3 METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada bulan Agustus sampai dengan September 2010, bertempat di PT. Lautan Niaga Jaya, Muara Baru – Jakarta Utara, dan Balai Pengujian Mutu dan Pengolahan Hasil Perikanan dan Kelautan DKI Jakarta (BPMPHPK DKI Jakarta).
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk analisis histamin dengan spektrofluorometri dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (SNI 2354.10:2009) adalah labu erlenmeyer, gelas ukur, pisau, homogenizer (blender), water bath, labu ukur, kertas saring Whattmann, spektrofluorometer tipe Varian Cary Eclipse FL0811M007, glass wool, pipet volumetrik, pipet tetes, kolom kromatografi, timbangan analitik dan buret. Alat yang digunakan pada analisis TVB (SNI 2354.8:2009) adalah blender, buret, corong gelas, erlenmeyer, gelas piala, kertas saring Whattman, labu takar, seperangkat alat destilasi uap, dan timbangan analitik dengan ketelitian 0,0001 gram. Alat yang digunakan untuk analisis Total Plate Count (TPC) (SNI 01-2332.3-2006) dan analisis bakteri penghasil histamin dengan media Niven (Modifikasi Niven 1981) adalah laminar, pipet volumetrik, Homogenizer, plastik steril, cawan petri, inkubator, autoklaf, talenan, water bath, dan stopwatch.
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan laut jenis tuna (Thunnus sp.), sedangkan bahan-bahan lainnya adalah metanol, resin penukar ion (dowex 1-x800-100-mesh), aquades, HCl, NaOH, H3PO4,
ortoptalatdikarboksilaldehide (OPT), larutan TCA, asam borat, K2CO3, vaseline,
indikator conway, larutan Butterfield’s Phospate Buffered, Plate Count Agar (PCA), Media niven (0.1% trypton, 0.2% yeast ekstrak, 0.1% L-histidin, 0.1% CaCO3, 2% NaCl, 2.5% agar, 0.01% phenol red).
3.3 Alur Penelitian
Penelitian dimulai dengan tahapan pengambilan sampel di PT. LNJ, Muara Baru, Jakarta Utara. Sampel diambil dari ikan tuna segar yang baru tiba sebanyak 300 gram per bagian tubuh yang akan diuji, yakni bagian tubuh depan, perut, dan ekor ikan tuna. Sampel dimasukkan ke dalam plastik High Density Poly Etylen (HDPE) yang telah disterilkan dengan autoklaf untuk menghindari kontaminasi. Kemudian dimasukkan ke dalam cool box berukuran 25 liter yang telah diisi es berbentuk flake.
Setelah sampel tersimpan baik di dalam cool box, sampel ikan tuna kemudian dibawa menuju ruang preparasi sampel, laboratorium organoleptik Balai Pengujian Mutu dan Pengolahan Hasil Perikanan dan Kelautan DKI Jakarta (BPMPHPK DKI Jakarta) dengan menempuh waktu perjalanan 15 menit dari PT.LNJ.
Preparasi sampel dilakukan secara aseptik dan terbagi ke dalam beberapa kelompok sampel. Pertama adalah sampel kontrol yang tidak mendapatkan perlakuan perbedaan suhu dan lama penyimpanan, diuji pada hari yang sama. Kedua adalah sampel untuk perlakuan suhu penyimpanan (0-1) °C selama 24 jam, ketiga adalah sampel untuk perlakuan suhu penyimpanan 4 °C selama 24 jam, dan terakhir adalah sampel untuk perlakuan suhu penyimpanan 30 °C selama 24 jam.
Setelah dipreparasi, sampel kontrol segera diuji Total Plate Count (TPC) dan uji bakteri penghasil histamin, dan diuji kadar histamin dan Total Volatile Base (TVB). Sampel untuk pengujian hasil perlakuan perbedaan suhu penyimpanan disimpan pada masing-masing suhu uji akan diuji setelah 24 jam penyimpanan.
3.4 Prosedur Pengujian Sampel
Prosedur kerja analisis dalam pengujian sampel pada penelitian ini meliputi analisis kadar histamin, kadar Total Volatile Base (TVB), Total Plate Count (TPC), dan analisis jumlah bakteri pembentuk histamin.
3.4.1 Analisis kadar histamin (SNI 2354.10: 2009)
Prinsip penentuan kadar histamin adalah zat histamin dalam contoh dikonversikan ke dalam bentuk –OH, kemudian diisolasi dengan resin penukar ion dan diubah ke bentuk derivatnya dengan ortoptalatdikarboksilaldehide (OPT) dan diukur secara fluorometris. Hasil yang diperoleh dinyatakan dalam ekuivalen kadar histamin. Prosedur kerja analisis kadar histamin terdiri atas tiga tahap, yaitu sebagai berikut :
a) Tahap ekstraksi
Sepuluh gram sampel ditimbang lalu ditambahkan dengan metanol sebanyak 50 ml kemudian dihomogenkan dengan homogenizer (blender) kurang lebih selama 1-2 menit. Sampel yang sudah dipanaskan dalam water bath pada suhu 60 °C selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Sampel tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, kemudian ditambahkan metanol sampai tanda tera lalu dikocok agar homogen. Setelah itu, larutan sampel disaring menggunakan kertas saring dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Filtrat dari hasil penyaringan akan digunakan pada proses clean up.
b) Tahap clean up atau tahap elusi
Pertama-tama disiapkan kolom kromatografi (panjang 20 cm dan diameter 7 mm) kemudian ke dalam kolom tersebut dimasukkan glass wool secukupnya (tingginya 1 cm). Selanjutnya resin penukar ion (dowex 1-x800-100-mesh) dimasukkan ke dalam kolom sampai tingginya kurang lebih 8 cm (diusahakan resin tidak sampai kering dengan cara dibilas dengan akuades karena akan mempengaruhi daya kerja penukar ion tersebut). Selanjutnya sampel filtrat hasil penyaringan pada tahap ekstraksi dilewatkan ke dalam kolom sebanyak 1 ml dan ditampung hasilnya dalam labu ukur yang telah diberi 5 ml HCl 1 N.
c) Tahap pembentukan
Sebanyak 10 ml HCl 0,1 N dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 5 ml sampel hasil tahap celan up/elusi, 5 ml standar histamin (sebagai larutan standar), dan 5 ml HCl 0,1 N (sebagai blanko). Setelah itu, ditambahkan 3 ml NaOH 1 N ke dalam tabung reaksi lalu dihomogenkan dan dibiarkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan lagi ortoptalatdikarboksilaldehide (OPT) 1% sebanyak 1 ml lalu dihomgenkan dan
didiamkan selama 4 menit. Selanjutnya ditambahkan 3 ml H3PO4 3,57 N dan
dihomogenkan. Setelah selesai, sampel yang telah melalui tahap pembentukan siap untuk dibaca menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang eksitasi 350 nm dan panjang gelombang emisi 444 nm. Rumus perhitungan kadar histamin (ppm) adalah sebagai berikut :
Histamin (ppm) =
IU Keterangan : IU = Absorban sampel A = Intersep B = Slope Fp = Faktor pengencer3.4.2 Analisis kadar Total Volatile Base (TVB) (SNI 2354.8:2009)
Analisis ini bertujuan untuk menentukan jumlah kandungan senyawa-senyawa basa volatil yang terbentuk akibat degradasi protein. Prosedur kerja analisis kadar TVB terbagi atas 3 tahap sebagai berikut :
a) Tahap ekstraksi
Pertama-tama sampel ditimbang sebanyak 10 gram dengan gelas piala, lalu ditambahkan 90 ml asam perklorat (PCA) 6%. Sampel dihomogenkan menggunakan homogenizer selama 2 menit. Selanjutnya sampel disaring dengan menggunakan kertas saring kasar dan menghasilkan filtrat yang akan digunakan pada tahapan selanjutnya.
b) Tahap destilasi
Sebanyak 50 ml sampel filtrat dimasukkan ke tabung destilasi, kemudian ditambahkan beberapa tetes indikator Fenolftalein dan ditambahkan beberapa tetes silikon anti foaming. Tabung destilasi dipasang pada destilator dan ditambahkan 10 ml NaOH 20% sampai basa yang ditandai dengan warna merah. Kemudian disiapkan penampung erlenmeyer yang berisi 100 ml H3BO4 3% dan
3-5 tetes indikator tashiro yang berwarna ungu. Setelah itu sampel didestilasi uap kurang lebih 10 menit sampai memperoleh destilat 100 ml sehingga pada volume akhir mencapai kurang lebih 200 ml larutan berwarna hijau. Larutan blanko
disiapkan dengan mengganti ekstrak sampel dengan 50 ml asam perklorat (PCA) 6% dan dikerjakan dengan proses yang sama dengan sampel
c) Tahap titrasi
Larutan destilat sampel dan blanko kemudian dititrasi dengan menggunakan larutan HCl 0,02 N. Titik akhir titrasi ditandai dengan terbentuknya kembali warna ungu. Perhitungan kadar TVB dapat dilakukan dengan perumusan berikut ini :
Kadar TVB (mgN/100g) = V V N HC A N
Keterangan :
Vc = volume larutan HCl pada titrasi contoh/sampel Vb = volume larutan HCl pada titrasi blanko
Ar N = berat atom nitrogen (14,007) Fp = faktor pengenceran
3.4.3 Analisis total mikroba (Total Plate Count) (SNI 01-2332.3-2006)
Prinsip kerja analisis TPC adalah pertumbuhan mikroorganisme setelah contoh diinkubasi dalam media agar pada suhu 35 °C selama 48 jam, maka
mikroorganisme tersebut akan tumbuh berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung dihitung.
Prosedur kerja analisis TPC adalah sebagai berikut: sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 25 gram dan ditambahkan 225 ml larutan Butterfield’s Phospate Buffered, kemudian dihomogenkan slama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10-1. Sebanyak 1 ml homogenat diambil menggunakan pipet steril dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml larutan Butterfield’s Phospate Buffered sehingga diperoleh contoh dengan pengenceran 10-2. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Kemudian
dilakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-3, 10-4, 10-5, dan seterusnya sesuai kondisi sampel. Selanjutnya untuk metode cawan agar tuang (pour plate method), dipipet sebanyak 1 ml dari setiap pengenceran dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril secara duplo menggunakan pipet steril. Ke dalam masing-masing cawan yang sudah berisi sampel, ditambahkan 12-15 ml media Plate Count Agar
(PCA) yang sudah didinginkan hingga mencapai suhu 45 °C. Setelah agar menjadi padat, cawan petri yang telah berisi agar dan larutan sampel tersebut dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu 35 °C. Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah koloni bakteri yang ada di dalam cawan petri menggunakan alat penghitung koloni. Jumlah koloni yang dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni bakteri antara 25-250 koloni.
3.4.4 Analisis jumlah bakteri pembentuk histamin (Niven et al. 1981)
Prinsip analisis bakteri pembentuk histamin adalah enterobactericeae akan mengubah histidin menjadi histamin melalui proses dekarboksilase yang akan menaikkan pH dan merubah warna pada media.
Media modifikasi niven agar dipersiapkan dengan cara mencampurkan semua bahan, yaitu 0,1% trypton, 0,3% yeast extract, 1,8% L-histidin monohydrochlorid monohydrat, 0,1% CaCO3, 0,5% NaCl, 2,5% agar, dan 0,003%
phenol red, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer lalu diencerkan menggunakan aquades hingga 1000 ml. Selanjutnya dipanaskan hingga mendidih dan diatur pH 6,4 kemudian disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit.
Sampel sebanyak 25 gram dimasukkan ke dalam botol yang berisi 225 ml larutan Butterfield’s Phospate Buffered, kemudian dilumatkan dengan blender hingga larutan homogen. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10-1. Dari campuran tersebut diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml larutan Butterfield’s Phospate Buffered sehingga diperoleh contoh dengan pengenceran 10-2, kemudian dikocok sampai homogen. Pengenceran dilakukan hingga 10-4. Satu ml larutan sampel hasil setiap pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri, lalu 12-15 ml media niven agar cair yang sudah didinginkan hingga mencapai suhu 45 °C dituangkan ke dalam masing-masing cawan yang
sudah berisi sampel. Setelah agar menjadi padat, cawan petri yang telah berisi agar dan larutan sampel tersebut dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu 35 °C. Selanjutnya dilakukan penghitungan jumlah koloni berwarna merah muda dengan halo pink pada latar belakang
berwarna kuning atau orange. Koloni tersebut merupakan koloni bakteri pembentuk histamin. Hasil penghitungan jumlah koloni bakteri pembentuk histamin tersebut kemudian dibandingkan dengan nilai TPC sehingga diperoleh persentase jumlah bakteri pembentuk histamin terhadap nilai TPC.
3.5 Analsis Data (Steel dan Torrie 1991)
Data hasil analsis kadar histamin, TVB, TPC, dan jumlah bakteri pembentuk histamin dianalisis menggunakan program Microsoft Excel 2007 dan SPSS. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial, yakni menunjukkan pengaruh perlakuan suhu dan kelompok bagian tubuh tuna (bagian depan, perut, dan ekor) terhadap kadar histamin, TVB, TPC, dan jumlah bakteri penghasil histamin, serta interaksi keterkaitan antara suhu perlakuan dan perbedaan bagian tubuh yang diuji. Ulangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 3 kali ulangan. Model Rancangan Acak Lengkap Faktorial adalah sebagai berikut :
Keterangan :
Yijk = Pengamatan pada satuan percobaan ke k yang memperoleh kombinasi
perlakuan taraf ke i dari faktor α dan taraf ke j dari faktor β µ = Mean populasi
αi = Pengaruh taraf ke i dari faktor α
βj = Pengaruh taraf ke j dari faktor β
(αβ)ij = Pengaruh taraf ke i dari faktor α dan taraf ke j dari faktor β
εijk = Pengaruh acak satuan ke k yang memperoleh kombinasi perlakuan
Apabila hasil analisis data menunjukkan hasil yang berbeda nyata, maka dilakukan uji lanjut tukey atau uji Beda Nyata Jujur (BNJ) yang bertujuan untuk mengetahui perlakuan mana yang memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap parameter yang dianalisis. Rumus pengujian dengan Uji Tukey (BNJ) adalah sebagai berikut:
Keterangan :
q = Nilai pada tabel q p = Perlakuan
dbs = Derajat bebas sisa α = 0,05
