ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA
SECARA HAYATI
Potensi Antibiotika :
Adalah kekuatan suatu antibiotika dalam menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya
dalam IU/mg atau ug/mg
Penetapan potensi antibiotika secara mikrobiologi merupakan metode penetapan hayati, sebagai jasad renik digunakan mikroorganisme.
Sebagai pembanding digunakan antibiotika yang telah diketahui kemurnian dan kekuatan/potensinya.
ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA
SECARA HAYATI
Prinsipnya:
Adalah membandingkan respon dari mikroba uji yang peka dalam kondisi percobaan yang sama terhadap zat baku standar dan zat uji.
Sebagai zat baku standar digunakan zat/senyawa yang telah diketahui kemurnian dan kekuatan/potensinya.
ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA SECARA HAYATI
Respon yang diamati :
Adalah berupa efek hambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji yang ditunjukkan oleh daerah bening
(inhibition zone) di sekeliling zat uji (Cara Difusi)
atau kekeruhan (turbiditas) yang ditimbulkan oleh
pertumbuhan mikroba dalam medium cair (Cara Turbidimetri).
Cara Analisis :
Analisis potensi antibiotika yang dilakukan selama ini dapat dikelompokkan atas 2 bagian yaitu
1. Cara Difusi Agar (Cara Lempeng)
Prinsipnya, yaitu zat yang akan diuji berdifusi dari pencadang (reservoir) ke dalam medium agar yang telah diinokulasi dengan mikroba uji.
Inkubasi selama waktu tertentu dan kemudian diamati adanya hambatan pertumbuhan mikroba uji dan diukur diameter hambatannya.
Diameter hambatan yang terbentuk dibandingkan dengan diameter
2. Cara Turbidimetri (Cara Tabung)
Dengan cara ini digunakan media cair, hambatan
pertumbuhan mikroba uji diukur dengan menentukan kekeruhan (turbiditas) larutan dengan suatu alat yang cocok, misalnya spektrofotometer.
Beberapa faktor penting yang diperlukan dalam analisis potensi antibiotika:
1. Mikroba Uji
- Mikroba uji yang digunakan harus berasal dari galur murni
- Dapat memberikan respon yang bertingkat antara peningkatan konsentrasi dengan peningkatan daerah hambatannya.
- Untuk penetapan dengan cara difusi, daerah hambatan yang terbentuk harus jelas dan mudah diukur,
- Untuk penetapan cara tabung (turbidimetri) perbedaan kekeruhan pada tingkat dosis tertentu harus terlihat jelas.
Beberapa faktor penting yang diperlukan dalam analisis potensi antibiotika:
2. Baku Pembanding Biologi
Sebagai baku pembanding biologi (biological reference) digunakan antibiotika yang telah diketahui kemurniaan dan potensinya secara pasti.
Baku pembanding ini direkomendasi oleh Badan
Kesehatan Dunia (WHO) dan di Indonesia melalui Badan POM RI (SBI, SPI, SBN, SPN, SBL)
Baku ini diberikan dalam bentuk baku sekunder atas permintaan laboratorium-laboratorium penelitian atau Perguruan Tinggi.
3. Media Perbenihan
Media perbenihan yang digunakan harus mendukung pertumbuhan mikroba uji atau
dapat menumbuhkan mikroba uji dengan baik.
Media perbenihan tidak boleh mengandung zat yang bersifat antagonis ataupun mempengaruhi aktivitas antimikroba dari antibiotika yang diperiksa.
Di pasaran banyak ditemui media perbenihan dengan
berbagai merek dengan kode Antibiotic Medium No. 1, 2, 3 dan sebagainya.
4. Larutan Dapar
Digunakan untuk melarutkan antibiotika yang akan diperiksa,
baik baku pembanding maupun sampel uji.
Pemilihan larutan dapar yang digunakan disesuaikan dengan sifat dan stabilitas bahan yang akan diuji.
Pemilihan terhadap metode
Pemilihan metode mana yang akan dipakai pada penetapan potensi antibiotika, apakah cara difusi atau cara tabung tergantung pada pengalaman yang dimiliki dan fasilitas laboratorium yang ada.
Akan tetapi untuk zat-zat tertentu pemilihan tidak dapat
dilakukan sekehendak hati, karena sifat bahan yang akan diuji tersebut.
Misalnya tirotrisin karena difusinya yang jelek tidak akan memberikan hasil yang memuaskan bila menggunakan cara difusi,
sebaliknya sefaloridin dengan cara tabung tidak cocok bila sampel mengandung hasil urainya yang menyebabkan sampel tetap keruh pada berbagai tingkat pengenceran.
Kelebihan dan kekurangan
dari kedua metode
1.
Cara turbidimetri
, biasanya mempunyai range daerah pengerjaan yang sempit dengan perbandingan tingkatdosis kurang dari 5 : 1.
Sebaliknya pada cara difusi, range tersebut lebih lebar sehingga dimungkinkan perbandingan tingkat dosis sampai 100 : 1.
2.
Cara turbidimetri,
hanya memerlukan waktu inkubasi kurang dari 4 jam, sedangkan cara difusi memerlukan waktu paling kurang 18-24 jam.Kelebihan dan kekurangan dari kedua metode
3.
Cara turbidimetri
adalah mengukur aktivitas total dari antibiotika yang diuji, sedangkan cara difusi tergantung pada kecepatan difusi zat aktif, sehingga adakemungkinan tidak mengukur aktivitas totalnya.
4.
Cara turbidimetri
tidak dipengaruhi oleh sifatdifusibilitas dari zat aktif, sedangkan cara difusi sangat dipengaruhi oleh hal lain tersebut.
Disain Analisis Potensi Antibiotika
Dalam penentuan potensi antibiotika secara mikrobiologi, disain percobaan yang digunakan tergantung pada
ketepatan hasil yang diinginkan.
Biasanya digunakan tiga tingkat dosis , baik untuk sediaan uji maupun pembanding.
Pengulangan dilakukan masing-masing 2-8 kali untuk cara difusi dan 2-6 kali untuk cara turbidimetri.
Pada penetapan rutin seperti Laboratorium Kontrol Kualitas Obat Pemerintah, biasanya dipakai susunan dosis 3 : 3 tersebut.
Tingkat dosis yang berdampingan harus tetap, misalnya 2 : 1 atau 4 : 3.
METODE DIFUSI AGAR
Metode analisis potensi antibiotioka dengan cara
difusi agar merupakan cara yang sederhana dan hasil yang diperoleh cukup teliti.
Cara ini merupakan cara terpilih (selected method) dan
direkomendasi oleh International Collaborative Study di Swedia dan Food and Drug Administration di Amerika Serikat untuk
pengujian mutu antibiotika.
Prinsip penetapannya, yaitu mengukur luas hambatan
pertumbuhan mikroba uji yang disebabkan oleh zat baku standar dan zat yang diuji.
Dalam range konsentrasi tertentu, terdapat hubungan yang linier antara peningkatan konsentrasi dengan luas daerah hambatan pertumbuhan mikroba uji.
Prof. Dr. Akmal Djamaan, MS, Apt
Faktor yang dapat mempengaruhi luas daerah
hambatan dengan cara difusi-agar :
Faktor yang dapat mempengaruhi luas daerah hambatan dengan
cara difusi-agar :
1. Ingredien Medium Pertumbuhan
Komposisi ingredien yang umum terdapat pada medium pertumbuhan mikroorganisme adalah :
- pepton - agar
- tripton - mineral - ekstrak ragi
Banyak mineral yang dapat mempengaruhi aktivitas antibiotika,
misalnya kalsium, magnesium dan besi akan mempengaruhi sensitifitas pertumbuhan daerah hambatan yang dihasilkan oleh tetrasiklin dan
gentamisin.
Natrium klorida mengurangi aktivitas antibiotika golongan aminoglikosida dan menambah aktivitas fersidin.
Karbohidrat pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas nitrofurantoin atau ampisilin.
2. Pemilihan Medium Pertumbuhan
Untuk memperoleh hasil yang tetap dan reprodusibel,
diperlukan persiapan medium yang cocok bagi pertumbuhan mikroorganisme,
demikian pula ketebalan dan konstituen harus merata pada medium agar.
3. Pengaruh pH
Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan
disebabkan oleh aktivitas antibiotika yang tergantung pada pH medium.
Aktivitas antibiotika golongan aminoglikosida diperkuat dalam suasana asam, sedangkan aktivitas tetrasiklin berlaku sebaliknya.
Gas karbondioksida yang ada alam atmosfir dapat pula menambah keasaman larutan atau medium yang
digunakan pada penetapan.
4. Ukuran Inokulum
Luas daerah hambatan akan semakin kecil, jika inokulum semakin besar kandugnan mikroorganismenya.
Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan mikroorganisme homogen.
Akibat pertumbuhan yang rapat dapat menyebabkan terjadinya
5. Stabilitas Mikroorganisme
Resistensi mikroorganisme terhadap suatu antibiotika dapat terjadi dalam kondisi pertumbuhan tertentu.
Oleh sebab itu regenerasi mikroorganisme perlu dilakukan secara periodik dan sewaktu-waktu diuji kemurnian dan
kepekaannya.
6. Aktivitas Antibiotika
Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik dalam suatu penetapan, terlebih dahulu perlu ditentukan kadar hambat
minimum (Minimal Inhibition Concentration) dari antibiotika yang akan diuji.
Pengaruh
pre-difusi
larutan antibiotika yang terjadi sebelum inkubasi, harus dihilangkan atau dikurangi dengan tekhnik7. Waktu Inkubasi
Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang optimal,
sehingga keseimbangan antara aktivitas antibiotika dengan daya tumbuh mikroorganisme dapat menghasilkan daerah
hambatan yang baik bagi pengukuran.
Cakram (Reservoir)
pada cara difusi agar
Cakram : Adalah tempat meletakkan sampel antibiotika yang akan dianalisis potensinya di atas medium agar yang telah memadat.
1. Silinder gelas/logam
Silinder gelas/logam tahan karat dengan diameter 6-8 mm dapat digunakan sebagai pencadang antibiotika.
Keuntungan:
Jumlah larutan antibiotika dalam silinder dapat diperbanyak untuk menjamin ketersediaan antibiotika dalam cadangan selama waktu inkubasi sesuai dengan daya tampung silinder.
Diameter hambatan yang terbentuk, semata-mata hanya disebabkan oleh difusi antibiotika selama masa inkubasi.
Kerugian:
Adalah sukar mengatur kedalaman silinder secara manual, sehingga difusi yang terjadi ada kemungkinan tidak homogen yang ditunjukkan oleh diameter hambatan yang tidak merupakan lingkaran.
2. Cakram Kertas (Paper Disc)
Dengan menggunakan cakram kertas ini, jumlah larutan
antibiotika yang diserap dapat diatur homogen sesuai dengan kapasitas dan daya serap kertas, tgt pada diameter dan
ketebalan cakram.
Akan tetapi bila komposisi kertasnya kurang baik,
maka dapat berpengaruh terhadap difusi zat uji sehingga diameter hambatan yang terbentuk akan bervariasi.
3. Cetak Lobang (Punched Holes)
Dapat dilakukan dengan melobangi medium agar yang telah diinokulasi dengan alat pengisap agar.
Keuntungannya:
Jumlah larutan antibiotika yang berdifusi dapat terukur jumlahnya dan medium yang digunakan tidak terlalu
tebal.
Kerugiannnya:
Lobang yang terbentuk sering kurang sempurna akibatnya juga akan mempengaruhi difusi zat uji.
Susunan Dosis untuk analisis :
1. Untuk Susunan Dosis 2 : 2
Baku Sampel-1 Sampel-2
Dosis Tinggi s2 (5) u2 (1) z2 (3) Dosis Rendah s1 (6) u1 (2) z1 (4) 2. Untuk Susunan Dosis 3 : 3
Baku Sampel Dosis Tinggi s3 (4) u3 (1) Dosis Menengah s2 (5) u2 (2) Dosis Rendah s1 (6) u1 (3)
Posisi masing-masingnya dalam cawan Petri dapat dilakukan secara
Prosedur Uji Potensi Antibiotika
Menurut Farmakope Indonesia Edisi 3 (1979) :
Penetapan potensi dengan cara difusi dilakukan dengan cara sebagai berikut :
Dituangkan inokulum tertentu sejumlah diperlukan ke dalam cawam Petri atau suatu lempeng bujur sangkar hingga tebal inokulum 3 sampi 4 mm.
Dasar cawan Petri atau lempeng harus rata dan letaknya horizontal supaya inokulum sama tebalnya. Biarkan pada suhu kamar selama 30 menit.
Jika digunakan cawan Petri, 6 silinder besi tahan karat atau kaca porselin dengan diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm dan tinggi 10 mm, dijatuhkan ke permukaan inokulum.
Jarak antara titik tengah silinder dengan yang lainnya lebih kurang 28-30 mm.
Silinder diisi dengan larutan pembanding dan sediaan uji dengan susunan dosis 3:3
sedemikian rupa hingga letak silinder yang berisi larutan pembanding dan sediaan uji harus berselang-seling.
Begitu juga halnya dengan dosis tinggi, dosis menengah dan dosis rendah.
Jika menggunakan lempeng bujur sangkar 36 silinder
dijatuhkan ke permukaan inokulum hingga tiap deret dan kolom terdapat masing-masing 6 silinder.
Silinder diisi dengan larutan pembanding dan sediaan uji dengan susunan dosis 3:3 sedemikian rupa hingga tiap dosis harus terdapat pada setiap deret dan kolom.
Biarkan cawan Petri atau lempeng pada suhu kamar selama 2 jam
Kecuali dinyatakan lain, inkubasi pada suhu 30-35oC
selama 16-18 jam.
Setelah masa inkubasi selesai, diangkat silinder, ukur dengan seksama diameter daerah hambatan sampai 0,1 mm.
Hitung potensi menurut pola blok rawu untuk cawan Petri dan kuadrat latin untuk lempeng bujur sangkar.
Perhitungan potensi dengan pola blok rawu, yaitu dengan cara menentukan berbagai variasi blok dari hasil
pengukuran diameter daerah hambatan untuk
menentukan harga rasio potensi dan batas kepercayaan rasio potensi.
Prosedur Metode Analisis potensi
Secara Turbidimetri :
Disiapkan beberapa tabung, sesuai dengan didisain percobaan yang telah dirancang.
Diisi dengan larutan uji dan larutan pembanding dengan susunan dosis tertentu dan kemudian ditambahkan
medium cair yang telah diinokulasi dengan mikroba uji.
Selanjutnya tabung diinkubasi pada suhu 37oC dan diaduk
pada suatu shaker inkubator selama 3-4 jam.
Setelah inkubasi, pertumbuhan mikroba uji dihentikan segera dengan jalan merendamkan tabung-tabung
tersebut ke dalam penangas air suhu 80oC atau dengan
penambahan larutan formaldehid ke dalam masing-masing tabung.
Suhu penangas air tidak boleh melebihi 80oC, karena
akan menyebabkan koagulasi protein. Selanjutnya
kekeruhan yang disebabkan oleh pertumbuhan mikroba uji diukur menggunakan spektrofotometer uv-vis pada panjang gelombang 530 nm.
Perhitungan potensi sama dengan cara difusi, dalam hal ini data kekeruhan menggantikan data diameter
Sebanyak 36 tabung ditaruh dalam rak tabung, hingga pada setiap deret dan kolom terdapat 6 tabung.
Tabung diisi secara acak dengan larutan pembanding dan sediaan uji sejumlah 0,1 ml dengan susunan dosis 3 : 3
sedemikian rupa sehingga tiap dosis terdapat dalam setiap deret dan kolom. Ditambahkan pada setiap tabung masing-masing 0,9 ml inokulum.
Siapkan dua tabung blanko, pada satu tabung tuangkan 10 ml inokulum dan pada tabung yang lainnya tuangkan 10 ml
inokulum dan 0,5 ml larutan formaldehid P.
Inkubasi dalam tangas iar suhu 37±0,5oC selama 3-4 jam.
Setelah inkubasi pada masing-masing tabung, kecuali tabung blanko, tambahkan masing-masing 0,5 ml larutan formaldehid P. Selanjutnya dengan menggunakan spektrofotometer, ukur
transmittan pada panjang gelombang 530 nm terhadap blanko tabung yang berisi inokulum dan larutan formaldehid P.
Faktor yang harus diperhatikan pada penentuan
potensi antibiotika dengan cara turbidimetri:
1. Gunakan tabung-tabung dengan ukuran dan ketebalan yang seragam sehingga rambatan panas yang
diterimanya juga sama.
2. Medium perbenihan yang telah diinokulasi hendaknya didinginkan sebelum dimasukkan ke dalam tabung.
3. Gunakan bejana inkubasi/shaker incubator dg
kapasitas yang memadai, sehingga tabung-tabung dapat diaduk dengan kapasitas yang sama.
4. Pertumbuhan mikroba uji diakhiri pada waktu yang sama.
Bila menggunakan panas, pakailah penangas air yang besar dengan suhu 80Csehingga rak tabung dapat
dicelupkan secara sempurna pada waktu yang sama. Bila menggunakan formalin, sebelum pemberian
formalin rak tabung diangkat dari bejana inkubasi, lalu dicelupkan ke dalam air es, baru kemudian
Kurva Dosis-Respon pada penentuan
potensi antibiotika dengan cara turbidimetri:
Kurva antara dosis dan respon yang diberikan umumnya linier pada range dosis tertentu.
Dosis kerja harus dipilih pada daerah linear ini. Sebelum analisis harus ditentukan kurva ini dulu untuk pemilihan
dosis yang tepat.
Kurva diplot konsentrasi sel = transmittan sebagai sumbu y dan log dosis pada sumbu x
