana nilai x sebagai konsentrasi dan y sebagai nilai AUC.
9. Penentuan akurasi dan presisi
Larutan stok ambroxol diambil sebanyak 0,5 mL; 1,5 mL; 2,5 mL, salbutamol sebanyak 0,5 mL; 1,5 mL; 2,5 mL, dan teofilin sebanyak 0,5 mL; 1,5 mL; 2,5 mL lalu masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL yang sudah berisi sampel yang diracik oleh peneliti yang ditimbang setara 15 mg ambroxol hidroklorida, 2 mg salbutamol sulfat, dan 30 mg teofilin diberi perlakuan sama seperti pada poin pembuatan kurva dan penentuan linieritas. dilakukan secara intraday (3 hari berturut- turut) dan interday (replikasi 3 kali), selanjutnya dilakukan pengukuran kadar dengan persamaan kurva baku yang didapat pada poin pembuatan kurva dan penentuan linieritas.
G. Analisis Hasil 1. Selektivitas
Selektivitas dilihat dari nilai Rs dengan rumus:
𝑅𝑠 = (𝑅𝑓2 − 𝑅𝑓1) 0,5 (𝑊1 + 𝑊2) Keterangan:
- Rf1 (nilai maksimum Rf1) - Rf2 (nilai maksimum Rf2)
- W1 (lebar puncak komponen pertama pada baseline) - W2 (lebar puncak komponen kedua pada baseline)
(Srivastava, 2011)
19
2. Linieritas dan rentang
Nilai linieritas dan rentang yang baik dilihat dari nilai koefisien korelasi (r).
Nilai koefisien kolerasi (r) yang baik adalah ≥ 0,99 (AOAC International, 2019).
3. Akurasi
Akurasi dapat dilihat dari nilai persen perolehan kembali dengan rumus:
𝑃𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛 𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ𝑎𝑛 𝑘𝑒𝑚𝑏𝑎𝑙𝑖 (%) =𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠 × 100%
(AOAC International, 2019)
4. Presisi
Presisi dilihat dari nilai relative standar deviasi dengan menghitung nilai SD dan CV dengan rumus:
𝐶𝑉 = 𝑆𝐷 (𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢)
𝑥 𝑏𝑎𝑟 (𝑛𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑟𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎× 100%
(Harmita & Manurung, 2014) 5. Parameter validasi yang digunakan yaitu parameter selektivitas (nilai Rs >
1,5), linieritas dan rentang (nilai r = 0,99), akurasi (nilai persen perolehan kembali = 90-107%), dan presisi (nilai koefisien variasi ≤ 5,3%).
20 BAB IV
HASIL & PEMBAHASAN
Larutan baku ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin dibuat dengan melarutkan baku dalam konsentrasi tertentu dengan menggunakan metanol, sehingga diperoleh larutan stok yang kemudian dapat dibuat menjadi larutan seri baku. Penelitian ini menggunakan 5 seri konsentrasi dengan mempertimbangkan perbandingan yang tertera dalam resep, yaitu ambroxol hidroklorida 15 mg, salbutamol sulfat 2 mg, dan teofilin 30 mg dalam tiap tablet, hal ini dilakukan agar respon analit yang terdapat dalam sampel masuk ke dalam range seri larutan baku agar dapat dilakukan penetapan kadar.
Pembuatan fase gerak dalam penelitian ini menggunakan hasil komposisi fase gerak pada tahap optimasi, yaitu kloroform: etil asetat: methanol: ammonium klorida dengan perbandingan (7,9; 2,4; 1,5; 0,3) yang memiliki nilai indeks polaritas 4,43. Pembuatan fase gerak menggunakan komposisi ini dapat memisahkan ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin secara optimal. Fase gerak ini memiliki sifat non-polar sesuai dengan nilai indeks polaritasnya sedangkan fase diam yang digunakan, yaitu silika gel 60 F254 bersifat polar, sifat non polar dari fase gerak ini akan menahan senyawa polar di fase diam yang berisfat polar dan akan membawa senyawa yang kurang polar naik ke atas (Husna et al, 2020). Prinsip pembuatan fase gerak menggunakan prinsip pencampuran bahan dari berat jenis terendah ke berat jenis yang lebih tinggi sehingga dapat tercampur dengan baik (Wulandari, 2011). Fase gerak dimasukkan ke dalam bejana untuk dibuat jenuh, dengan cara menutup rapat bejana dan mendiamkannya selama beberapa saat agar atmosfer dalam bejana terjenuhkan dengan uap pelarut sehinggi eluasi kecepatan eluen sama dengan semua sisi permukaan plat KLT (Husna et al, 2020).
21
Gambar 4. Aktivasi gugus silanol setelah pemanasan
Plat silika gel 60 F254 memiliki ukuran pori-pori 60 Å, F254 menunjukkan bahwa plat dapat berfluoresensi dibawah sinar ultraviolet yang mempermudah dalam uji kualitatif senyawa dibawah sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254 (Husna et al, 2020). Sebelum plat digunakan, plat perlu diaktivasi terlebih dahulu dengan menggunakan oven pada suhu 110 °C selama 30 menit, aktivasi plat dilakukan untuk menghilangkan air yang mungkin terdapat silika, supaya menghindari interaktsi antara air dan silika (Wulandari, 2011). Gambar 4.
menunjukkan perbedaan reaksi antara plat silika sebelum dipanaskan dan sesudah dipanaskan. Gugus silanol pada plat silika gel berinteraksi dengan uap air disekitarnya jika belum dipanaskan. Setelah plat dipanaskan uap air akan menghilang dan gugus silanol dapat beinteraksi dengan senyawa analit. Bejana yang digunakan dalam penelitian ini berukuran 20 x 20 cm dengan bahan kaca.
Sebelum digunakan, bejana dijenuhkan menggunakan fase gerak untuk menyamakan tekanan uap didalam bejana. Pada tahap optimasi menggunakan fase gerak kloroform: etil asetat: methanol: ammonium klorida dengan perbandingan (12,4%; 19,8%; 65,3%; 2,5%), jarak elusi 8 cm, volume penotolan 5,0 µL. Nilai Rf, asimetri, dan tailing factor ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin yang didapatkan secara berturut-turut, yaitu 0,80; 0,22; 0,33 dengan resolusi 1,5 dan 4,95. Nilai asimteri yang didapatkan adalah 1,05; 1; 0,9. Nilai tailing factor 1,07; 0,92; 0,98. Jarak elusi dan volume totolan dalam penelitian ini menggunakan hasil pada tahap optimasi yaitu jarak elusi 8 cm dan volume penotolan 5,0 µL menggunakan fase gerak kloroform: etil asetat: methanol:
ammonium klorida dengan perbandingan (7,9; 2,4; 1,5; 0,3) (Donabella, 2022).
110 °C 30 menit
Gambar 5. Pola spektra baku ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin
Penetapan panjang gelombang pengamatan diperlukan untuk mengetahui panjang gelombang optimal pada pengukuran bersama bersama antara ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin. Hal ini diperlukan agar pada saat pengukuran mampu dikuantifikasikan dan meminimalkan kesalahan. Hasil deteksi pada tahap optimasi menunjukkan panjang gelombang 245 nm untuk ambroxol hidroklorida, 279 nm untuk salbutamol sulfat, dan 274 nm untuk teofilin. Untuk analisis multikomponen menggunakan panjang gelombang 279 nm karena ketiga spektra saling tumpeng tindih (Donabella, 2022).
Fase diam Fase gerak
(a) Ambroxol
Hidroklorida
Teofilin
Salbutamol Sulfat
23
Fase diam Fase gerak
(b)
Fase diam Fase gerak
(c)
Gambar 6. Interaksi fase diam dan fase gerak dengan analit (a). Salbutamol sulfat; (b). Teofilin; (c). Ambroxol
hidroklorida Keterangan:
Interaksi hidrogen Interaksi van der waals Interaksi dipol-dipol
Pada Gambar 6. Menunjukkan interaksi yang terjadi dengan analit, terlihat bahwa salbutamol sulfat memiliki sifat polar karena memiliki interaksi yang cenderung kuat dengan fase diam dibandingkan dengan fase gerak. Ambroxol hidroklorida dan teofilin memiliki sifat non polar karena memiliki interaksi yang cenderung kuat dengan fase gerak dibandingkan dengan fase diam. Hal ini dapat berpengaruh terhadap jarak migrasi tiap senyawa pada saat proses analisis. Oleh karena itu, diperlukan komposisi fase gerak dan panjang jarak elusi yang optimal
agar mampu memisahkan salbutamol sulfat, teofilin, dan ambroxol hidroklorida dengan optimum (Donabella, 2022).
A. Penentuan Selektivitas
Selektivitas ditentukan dengan cara menotolkan baku dan sampel racikan Rumah Sakit X yang sudah dipreparasi pada plat KLT yang sudah diaktivasi menggunakan autosampler sebanyak 5,0 µL, lalu dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan fase gerak. Setelah elusi, plat dikeluarkan dan dikeringkan dengan cara di angin-anginkan. Plat yang sudah kering dianalisis pada densitometer pada panjang gelombang maksimal, diamati nilai Rf dan dihitung nilai Rs. Nilai Rf dan Rs dari ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin dipengaruhi oleh fase gerak dan fase diam.
Nilai Rf dan Rs dalam suatu senyawa dapat dijelaskan dari polaritas masing- masing senyawa dan kesesuaiannya terhadap polaritas dari fase gerak yang digunakan. Fase gerak yang digunakan yaitu campuran antara kloroform: etil asetat: metanol: ammonium klorida dengan perbandingan (7,9; 2,4; 1,5; 0,3) yang memiliki nilai indeks polaritas 4,43. Hasil pada tahap optimasi menunjukkan indeks polaritas tersebut memiliki kesesuaian polaritas dengan tiga senyawa yang akan diteliti, sehingga ketiga senyawa ini akan dapat terelusi oleh fase gerak dan antar senyawa akan terpisah.
Gambar 7. Kromatogram baku dan sampel
Salbutamol sulfat
Teofilin
Ambroxol Hidroklorida BAKU
SAMPEL
25
Tabel IV. Rf baku, Rf sampel, dan nilai resolusi (Rs) Senyawa Rf baku Rf sampel Rs
Salbutamol Sulfat 0,20 0,20
1,857
&
5,647
Teofilin 0,33 0,34
Ambroxol Hidroklorida 0,81 0,81
Nilai selektivitas yang baik menurut AOAC, (2019) yaitu nilai Rs ≥ 1,5.
Tabel IV. menunjukkan data nilai Rf dan Rs dari sampel dan baku, pada penelitian ini nilai Rf sampel dan baku sama atau memiliki selisih 0,01, menunjukkan bahwa sampel ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin memiliki kesamaan dengan baku. Nilai Rs pada sampel salbutamol sulfat dan teofilin adalah 1,857 sedangkan pada sampel teofilin dan ambroxol hidroklordia adalah 5,647. Hasil ini menunjukkan bahwa metode selektivitas memenuhi kriteria selektivitas yaitu nilai Rs ≥ 1,5. Metode KLT densitometri yang digunakan untuk menentukan selektivitas sampel dan baku senyawa merupakan metode yang selektif karena dapat mengukur dan memisahkan analit dari senyawa lain yang terdapat dalam sampel.
Gambar 8. Pola spektra ambroxol hidroklorida Baku
Sampel
Gambar 9. Pola spektra salbutamol sulfat
Gambar 10. Pola spektra teofilin
Gambar 7. menunjukkan bahwa baku dan sampel ambroxol hidroklorida, Gambar 8. menunjukkan bahwa baku dan sampel salbutamol sulfat, dan Gambar 9. menunjukkan bahwa baku dan sampel teofilin, terlihat memiliki spektra yang bertumpang tindih atau berdekatan pada panjang gelombang masing-masing senyawa. Hal ini menunjukkan bahwa sampel yang dideteksi mengandung senyawa ambroxol hidrklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin. Hasil panjang gelombang yang tampak pada spektra menunjukkan hasil panjang gelombang yang sama dengan baku pada masing-masing senyawa.
Baku
Sampel
Baku
Sampel
27
B. Penentuan Linieritas
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode memiliki hubungan yang sebanding antara konsentrasi dan respon setelah pengukuran. Pada penelitian ini, linieritas ditentukan dengan menghitung kurva baku yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi dengan nilai AUC (Area Under Curve). Batas rentang konsentrasi penelitian ini digunakan untuk menghitung kurva baku dengan konsentrasi ambroxol hidroklorida 150 ppm; 300 ppm; 450 ppm; 600 ppm; 750 ppm, salbutamol sulfat 20 ppm; 40 ppm; 60 ppm; 80 ppm; 100 ppm, teofilin 300 ppm; 600 ppm; 900 ppm; 1200 ppm; 1500 ppm. Penentuan linieritas dilakukan sebanyak 3 kali replikasi dengan metode yang sama kemudian dianalisis menggunakan KLT densitometer.
Nilai linieritas yang baik dilihat dari nilai koefisien korelasi (r), berdasarkan AOAC (2019) nilai koefisien korelasi yang baik adalah ≥ 0,99. Data nilai koefisien korelasi yang terbaik yaitu replikasi 3 dalam 1 hari pada senyawa ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin secara berturut-turut adalah 0,9960; 0,9972; 0,9970. Pada replikasi 3 yang paling linier, memiliki persamaan kurva baku pada senyawa ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin secara berturut-turut adalah y = 12,655x + 462,71; y = 11,751x + 51,6; y = 13,603x + 12040. Persamaan ini digunakan untuk menghitung kadar senyawa ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin yang digunakan untuk penentuan akurasi dan presisi.
Gambar 11. Kurva baku ambroxol hidroklorida
Gambar 12. Kurva baku salbutamol sulfat
Gambar 13. Kurva baku teofilin
2580,2 4235
5706,2
8153,1
10112,2
y = 12,655x + 462,71 r = 0,9960 0
2000 4000 6000 8000 10000 12000
0 200 400 600 800
Linieritas Ambroxol Hidroklorida
265
546,9 745,3
1025,1 1201
y = 11,751x + 51,6 r = 0,9972 0
200 400 600 800 1000 1200 1400
0 20 40 60 80 100 120
Linieritas Salbutamol Sulfat
15523,8
20692,2 2462528598,331975,4
y = 13,603x + 12040 r = 0,9970 0
10000 20000 30000 40000
0 500 1000 1500 2000
Linieritas Teofilin
AUC
Konsentrasi (ppm)
AUC
Konsentrasi (ppm)
AUC
Konsentrasi (ppm)
29
C. Penentuan Akurasi dan Presisi
Suatu metode dapat dikatakan akurat dan presisi jika kadar yang terukur memiliki kedekatan dengan kadar sebenarnya dan dalam kondisi yang sama, dalam hal ini dinyatakan sebagai %recovery dan % koefisien variasi (CV).
Penentuan akurasi dan presisi dalam penelitian ini menggunakan metode adisi yaitu pencampuran baku masing-masing senyawa pada tiap konsentrasi dan sampel yang sudah diracik oleh peneliti yaitu sampel yang sudah dicampur dan ditimbang setara 15 mg ambroxol hidroklorida, 2 mg salbutamol sulfat, dan 30 mg teofilin.
Akurasi dan presisi ditentukan dengan menganalisis sampel yang diadisi baku dengan 3 konsentrasi baku (rendah, sedang, tinggi) pada masing-masing senyawa yaitu ambroxol hidroklorida 150 ppm; 450 ppm; 750 ppm, salbutamol sulfat 20 ppm; 60 ppm; 100 ppm, teofilin 300 ppm; 900 ppm; 1500 ppm.
Penentuan akurasi dan presisi dilakukan secara intraday dan interday, hal ini dilakukan agar dapat melihat keterulangan saat melakukan analisis dengan metode yang sama dan laboratorium yang sama. Menurut AOAC (2019), nilai akurasi yang baik dilihat dengan nilai persen perolehan kembali 90-107% untuk konsentrasi 100 ppm, 95-105% untuk konsentrasi 1.000 ppm, 97-103% untuk konsentrasi 10.000 ppm. Nilai presisi yang baik dilihat dengan nilai persen koefisien variasi (CV) 5,3% untuk 100 ppm; 3,7% untuk 1.000 ppm; 2,7% untuk 10.000 ppm.
Tabel V. Penentuan akurasi dan presisi secara interday
Senyawa Konsentrasi
(% b/b) Hari %recovery %CV
Ambroxol Hidroklorida
0,15
1 100,9377 2,5406
2 103,7323 2,7207
3 97,9410 3,2501
0,45
1 100,5569 1,5456
2 100,7284 1,9730
3 103,7604 3,6352
0,75
1 101,6964 3,2960
2 99,6085 1,3284
3 97,7377 1,7271
Salbutamol Sulfat
0,02
1 97,0697 1,9020
2 101,7218 1,9251
3 102,1757 3,5728
0,06
1 98,9655 1,8664
2 97,4621 4,9851
3 97,7221 5,1080
0,1
1 101,2254 2,6787
2 99,8524 1,3334
3 102,7998 2,5701
Teofilin
0,3
1 98,1711 1,5939
2 103,2256 1,4855
3 100,4246 2,7852
0,9
1 95,1083 1,8728
2 95,5505 1,5312
3 97,2035 1,9874
1,5
1 100,0302 0,9871
2 101,897 1,2230
3 100,3228 2,5576
Data pada Tabel V. menunjukkan kadar terukur baku pada tiap konsentrasi yang telah dikurangi dengan konsentrasi sampel, data pada tabel diatas dihitung nilai persen perolehan kembali dan nilai koefisien variasi secara interday.
Penentuan akurasi dan presisi secara interday dalam penelitian ini menunjukkan hasil yang sudah memenuhi syarat akurasi dan presisi yaitu menurut AOAC (2019), nilai persen perolehan kembali 90-107% untuk konsentrasi 100 ppm, 95- 105% untuk konsentrasi 1.000 ppm, 97-103% untuk konsentrasi 10.000 ppm.
Nilai presisi yang baik dilihat dengan nilai persen koefisien variasi 5,3% untuk 100 ppm; 3,7% untuk 1.000 ppm; 2,7% untuk 10.000 ppm.
Tabel VI. Penentuan akurasi dan presisi secara intraday
Senyawa Konsentrasi
(% b/b) Replikasi Rata-Rata
%recovery
Rata-rata
%CV
Ambroxol Hidroklorida
0,15
1
99,9481 3,3103 2
3
0,45
1
101,6819 2,4192 2
31
3
0,75
1
99,6898 1,8163 2
3
Salbutamol Sulfat
0,02
1
100,3172 2,5559 2
3
0,06
1
98,1054 2,5654 2
3
0,1
1
101,2917 2,2208 2
3
Teofilin
0,3
1
101,4968 1,9694 2
3
0,9
1
95,8633 1,5415 2
3
1,5
1
100,75 1,8831 2
3
Data pada Tabel VI. menunjukkan kadar terukur baku pada tiap konsentrasi yang telah dikurangi dengan konsentrasi sampel, Penentuan akurasi dan presisi secara intraday dalam penelitian ini menunjukkan hasil yang sudah memenuhi syarat akurasi dan presisi yaitu menurut AOAC (2019), nilai persen perolehan kembali 90-107% untuk konsentrasi 100 ppm, 95-105% untuk konsentrasi 1.000 ppm, 97-103% untuk konsentrasi 10.000 ppm. Nilai presisi yang baik dilihat dengan nilai persen koefisien variasi 5,3% untuk 100 ppm; 3,7% untuk 1.000 ppm; 2,7% untuk 10.000 ppm.
32 BAB V
KESIMPULAN & SARAN A. Kesimpulan
Metode penetapan kadar ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin dengan menggunakan KLT densitometri telah memenuhi parameter validasi yang baik meliputi parameter linieritas, rentang, selektivitas, akurasi, dan presisi. Hal tersebut dibuktikan dengan nilai Rs ≥ 1,5; nilai koefisien korelasi yang baik adalah ≥ 0,99, nilai koefisien korelasi yang didapat untuk senyawa ambroxol hidroklorida pada rentang konsentrasi 150; 300; 450; 600; 750 ppm, salbutamol sulfat pada rentang konsentrasi 20; 40; 60; 80; 100 ppm, dan teofilin pada rentang konsentrasi 300; 600; 900; 1200; 1500 secara berturut-turut adalah 0,9960;
0,9972; 0,9970 dengan persamaan kurva secara berturut-turut adalah y = 12,655x + 462,71; y = 11,751x + 51,6; y = 13,603x + 12040. Nilai akurasi dan presisi secara intraday dan interday menunjukkan hasil yang sudah memenuhi syarat akurasi dan presisi yaitu nilai persen perolehan kembali 90-107% untuk konsentrasi 100 ppm, 95-105% untuk konsentrasi 1.000 ppm, 97-103% untuk konsentrasi 10.000 ppm. Nilai presisi yang baik dilihat dengan nilai persen koefisien variasi 5,3% untuk 100 ppm; 3,7% untuk 1.000 ppm; 2,7% untuk 10.000 ppm.
B. Saran
Panjang gelombang yang digunakan dalam proses analisis menggunakan panjang gelombang pada masing-masing senyawa agar tampak puncak yang lebih maksimal pada masing-masing senyawa. Hasil penelitian ini perlu diaplikasikan pada penetapan kadar ambroxol hidroklorida, salbutamol sulfat, dan teofilin dalam racikan kapsul dengan menggunakan metode KLT densitometri.
