ENZIM ENZIM dan dan KOENZIM KOENZIM 1 1

(1)

1

LOGO

EN ZI M

da n

KOEN ZI M

-

1

I NYOMAN SUARSANA

LABORATORI UM BI OKI MI A FAKULTAS KEDOKERAN HEWAN

Com pa n y Logo

2

TOPI K

Kinetika Reaksi Enzimatis

Faktor yang mempengaruhi reaksi enzimatis Pendahuluan

Dasar dan Mekanisme kerja enzim Klasifikasi enzim

Fungsi Biomedis Enzim

Kofaktor: koenzim, apoenzim, proenzim Regulasi aktivitas enzim

Com pa n y Logo

3

Tu j u a n pe m be la j a r a n

Menget ahui klasifikasi, dan t at a nam a enzim

Menget ahui m ekanism e dan dasar ker j a enzim

Menget ahui fakt or- fakt or y ang m em pengar uhi k er j a enzim

Menget ahui ham bat an ker j a enzim Menget ahui per an enzim dalam diagnosis peny ak it

Com pa n y Logo

4

PENDAHULUAN

1. Sel sebagai r eakt or kim ia

2. Dist r ibusi enzim dan st r uk t ur sel 3. Enzim ek st r asel dan int r asel

4. Per kem bangan penget ahuan t ent ang enzim

(2)

Com pa n y Logo

5 Se l se ba ga i r e a k t or k im ia

Eukariotik

Prokariotik

Com pa n y Logo

6

Sel makhluk hidup dengan ukuran sangat

kecil dipandang sebagai reaktor kimia

Sel pusat metabolisme energi

Dalam sel reaksi berjalan tidak secara acak, tetapi sangat terarah

Dalam sel terdapat suatu mekanisme dengan berbagai subsistem yang bekerja secara KHAS (SPESI FI K) yang memungkinkan makhluk hidup menghasilkan senyawa (produk) dengan

berbagai tingkat kerumitan struktur molekul

Sel sebagai reaktor kimia

Com pa n y Logo

7

Dist r ibusi enzim dan st r ukt ur sel

Sel m enj alank an r at usan bahk an ribuan m acam reak si sek aligus

Dengan t eknik hist okim ia, sit okim a, fr ak sinasi sel: dik et ahui dist r ibusi dan lokasi ber bagai enzim dalam sel.

Mitokondria: enzim yang berhubungan dengan reaksi oksidasi-reduksi

• Siklus Krebs

• Oksidasi lemak

• Katabolisme asam amino

• Fosforilasi oksidatif

• Transport elektron

Com pa n y Logo

8

Lisosom: enzim yang mengkatalis reaksi hidrolisis (ribonuklease, asam foafatase) Inti sel: enzim yang berperan dalam biosintesis asam nukleat (DNA, RNA)

Sitoplasma: enzim glikolisis, glukonegenesis, sintesis asam lemak,

Ribosom: enzim biosintesis protein

Retikulum endoplasma: enzim sintesis lipid, sintesis steroid

(3)

Com pa n y Logo

9

Enzim ekst r asel dan int r asel

Sel dipandang sebagai reaktor kimia, maka enzim berada dan bekerja menjalankan fungsinya di dalam sel

Kesalah pahaman: dengan menganggap enzim terdapat dan bekerja diluar sel dan pada

umumnya yang dimaksud adalah enzim plasma Keperluan diagnosis: diukur enzim plasma, serum.

Enzim ekstrasel

Penelitian: enzim-enzim pencernaan Yang pasti enzim ekstrasel dan intrasel: keduanya disintesis oleh sel di dalam sel

Com pa n y Logo

10

Perkembangn Pengetahuan tentang enzim

Manusia telah lama mengenal enzim: dalam bentuk pengetahuan praktis empiris dan disebarkan secara tradisional

Mengolah bahan makanan dengan enzim

Kebiasaan membuat minuman yang diragikan

Pengolahan susu menjadi: yoghurt, koumis, kefir, keju dll.

Pembuatana tape, tempe

Com pa n y Logo

11

Enzim ber peran dalam pr oses pencer naan

Réumur (1963-1727) Perancis:

• melakukan percobaan pemberian daging yang dimasukan

dalam bola-bola kecil pada burung elang.

Spallanzani (1729-1799) Itali:

• melakukan percobaan pemberian daging yang dimasukan

dalam tabung kayu yang dilapisi kain

• Pengambilan cairan lambung, dan dicobakan ternyata dapat

melumatkan daging

William Beaumont (1785-1853) AS:

• Melaporkan secara rinci proses pencernaan pada lambung

manusia yang intinya sama dengan yang diamati pada burung elang

• Pengamatan dilakukan pada lambung manusia penjelajah

Alexis St. Martin, yang mengalami luka terbuka pada perutnya

Com pa n y Logo

12

Karakteristik dan sifat kimia dari enzim

Awalnya diantara peneliti enzim,

menggolongkan bahan ini kedalam PROTEI N ditentang keras.

Pekelharing dan Ringer (1900):

• Banyak kesamaan antara enzim dan protein (protein getah lambung dengan pepsin mempunyai sifat-sifat sama)

Summer (1926)

(4)

Com pa n y Logo

13

Kunitz,Herriots, Anson dan Northrop (1931):

• Berhasil mengkristalkan pepsin yang sama dengan peneliti Summer.

• Enzim adalah PROTEIN, telah diterima secara luas dan tidak ada lagi pertanyaan

Emil Fischer (1894):

• Sudah meneliti spesifisitas kerja enzim (meskipun sifat kimia enzim sbg protein belum diakuai). Hasil gagasanya dikenal sebagai: MODEL KUNCI DAN ANAK KUNCI (Lock and Key)

Michaelis dan Menten (1913)

• Pengetahuan tentang kinetika reaksi enzimatik: yang dikenal dengan persamaan Michaelis-Menten

Com pa n y Logo

14 Enzim dan Penyakit

Kalangan kedokt eran dan kedokt er an hew an: m em anfaat kan penget ahuan enzim unt uk t uj uan DI AGNOSI S dan PENGOBATAN

Wolgemuth (1908):

• Enzim amilase dalam urine, meningkat jumlahnya pada radang pankreas

Kay, Kings, Bodansky dan Roberts (1920-930):

• Enzim fosfatase alkali, penyakit hati

LaDue, Wroblewski dan Karmen (1955):

• Enzim SGOT

Com pa n y Logo

15

KLASI FI KASI ENZI M

Pe n ggolon ga n da n t a t a n a m a e n z im

1.Tata nama berdasarkan substrat ▪Jika dikatalis adalah glukosa: enzim glukase

2.Tata nama berdasarkan jenis ikatan kimia substrat ▪Jika dikatalis ikatan peptida: enzim peptidase

▪Jika dikatalis ikatan ester: enzim esterease

▪Jika dikatalis ikatan nukleotida: enzim nukleotidase

3.Tata nama berdasarkan jenis reaksi

▪Untuk mengoksidasi glukosa: enzim glukosa oksidase

▪Enzim yang mengkatalis pemindah gugus dinamai :

tranferase, contoh untuk memindahkan gugus NH2: enzim lebih khas dinamai: enzim amino transferase

Com pa n y Logo

16

(5)

Com pa n y Logo

17

Komisi I nternational Union of Bhiocemistry (I UB), mengklasifikasikan enzim menjadi 6 kelas, didasarkan pada reaksi biokimia yang dikatalisnya:

1. Oksidoreduktase: mengkatalis reaksi oksidasi-reduksi

Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial:

-dehidrogenase -reduktase

-oksidase -hidroksilase

-peroksidase -oksigenase

Com pa n y Logo

18

2.Transferase: mengkatalis pemindahan suatu gugus yang bukan H antara substrat dengan senyawa penerima gugus, seperti:

-gugus beratom C 1

-gugus aldehid dan keton

-gugus asil

-gugus alkil

-gugus nitrogen

-gugus mengandung fosfat

-gugus mengandung sulfur

Com pa n y Logo

19

Yang termasuk enzim transferase: a. amino transferase

b. asil karnitin transferase c. transkarboksilase

d. transaldolase dan transketolase e. glukokinase

f. piruvatkinase

Com pa n y Logo

20

3. Hidrolase: mengkatalis reaksi hidrolisis yaitu pemutusan ikatan kovalen antara karbon dengan atom lainnya dengan penambahan air.

Yang termasuk enzim ini: a. esterase

(6)

Com pa n y Logo

21

4. Liase: mengkatalis reaksi pemecahan karbon, sulfur, dan karbon-nitrogen

Yang termasuk enzim ini: a. dekarboksilase

b. aldolase c. sintase

d. hidrase atau dehidratase e. deaminase

f. nukleotida siklase

Com pa n y Logo

22

5. Isomerase: mengkatalis reaksi isomer, baik isomer optik, geometrik maupun isomer posisi.

Yang termasuk enzim ini: a. epimerase

b. rasemase c. mutase d. isomerase

Com pa n y Logo

23

6. Ligase: mengkatalis pembentukan ikatan antara C-C, C-S, C-N dan C-O. Reaksi ini perlu energi ATP

Yang termasuk enzim ini: a. sintetase

b.karboksilase

Com pa n y Logo

24

Enzim sebagai pr ot ein k at alis

Dixon dan Webb, mendefinisikan enzim sebagai suatu protein bersifat katalis. Definisi ini disebabkan oleh kemampuannya untuk mengaktifkan senyawa lain secara spesifik.

Definisi lain: enzim adalah suatu katalisator protein yang mempercepat reaksi kimia dalam sistem biologis.

(7)

Com pa n y Logo

25

Kat a k unci definisi enzim :

1. Aktif 2. Katalis 3. Protein 4. Spesifik Penjelasan:

Protein: semua enzim memiliki ciri dan sifat protein

Katalis: selain mempunyai kemampuan mengubah suatu senyawa, juga kemampuan membawa atau memindahkan suatu senyawa dari suatu keadaan ke keadaan lain dengan cara yang sesifik

Com pa n y Logo

26

Interaksi yang spesifikdari enzim dengan suatu molekul tertentu dan menyebabkan pengaktifan molekul tersebut selanjutnya mengakibatkan perubahan struktur sehingga menimbulkan gagasan akan substrat.

Substrat didefinisikan sebagai senyawa yang dikenali secaraspesifikoleh enzim dan selanjutnya diaktifkan sehingga mengalami perubahan kimia

Com pa n y Logo

27

Aktif: mengingat demikian spesifik interaksi

antara substrat dan enzim, maka bagian tersebut dinamai sebagaisitus aktif (active site) atau lebih tepat lagi situs katalitik (catalytic site)

Pertanyaanya: apakah ada senyawa spesifik yang dikenali oleh enzim tetapi tidak dapat diolah lebih lanjut sehingga senyawa tersebut tidak mengalami perubahan? [INHIBITOR]

Substrat atau inbitor: dapat menempati situs aktif enzim

Com pa n y Logo

28

O

N–C–C–

N–C–C

–N–C–C

R

H

R’

Chymotrypsin Has A Site for Specificity

O

-C

Ser

Active Site

Specificity Site

Specificity

Site Catalytic Site

(8)

Com pa n y Logo

29

Specificity of Ser-Protease Family

COO

-C Asp

COO

-C Asp

Active Site

Trypsin Chymotrypsin Elastase

cut at Lys, Arg cut at Trp, Phe, Tyr cut at Ala, Gly

Non-polar pocket

D

e

p

a

n

d

n

e

g

a

ti

v

e

ly

ch

a

rg

e

d

p

o

cke

t

Shallow and non-polar

pocket

O O

–C–N–C–C–N–

C C C C NH3

+

O O

C

O O

CH3

J

u

a

n

g

R

H

(

2

0

4

)

BC

b

a

s

ics

Com pa n y Logo

30

Kar ena enzim adalah pr ot ein m ak a k em am puan m engkat alis suat u r eaksi er at hubungannya dengan st r u k t u r m ole k u l pr ot e in t er sebut

1. Tempat aktif

Teori Interaksi antara enzim-substrat dikenal sebagaiLock and Key

Pada teori ini, substrat yang spesifik terikat pada daerah spesifik di molekul enzim. Daerah ini disebut: TEMPAT AKTIF, yaitu suatu tempat yang terdapat dalam enzim yang secara spesifik dapat mengenali dan mengikat substrat

Com pa n y Logo

31 Lock and Key Analogy:

lock = enzyme, key = substrate.

Com pa n y Logo

32

MODEL KUNCI dan ANAK KUNCI (LOCK-and KEY MODEL) KERJA ENZI M:

Tempat aktif mempunyai bentuk yang rigid

Hanya substrat yang spesifik yang matching dengan tempat aktif

(9)

Com pa n y Logo

33

Tempat aktif suatu enzim dibentuk oleh residu asam amino yang mempunyai 2 fungsi:

1.Menarik dan mengorientasikan substrat kepada gugus spesifik pada molekul substrat yang disebut GUGUS KONTAK dengan cara yang spesifik pula

2.Ikut membentuk ikatan sementara dengan molekul substrat, yang selanjutnya terjadi polarisasi dan terjadi regangan pada ikatan di dalam molekul substrat sehingga mudah dipecah dan

menghasilkan PRODUK.

asam amino yang bertindak demikian yang terletak pada tempat aktif disebut: RESIDU KATALIK

Com pa n y Logo

34 C h a rg e R e la y in

Ac

tive

Si

te

Ser 195 His 57 Asp 102

H–O–CH2

O C–O=

-Active Ser

H–N N

C C C H H CH2 Ser 195 His 57 Asp 102

-_O_–CH

2

O

C–O–= H N N–H

C C C H H CH2 Ad a p te d f ro m Al b e rt s e t a l (2 0 0 2 ) Mo le c u la r Bi o lo g y o f th e C e ll (4 e ) p .1 5 8

Com pa n y Logo

35

Active Site Stabilizes Transition State

Asp 102 His 57 Met 192 Gly 193 Asp 194 Ser 195 Cys 191 Catalytic Triad Thr 219 Ser 218 Gly 216 Ser 217 Trp 215 Ser 214 Cys 220 Specificity Site Active Site Ad a p te d f ro m D re ss le r & Po tt e r (1 9 9 1 ) D is c o ve ri n g En z y m e s , p .1 9 7

Com pa n y Logo

36

Pada um um nya t erdapat 2 m ekanism e k er j a enzim m em pengar uhi r eak si k at alisis

1.enzim meningkatkan kemungkinan molekul-molekul yang bereaksi saling bertemu dengan permukaan yang saling berorientasi.

(10)

Com pa n y Logo

37

2. Pembentukan ikatan yang sementara (non kovalen) antara substrat dengan enzim menimbulkan penyebaran elektron dalam molekul substrat dan penyebaran ini menyebabkan suatu regangan pada ikatan kovalen spesifik dalam molekul substrat sehingga ikatan kovalen tersebut menjadi mudah pecah

Com pa n y Logo

38

Reaksi enzimatis adalah reaksi terarah yang dapat digambarkan dalam urutan sbb.

1.terjadi mendekatnya gugus-gugus aktif dari kedua belah pihak,

2.terjadi pengkiblatan yang tepat dari elektron orbit gugus-gugus aktif,

3. jika 1 dan 2 tercapai, maka substrat diregang, disusul dengan transaksi proton sehingga terbentuklah senyawa baru [PRODUK], yang dilepaskan enzim. Enzim kembali kekeadaan semula dan dapat memulai lagi pekerjaanya.

Com pa n y Logo

39

Concerted Mechanism of Catalysis

1 2

3 ₄

5

O

-H

+

H

COO

-(270) Glu

(248) Tyr

O

-H

His (196)

His (69)

Glu (72)

+_{Arg (145)}

Carboxypeptidase A

C-terminus

ACTIVE SITE

Check for C-terminal

Site for specificity Active

site pocket

Substrate peptide

chain

R

N

C

N

C

COO -O

-C

+

Zn

J

u

a

n

g

R

H

(

2

0

4

)

BC

b

a

s

ics

Com pa n y Logo

40

Non- Enzyme Catalytic Mechanisms

Se ca r a u m u m pr ose s k a t a lis b u k a n e n z im d a pa t dik e lom pok a n k e da la m

Katalisis oleh asam-basa (Acid-base catalysis).

(11)

Com pa n y Logo

41

Katalisis asam-basa: asam-basa mempunyai kemampuan katalisis dengan memberi elektron (asam) dan menerima elektron (basa)

Katalisis logam-elektrostatis: katalisis seringkali melibatkan logam bekerja sama membentuk ikatan elektrostatis

Katalisis kovalen:katalisis mellaui

pembentukan ikatan kovalen sementara antara substrat dengan melekul katalis (ada gugus cenderung memberikan elektron ke gugud lain)

Com pa n y Logo

42 H O H

Acid-Base Catalysis

Ad a p te d f ro m N e ls o n & C o x (2 0 0 0 ) L e h n in g e r Pr in c ip le s o f Bi o c h e m is tr y ( 3 e ) p .2 5 2

Induced to transition state

C O = N H H C H N H + C - O O H O H -δ +δ H O H C O = N H H C H C O = N H H C H C O = N H H C H

Slow Fast Fast Very Fast

Acid-base Catalysis Acid catalysis Base catalysis Both Ad a p te d f ro m Al b e rt s e t a l (2 0 0 2 ) Mo le c u la r Bi o lo g y o f th e C e ll (4 e ) p .1 6 7 N H + C - O O H O H Specific

Com pa n y Logo

43

KI NETI KA REAKSI ENZI M

Dalam m engk at alis suat u reak si,

diasum sik an enzim ber ik at an lebih dulu dengan susbt r at . Ak ibat ik at an ini t er bent uklah apa yang dinam ai: KOMPLEKS ENZI M- SUBSTRAT.

Reaksi ini dapat t er diri dari beber apa fase:

Pembentukan kompleks substrat (ES), dimana E=enzim, S=substrat

Modifikasi dari substrat membentuk produk (P), yang masih terikat enzim (EP)

Pelepasan produk dari molekul enzim

Com pa n y Logo

44

Ketiga fase tersebut dapat ditulis dengan persamaan reaksi:

(

v

_o

)

E + S

ES

E + P

k

₂

k

₁

k

₃

k

₁

=

[ES]

[E]

[S]

k

3

=

[E] [P]

(12)

Com pa n y Logo

45

Enzyme Kinetics

Meningkatnya konsentrasi enzim,

perubahan aktivitas enzim

Substrate concentration

Exam Chapters

Sco

re

En

zyme

a

ct

ivi

ty

Student A

Student B

Student C

0 1 2 3 4 0 1 2 3 4

☺

Juang RH (2004) BCbasics 46 Com pa n y Logo

In

cre

a

se

Su

b

st

ra

te

C

o

n

ce

n

tra

tio

n

2

1 3 4 5 6 7 8

0

0 2 4 6 8

Substrate (μmole)

Pro

d

u

ct

80

60

40

20

0

S

+

E

P

(in a fixed period of time)

Juang RH (2004) BCbasics

Com pa n y Logo

47

Essential of Enzyme Kinetics

E

S

+

P

Steady State Theory

S

E

Constant ES Concentration at Steady State

S

P

E

ES

Reaction Time

C

o

n

ce

n

tra

tio

n

(13)

Com pa n y Logo

49

An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)

V_max

K_m S

v_o

1/S

1

v_o

Double reciprocal Direct plot

1)

1)Use predefined amount ofEnzyme →E

2)

2)Add substratein various concentrations→S (x 軸)

3)

3)MeasureProductin fixedTime(P/t) →v_o(y 軸)

4)

4)(x, y)plot get hyperbolic curve,estimate→V_max

5)

5)When y = 1/2 V_maxcalculatex([S]) →K_m

1 Vmax - 1 K_m 1/2 J u a n g R H ( 2 0 0 4 ) BC b a s ics

Com pa n y Logo

50

A Real Example for Enzyme Kinetics

D a ta no 1 2 3 4 0.25 0.50 1.0 2.0 0.42 0.72 0.80 0.92

Absorbance v (μmole/min)

[S]

0.21 0.36 0.40 0.46

(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per μmole (2) Reaction time was 10 min

Velocity

Substrate Product Double reciprocal

1/S 1/v 4 2 1 0.5 2.08 1.56 1.35 1.16 1.0 0.5 0 v D ire ct p lo t D o u b le r e ci p ro ca l 2.0 1.0 0 1/v

-4 -2 0 2 4

1/[S]

0 1 2 [S] 1.0 -3.8 J u a n g R H ( 2 0 0 4 ) BC b a s ics

Com pa n y Logo

51 -10 -5 0 5 10 15 20

-50 -30 -10 10 30 50

v, µ

mol/min

[S], mM

En z y m e s

Eric Niederhoffer SIU-SOM

E

S S E P v = Vmax[S]

K_m+[S]

k₁

k_-1

k2

-K_m, V_max

0 1 2 3 4 5

0 10 20 30 40 50

v, µ mo l/ m in [S], mM 0.5Vmax

Com pa n y Logo

52

Enzyme Kinetics

v

_o

=

Vmax[S] K_m₊_[S]

Km

V_max

&

E1 E2 E3 1st order zero order Competitive Non-competitive Uncompetitive Direct plot Double reciprocal

Bi-substrate reaction also follows M-M equation, but one of the substrate should be saturated when estimate the other Affinity with substrate Maximum velocity _In h ib iti o n Activity

Observe vochange under various [S], resulted plots yield Vmaxand Km

k₃[E_t]

k_cat Turn over

number

k_cat/K_m

Activity Unit

1 μmole min

Specific Activity

unit mg

Significance

(14)

Com pa n y Logo

53

Significance of Enzyme Kinetics

v

_o

=

V

max

[S]

K

_m

+

[S]

Obtain

V

max

and

K

m

[S] = Low

High

[S] = Fixed concentration

zero order

1st order

E3

E2

E1

Proportional to

enz

y

me concentra

tion

v0= Vmax×K = k3[Et]×K

K

_m

=

[S]

K

_m

+

[S] = 2

[S]

V

_max

2

=

V

_max

[S]

K

_m

+

[S]

K

_m

: Affinity with Substrate

I f

v

_o

=

V

max

2

S2

S1 _S3

S1S2 S3

V_max

1/2

When using different substrate

Affinity changes

K

_m

v

_o

=

V

max

[S]

K

_m

+

[S]

J

u

a

n

g

R

H

(

2

0

4

)

BC

b

a

s

ics

Com pa n y Logo

55

K

_m

: Hexokinase Example

Glucose + ATP →

Glc-6-P + ADP

1 2 3 4 5 6

Glucose

Allose

Mannose

Substrate

number

K

_m

= 8

8,000

5

μ

M

CHO H-C-OH

HO-C-H

H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO H-C-OH

H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO HO-C-H

HO-C-H

H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

Turn Over Number,

k

_cat

v

_o

=

V

max

[S]

K

_m

+

[S]

(

v

_o

)

E + S

ES

E + P

k

₂

k

₁

k

₃

When substrate excess,

k

₃ =

k

_cat, turn over number(t.o.n)

When [substrate] is low

=

k

3

[E]

[S]

K

_m

+

[S]

=

K

_m

k

₃

[E]

[S]

Omit the [substrate] Substrate specificity

Start from M-M eq.

Second order

(IV)

(15)

Com pa n y Logo

57

Turn Over Numbers of Enzymes

Catalase H₂O₂

Carbonic anhydrase HCO3

-Acetylcholinesterase Acetylcholine

40,000,000

400,000

140,000

β-Lactamase Benzylpenicillin 2,000

Fumarase Fumarate 800

RecA protein(ATPase) ATP 0.4

Enzymes Substrate k_cat(s-1₎

The number of product transformed from substrate by one enzyme molecule in one second

Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263 58 Com pa n y Logo

Chymotrypsin Has Distinct

k

_cat

/

K

_m

to Different Substrates

O R O

H₃C–C–N–C–C–O–CH₃ H H

= – =

–

–H

Glycine

k

_cat

/

K

_m

1.3 ╳10-1

–CH₂–CH₂–CH₃

Norvaline 3.6 ╳102

–CH₂–CH₂–CH₂–CH₃

Norleucine 3.0 ╳103

–CH₂–

Phenylalanine 1.0 ╳105

(M-1_s-1₎ R =

Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379

Com pa n y Logo

59

Enzyme Activity Unit

Reaction time (min)

Pro

d

u

ct

[P]

0 10 20 30 40

Slope tan

S

→

P

μ

mole

v

_o

=

[P]

/

min

Unit

=

Activity Units

Protein (mg)

t

μ

mole

/

min

y

x

y

x

= tan

J

u

a

n

g

R

H

(

2

0

4

)

BC

b

a

s

ics

Specific

Activity

=

60

LOGO