III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni sampai September 2009. Penelitian meliputi penanganan dan preservasi sampel dilakukan di Laboratorium Budidaya Jurusan Perikanan dan Kelautan Fakultas Sains dan Teknik Universitas Jenderal Soedirman (UNSOED) Purwokerto Jawa Tengah. Histologi dilakukan di Laboratorium Struktur Pengembangan Hewan Fakultas Biologi UNSOED. Sedangkan penentuan kadar steroid dilakukan di Laboratorium Hormon Unit Reproduksi dan Kebidanan FKH IPB Bogor.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan singgaringan betina dengan kisaran bobot 32,50 – 69,50 g dan jantan dengan kisaran 27,17 – 49,67 g, berasal dari sungai Clawing Kab. Purbalingga yang merupakan hasil tangkapan dari alam, minyak cengkeh untuk anestesi ikan sehingga memudahkan dalam pengambilan darah/mengurangi stres, ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) sebagai antikoagulan, larutan bouin-hollande untuk preparasi histologi, larutan hematosiklin eosin menjadi preparat, pakan berupa cacing darah beku, H2SO4 pekat, akuades, MnSO4, Na2S2O3, indikator phenolphtalein, koh KI untuk titrasi O2/CO2 dan kit EIA Estradiol (E2).
Sedangkan peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 9 bak kayu dengan ukuran (150x80x60 cm) yang dilapisi terpal biru, heater (T ± 1oC), lampu PE 20 Watt (intensitas cahaya 12 lux) (Lampiran 27), lux meter untuk mengukur intensitas cahaya lampu, serok, aerasi, pompa air, timer sebagai pengatur pencahayaan, plastik penutup bak perlakuan kedap cahaya, disetting set, cawan petri, timbangan analitik (ketelitian ± 0,001 g), baki, gelas ukur, serta mikrotom. Mikroscop kamera untuk mengamati preparat, pengukuran bobot menggunakan timbangan elektrik dan timbangan Ohaus (ketelit ian 0,1 g, milimeter blok untuk pengukuran panjang tubuh, tabung eppendorf tempat plasma darah, freezer (-20oC) sebagai tempat penyimpanan sampel segar, sentrifuge, dan enzym linked immunoasorbent assays (ELISA).
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimen dengan menggunakan rancangan acak lengkap faktorial (2 kombinasi perlakuan yaitu foto dan thermal = fotothermal), yang terdiri atas 9 perlakuan, sebagai ulangan 3 individu ikan diambil setiap sampling. Untuk jelasnya dapat dilihat pada Tabel 1 dibawah ini.
Tabel 1. Perlakuan fotothermal yang dicobakan
Kode Perlakuan Keterangan
T0 L0 Temperatur dan durasi pencahayaan alami
T0 L1 Temperatur alami dan durasi pencahayaan 10T :14G T0 L2 Temperatur alami dan durasi pencahayaan 14T :10G T1 L0 Temperatur 25oC dan durasi pencahayaan alami T1 L1 Temperatur 25
o
C dan durasi pencahayaan 10T:14G T1 L2 Temperatur 25
o
C dan durasi pencahayaan 14T:10G T2 L0 Temperatur 30oC dan durasi pencahayaan alami T2 L1 Temperatur 30oC dan durasi pencahayaan 10T:14G T2 L2 Temperatur 30oC dan durasi pencahayaan 14T:10G
3.3.1. Ikan Uji
Ikan uji diperoleh dengan bantuan nelayan setempat menggunakan perahu (kondisi hidup), dikumpulkan dalam keramba kecil, jika jumlah sampel telah mencukupi kemudian dibawa ke laboratorium, untuk selanjutnya diaklimatisasi dan diadaptasikan kedalam bak penampung sebelum dimasukkan kedalam bak penelitian.
3.3.2. Wadah Penelitian
Wadah penelitian yang digunakan adalah bak kayu yang telah dilapisi terpal plastik, masing-masing ditutupi dengan plastik polybag, satu perlakuan memerlukan satu wadah, dan temperatur air distabilkan dengan menggunakan heater kecuali untuk T0, wadah dipasang sebuah lampu (sumber cahaya) kecuali L0, lampu digantungkan dengan ketinggian 1,5 m dari permukaan air. Bak percobaan diisi air hingga kedalaman 40 cm (kapasitas 500 L), dengan sistem resirkulasi tertutup agar tidak perlu dilakukan pergantian air.
3.3.3. Padat Tebar
Padat tebar ikan 12 ekor/wadah (rasio betina : jantan = 1:1), dengan asumsi tidak turut memberi pengaruh positif terhadap perkembangan gonad ikan,
ikan diberi pakan blood worm dengan jumlah yang sama, frekuensi pemberian 3 kali sehari (pagi, siang dan sore) secara adlibitum.
3.3.4. Pengaturan Temperatur
Sebelum ikan dimasukkan kedalam wadah perlakuan, terlebih dahulu dilakukan aklimatisasi. Temperatur air media dipertahankan sesuai perlakuan yang diinginkkan dengan heather dan semua perlakuan fotoperiode yang berbeda diatur dengan timer (mulai jam 08.00 pagi). Selanjutnya sebagai pendukung dilakukan pengukuran fisika dan kimia air seperti temperatur, oksigen terlarut dan karbondioksida bebas (Lampiran 1).
3.4. Parameter yang dievaluasi 1) Ukuran Morfologis
Sebelumnya ikan sebagai sampel diambil secara acak masing-masing 3 ekor, kemudian dipingsankan, dan diukur bobot tubuh (g) dan panjang total (cm).
2) Koleksi Plasma Darah
Darah diambil dari bagian bawah sirip punggung/diatas sirip dada menggunakan spuit injeksi 1 mL yang sudah diisi antikoagulan. Darah yang diperoleh ditampung di dalam tabung reaksi, dimasukkan kedalam icebox, disentrifugasi dengan kecepatan rendah (3000 rpm selama 15 menit), kemudian plasmanya ditampung dalam tabung ependorf dan diberi label sesuai dengan nomor sampel dan jenis perlakuan, disimpan dalam freezer (-20oC) hingga waktunya dianalisis. Langkah selanjutnya ikan sampel dibedah untuk melihat indeks morfoanatomi seperti ;
3) Indeks Gonadosomatik (IGS)
Gonad yang didapat ditimbang, dan selanjutnya dikalkulasikan untuk mendapatkan persentase. IGS individu ikan dihitung dengan persamaan (Effendie, 1997) ;
Bobot Gonad (g) IGS (%) = x 100
Indeks ini mencerminkan perkembangan gamet (ovarium/testis), di mana jika nilainya semakin tinggi maka perkembangan gonadnya juga semakin maju (De Vlaming et al. 1982 dalam Sulistyo et al. 2008).
4) Indeks Hepatosomatik (IHS)
Hati yang didapat ditimbang, kemudian dikalkulasikan untuk mendapatkan persentase). IHS individu ikan dihitung dengan persmaan (Sulistyo et al. 2000) ;
Bobot Hati (g) IHS (%) = x 100
Bobot Tubuh (g)
Evaluasi ini dilakukan karena diduga ada keterkaitan organ hati (khususnya pada ikan betina) sebagai sumber materi pada proses vitellogenesis. Sheikh-Eldin et al. (1995) menjelaskan bahwa organ hati merupakan organ penimbun cadangan energi dan akan dibongkar untuk mendukung perkembangan oosit. Cadangan energi dalam hati ini selanjutnya baru akan dipergunakan untuk mendukung kegiatan pemijahan jika deposit energi pada organ lain tidak mencukupi. Selain itu, tingginya nilai IHS ini juga dikarenakan adanya akumulasi steroid Estradiol-17ß pada organ hati yang berfungsi untuk mensintesis vitellogenin selama masa vitellogenesis.
5) Indeks Viscerasomatik (IVS)
Organ visceral (selain hati dan gonad) yang didapat ditimbang, selanjutnya dikalkulasikan. IVS individu ikan dihitung dengan persamaan (Sulistyo et al. 1998) ;
Bobot Visceral (g) IVS (%) = x 100
Bobot Tubuh (g)
Menurut Sulistyo (1998) bahwa visceral adalah organ dalam ikan selain gonad dan hati. Evaluasi ini dilakukan karena diduga ada kaitan organ visceral (jaringan lemak) sebagai sumber utama energi untuk mendukung perkembangan gonad.
6) Histologi
Pembuatan preparat histologi dilakukan dengan metode parafin (Kiernan, 1990). Proses pemotongan dilakukan dengan menggunakan mikrotom, dimana untuk preparat jaringan testis dipotong dengan ketebalan 6 mikron (Lampiran 2). -Penghitungan proporsi setiap tahapan perkembangan oosit
Tahapan perkembangan oosit pada ovarium senggaringan ditentukan menurut Wijayanti et al. (2004). Secara garis besar oosit dik lasifikasikan ; tahap previtellogenesis, vitellogenesis awal, vitellogenesis pertengahan, vitellogenesis akhir dan maturasi. Jumlah oosit pada masing-masing tahap perkembangan dihitung dengan mengevaluasi histologi ovarium bagian anterior, median dan posterior, untuk setiap preparat diamati dalam 3 lapang pandang, setiap lapang pandang dihitung jumlah setiap tahapan sel pada oogenesis. Oosit pada masing-masing tahapan kemudian dipresentasekan terhadap jumlah total oosit yang diamati. Proporsi oosit pada masing-masing tahapan perkembangan (X) dihitung dengan rumus :
oosit pada tahap tertentu
X = x 100% oosit yang diamati
∑ ∑ 7) Analisa Kadar Hormon
Analisis kadar hormon dalam plasma darah dilakukan dengan metode ELISA sesuai protokol yang terdapat dalam kit estradiol produk GB (Lampiran 3).
8) Fekunditas
Gonad yang telah didapat, fekunditasnya dihitung dengan cara mengambil sebagian gonad yang telah disimpan dalam larutan gilson, kemudian ditimbang dan dicatat, selanjutnya dihitung jumlah telur didalamnya. F dihitung dengan pendekatan (Cerda et al. 1994) ;
Wg x S F =
Ws ∑
dimana ; F : fekunditas mutlak, Wg : berat gonad (g), ∑S : jumlah telur sebagian, Ws : berat gonad sebagian (g).
Merupakan satu mata rantai penghubung satu generasi dengan generasi berikutnya dan terkait persoalan stock rekrutmen serta produksi.
3.5. Analisis Data
Data kuantitatif berupa nilai IGS, IHS, IVS (betina dan jantan), dan kadar hormon E2 (? ) pada masing-masing perlakuan dianalisis dengan one ways Anova. Data disajikan sebagai rataan ± standard error (SE), dan termasuk proporsi oosit pada setiap tahapan dengan menggunakan program SPSS seri 17. Jika terdapat perbedaan yang signifikan (95%) antar perlakuan maka dilakukan uji lanjut Tukey’s multipel comparison test.
