Laporan Praktikum Bioteknologi Pembuatan Media Kultur Jaringan

Laporan

Praktikum

Bioteknologi

Pembuatan

Media Kultur

Jaringan

BAB I PENDAULUAN 1.1 Latar Belakang

Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman

dengan metode kultur jaringan

secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada

kultur jaringan sangat besar

pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta

bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, macam-macam media kultur

jaringan telah ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak.

Nama-nama media tumbuh untuk eksplan ini biasanya sesuai dengan nama

penemunya. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir sama,

hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap-tiap persenyawaan. Pembuatan media pada prinsipnya dilakukan dengan melarutan semua komponen media dalam air sesuai

dengan konsentrasi pada permulasi yang diinginkan, penimbangan

komponen media satu persatu untuk setiap pembuatan media kultur tidak praktis dan hanya dapat dilakukan jika jumlah zatnya cukup besar,

masalah tersebut dapat diatasi dengan pembuatan larutan stok.

1.2 Tujuan

1. Untuk mengetahui jenis-jenis media kultur

2. Untuk mengetahui sifat dan komposisi pembuatan media 3. Untuk mengetahui teknik aseptic pembuatan media

4. Untuk mengetahui dan

memahami rumus perhitungan larutan stok.

1.3 Manfaat

Dari praktikum yang dilakukan diharapkan mahasiswa dapat mengetahui sifat media kultur

jaringan dan pemanfaatnya serta mampu membuat media kultur jaringan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Jenis-jenis Media

a) Media Knop

Dapat juga digunakan untuk

menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA.

b) Media White

Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan

bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur

tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang

dikembangkan kemudian.

Konsentrasi NO3- dan K+ yang

digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang.

c) Media Knudson dan media Vacin and Went

untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh

dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-,

sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek.

Penambahan NH4+ ternyata

dibutuhkan untuk perkembangan protocorm. Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk

mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun.

organ dibandingkan dengan jaringan tumor tanaman Venca rosea

(Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan ammonium ke dalam media White yang sudah

dimodifikasi, mempunyai

pertumbuhan yang lebih baik.

Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang diperoleh, hampir sama dengan yang dikembangkan oleh Miller.

d) Media Murashige & Skoog

(media MS)

Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS

mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk

NH4+. Kandungan N ini, lima kali

lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsentrasinya

dinaikkan sedikit. Pertama kali

unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan

jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan

media-media lain berdasarkan media-media MS tersebut, antara lain media :

1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi

unsur makro MS,

dan memodifikasi : 9 mM

ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk

penelitian embryogenesis kultur

jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.

2. Modifikasi media MS yang lain

dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan 1988) untuk kultur

suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan

NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya.

3. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan

konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra.

Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan

persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari

persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit

adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo,

S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari

dibiarkan, maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya

belum diketahui. Untuk mengatasi

pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap.

5. Media Gamborg B5 (media B5)

Pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan

konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media

MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik

sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian

tanaman.. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini

menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM

menghambat pertumbuhan sel

kedelai. Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM,

sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968).

6. Media Schenk & Hildebrant (media SH)

Merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil. Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari

pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan

mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi

karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk

tanaman legume.

7. Media WPM (Woody Plant

Medium)

Yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman

berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan

lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak

digunakan untuk perbanyakan

tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon.

8. Media N6

Media N6 mempunyai ciri

jauh perbandinganya.

Amonium yang diberikan dalam bentuk (NH₄)SO₄ hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO₃ 2830 mg/l.

(Suryowinoto, M. 1991)

2.2 Komposisi dan Fungsi Dasar dalam Media MS

a. Air

Air merupakan komponen yang penting di dalam pengkulturan eksplan karena 95% dari medium

mengandung air. Air yang digunakan yaitu air destilasi, dimana air

tersebut telah steril dari kontaminasi mikroorganisme atau substansi yang dapat merusak proses perkembangan eksplan.

b. Larutan garam anorganik Tiap tanaman memerlukan

setidaknya 6 elemen mikronutrien N, P, K, Mg, Ca, S, dan elemen yaitu Fe, Mn, B, Mo, Cl. Pereduksi CU

2-menjadi Cu- bermanfaat pada perkembangan dan perbaikan

vitamin adalah bahan yang perlu

ditambahkan sebab tumbuhan yang dikulturkan belum mampu membuat vitamin sendiri, biasanya yang

ditambahakan yaitu vitamin B, asam nukleat, pridosin (vitamin B6).

c. Zat-zat organic

Senyawa organic yang dipakai yaitu karbohidrat yang tersusun atas

unsur-unsur C, H, O sebagai elemen penyusun utama karbohidrat

mempunyai fungsi utama yaitu sebagai sumber energy untuk

keseimbangan tekanan osmotic.

2.3 Teknik Aseptik dalam

Pembuatan Media

a. Sterilisasi peralatan

 Sterilisasi peralatan (glassware

dan logum) dan aquades dilakukan dengan sterilisasi kering (oven 1300 c-1700_{c selama 2-4 jam).}

 Sterilisasi peralatan dengan

autoclave dilakukan pada suhu 1210c takanan 15 PSI selama 1 jam.

 Sterilisasi peralatan logam (pinset,

gunting, jarum) yang digunakan dengan merendam perakitan tsb dalam alcohol 95% diikuti dengan pembakaran dan pendinginan.

b. sterilisasi medium kultur

 Metode autoclave

Medium dalam botol kultur ditutup dengan alumunium foil pada suhu

1210 _{C, tekanan PSI selama 15-40}

menit dari waktu medium mencapai suhu yang diperlukan.

 Metode Filtrasi

Yaitu sterilisasi menggunakan

membrane filter berukuran 0,45-0,22 mm di dalam kontiener steril.

(Sriyanti, 1994)

2.4 Rumus Perhitungan Larutan Stok

Volume stok untuk setiap pembuatan media q liter.

V1 X M1 = V2 x M2

Ket: V1 = Volume stok yang dicari. V2 = Volume larutan stok

M1 = Konsentrasi larutan stok

M2 = Konsentrasi yang diinginkan. (Hemawan dan Na”em, 2006)

BAB III

3.1 Alat, Bahan dan Fungsi

 Alat :

1. 14 botol kultur : berfungsi sebagai tempat media kultur

2. 2 pak karet gelang : berfungsi untuk penutup atau tali penutup plastik dan alumunium

3. Plastik tahan tanas (untuk 8 botol, dengan ukuran pxl; 12 x 13 cm) : sebagai penutup botol kultur (perlakuan a)

4. Gelas ukur : untuk mengukur cairan yang di butuhkan

5. Mikro pipet : untuk mengambil larutan stok dengan ukuran

terkecil mikro meter

6. Beaker glass : untuk tempat pembuatan larutan stok

7. pH universal (indikator pH) : untuk mengukur pH larutan

8. sitter : megaduk larutan

9. microwave : untuk memasak larutan hingga larutan mengental 10. alumanium foil (unutk 6

botol, dengan ukuran pxl; 24 x 15, kertas di lipat/rangkap) : sebagai penutup botol kultur (perlakuan b)

11. autoclave : sterilisasi botol kultur sebelum di masukkan ke ruangan pengamatan

12. Timbangan analitik : untuk menimbang berat bahan yang diperlukan

1. Oven : sterilisasi kering botol kultur

 bahan : 1. Aquades : 50 ml (bahan tambahan pada larutan stok) 1. Makro : 30 ml Mikro A : 3 ml Mikro B : 0,3 ml sebagai bahan FeEDTA : 3 ml pembuatan larutan stok

Vitamin : 0,3 ml CaCl2 : 3 ml

1. Sukrosa : untuk 300 ml. Larutan media digunakan 9 gram gula. (untuk membuat larutan menjadi

tercampur rata)

1. Agar-agar : unutk 300 ml. Larutan media

digunakan 2,1 gram agar-agar (untuk mengentalkan larutan) 3.2 Cara Kerja Pembuatan Media Kultur (Diagram Alir)

Bilas gelas dengan menggunakan aquades Isi gelas dengan aquades kurang lebih 50 ml

Masukkan sukrosa (gula) 9 gram dan agar-agar 2,1 gram

Agar-agar : 2,1 gram Stirer (aduk) beberapa menit sampai larutan berwarna bening

Tutup dengan plastik wrap dan di lubangi Mikrowave selama 7 menit

Masukkan ke dalam botol kultur @20 ml : 8 botol dengan tutup plastik

6 botol dengan tutup alumunium Autoclave

Tambahkan aquades hingga volume mencapai 300 ml Stirer (aduk) dan ukur pH (pH indikator)

Tambahkan unsur-unsur yang sudah di stok

Makro : 30 ml, Mikro A : 3 ml, Mikro B : 0,3 ml, Fe EDTA : 3 ml, Vitamin : 0,3 ml, CaCl2 : 3 ml

3.3 Analisis perlakuan

Sebelum pembuatan media hal yang pertama kali dilakukan adalah

mensterilkan semua peralatan yang akan digunakan dengan alcohol 95% serta diiuti dengan pembakaran

kemudian didinginkan, hal ini bertujuan agar alat tidak

terkontaminasi dengan jamur atau bakteri.

Isi breaker glas dengan larutan

aquades kurang lebih 50 ml. Setelah itu, tambahkan unsur-unsur larutan yang sudah di stok, yaitu : makro (30 ml), mikro A (3 ml), mikro B (0,3

ml), Fe EDTA (3 ml), Vitamin (0,3 ml) dan CaCl2 (3 ml). Setelah semua larutan selesai ditambahkan,

tambahkan lagi aquades hingga volume mencapai 300 ml. Stirer

(aduk) larutan dan ukut pH larutan menggunakan indikator pH hingga mencapai pH sekitar 5 – 6.

Masukkan sukrosa (9 gram) dan

agar-agar (2,1 gram) yang bertujuan untuk melarutkan larutan dan

mengentalkan larutan. Stirer kembali sampai larutan berwarna putih

bening. Setelah selesai, tutup breaker glas dengan plastik wrap dan

masukkan ke dalam microwave selama 7 menit setelah selesai,

masukkan larutan ke dalam botol kultur dengan 8 botol di tutup

plastik, dan 6 botol ditutup

alumunium. Masukkan ke autoclave untuk sterilisasi akhir, dan amati

selama 2 minggu, apakah terjadi kontaminasi atau tidak, catat hasil.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil

1. a. Tabel media kultur

dengan penutup plastic

NO Hari Pengamatan ke- Botol ke- Jenis Kontaminan Keterangan

2012 3 4 5 6 7 8 yang terkontaminasi 2. Kamis, 18 oct 2012 1 2 3 4 5 6 7 8 - Tidak ada yang terkontaminasi 3. Selasa, 23 oct 2012 1 2 3 4 5 6 7 8 - Tidak ada yang terkontaminasi 4. Rabu, 31 Oct 2012 1 2 3 4 5 6 7 8 - Tidak ada yang terkontaminasi 5. Jum’at, 02 Nop 2012 1 2 3 4 5 6 7 8 - Tidak ada yang terkontaminasi

1. b. Tabel media kultur

dengan penutup alumunium poli NO Hari Pengamatan Botol ke- Jenis Kontaminan Keterangan

ke- 1. Kamis, 11 oct 2012 1 2 3 4 5 6 - Tidak ada yang terkontaminasi 2. Kamis, 18 oct 2012 1 2 3 4 5 6 - Tidak ada yang terkontaminasi 3. Selasa, 23 oct 2012 1 2 3 4 5 6 - Tidak ada yang terkontaminasi 4. Rabu, 31 Oct 2012 1 2 3 4 5 6 - Tidak ada yang terkontaminasi 5. Jum’at, 02 Nop 2012 1 2 3 4 5 6 - Tidak ada yang terkontaminasi 4.2 Pembahasan

Pada praktikum kali ini kita kita mencoba membuat media kultur jaringan dengan bahan-bahan yang sudah dijelaskan di atas, setelah di autoklaf kita mengamati

kamis tanggal 11 oktber, disana

terlihat bahwa media yang ditutup dengan plastic dan alumunium poli keadaan semuanya masih baik,

dengan tanda-tanda tidak ada

perubahan warna (tetap putih) dan juga masih kelihatan stabil dengan kata lain tidak terlihat danya jamur pathogen yang masuk.

Kemudian pada hari kamis tanggal 18 oktober kita mengamati lagi dan

ternyata tidak jauh berbeda dengan yang pengamatan pertama jadi

semua media baik 8 sample yang ditutpi plastic dan 6 sample yang

ditutupi alumunium tidak ada tanda-tanda terkontaminasi, tetapi disini ada satu media yang tertutupi

alumunium yang kelihatan warnanya agak kekuningan tetapi menurut saya

masih dalam keadaan tidak

terkontaminasi karena ketika begitu sample didekatkan warnanya masih putih sebenarnya cuma memang dari jauh kelihatan agar sedikit

kekuningan, seandainya itu termasuk dalam tanda kontaminasi tidak

mungkin sebab saya melihat sample praktikan lain ada yang kuning tetapi disitu ada jamur yang

menggelembung (membentuk

bundaran) yang berwarna hitam ke abu-abuan, sedangkan pada sample kami tidak sedemikian itu.

Begitupun pada pengamatan ke-3 pada hari selasa tanggal 23 oktober 2012 kami menyimpulkan tidak ada yang terkontaminasi, begitu juga

pada saat pengamatan ke-4 hari rabu, tanggal 31 oct 2012. Hingga pada

pengamatan yang terakhir pada hari jum’at tanggal 02 nop 2012, ke 8

sample media kultur jaringan yang ditutupi plastic tidak terlihat adanya kontainasi begitupun ke 6 sample

yang ditutupi alumunium.

Seperti apa yang dikemukakan

oleh Andria bin Muhayat bahwa “eksplan yang terkontaminasi akan

menunjukkan gejala seperti berwarna putih sampai biru (disebabkanjamur) atau busuk (disebabkan bakteri)

BAB V PENUTUP 5.1 Kesimpulan

Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur

jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman

dengan metode kultur jaringan

secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Dan

Media MS inilah yang paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan

kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS.

Pada praktikum kali ini kita mencoba membuat media tanam kultur

jaringan dengan jenis media MS tersebut, dan akhirnya dapat ditarik

kesimpulan ketika kita sudah melakukan beberapa kali

pengamatan, media kultur jaringan yang ditutup dengan plastic biasa tepatnya ada 8 sampel dan 6 sampel

yang ditutupi alumunium foil semuanya tidak terkontaminasi,

masih putih normal

DAFTAR PUSTAKA

 Herawan, T dan M. Na’iem.

2006. Pengaruh Jenis Media dan

Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Terhadap Perakaran pada Kultur

Jaringan Cendana (Santalum album Linn.). Jurnal Agrosains 19(2) :

103-109.

 Sasnawaria, 2005. Mikrobiologi

dasar. Papa sinar sinantris. Jakarta.

 Sriyanti, Daisy P. 1994. Teknik

Kultur Jaringan. Kanisius.

Yogyakarta.

 Suryowinoto, M. 1991. Budidaya

Biologi. Universitas Gadjah Mada. Yogyakart