FRAKSINASI SEL
Muhammad Zulfikar Mahmudin 1147020042
Kelompok 3, 4B Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Sunan Gunung Djati Bandung
E-mail : izulbiosains @gmail.com
ABSTRAK
Fraksinasi sel adalah teknik untuk memisahkan bagian-bagian sel. Secara umum, teknik ini melibatkan homogenisasi, yaitu pemecahan sel secara halus, dan sentrifugasi, yaitu pemisahan komponen-komponen sel oleh gaya sentrifugal dalam alat sentrifuge. Tujuan dari praktikum kali ini adalah memisahkan komponen sel untuk membedakan komponen-komponen sel tersebut. Prosedur kerja pertama menyiapkan alat dan bahan, kemudian membuat homogenate daun bayam dengan blender yang telah diberi larutan sukrosa 2%, mengambil 1,5 ml homogenate pada tabung mikrofuge, dan memutarnya dengan sentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit, memisahkan supernatan dan memindahkan ke tabung mikrofuge yang baru, mengencerkan endapan atau pellet dengan menambahkan 200µl PBS, menambahkan metylen blue dengan perbandingan 1:1, meneteskan pada kaca objek dan memeriksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 40x10, mengamati komponen sel yang di dapat, memutar kembali supernatant yang di dapat dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit, mendiamkan sejenak kemudian mengulangi dengan kecepatan yang sama selama 5 menit, memisahkan endapan dan membuang supernatan, mengencerkan kembali endapan atau pellet dengan menambahkan 100 µl PBS dan memberi janus green di bawah mikroskop dengan perbesaran 10x100, mengamati organel sel yang di dapat dan membuat catatan maupun gambarnya. Hasil yang didapat adalah densitas inti sel lebih besar dibandingkan dengan densitas mitokondria ditunjukkan dari bobot inti sel yang lebih besar dibandingkan dengan bobot mitokondria.
I. PENDAHULUAN
Perkembangan teknologi yang semakin pesat memungkinkan orang untuk bisa melihat struktur yang paling kecil dalam kehidupan kita yaitu sel. Pengamatan sel dengan mikroskop terus memperoleh kemajuan seiring dengan penemuan dan penyempurnaan mikroskop itu sendiri. Sebagai bagian dari makhluk hidup juga mengandung banyak komponen atau bagian-bagian dari sel yang kemudian dikenal dengan organel. Untuk bisa mempelajari organel sel dapat di lakukan dengan teknik fraksionasi sel, sehingga kita dapat memisahkan organel utama sehingga fungsinya dapat dipelajari (Ningsih, 2006).
Fraksinasi sel adalah teknik untuk memisahkan bagian-bagian sel. Secara umum, teknik ini melibatkan homogenisasi, yaitu pemecahan sel secara halus, dan sentrifugasi, yaitu pemisahan komponen-komponen sel oleh gaya sentrifugal dalam alat sentrifuge. Pemutaran homogenat di dalam sentrifuge akan memisahkan bagian-bagian sel kedalam dua fraksi, yaitu pelet, yang terdiri atas struktur-struktur lebih besar yang terkumpul di
bagian bawah tabung sentrifuge, dan supernatan, yang terdiri atas bagian-bagian sel yang lebih kecil yang tersuspensi dalam cairan di atas pelet tersebut . Supernatan dapat di sentrifugasi kembali dengan kecepatan yang lebih tinggi untuk mendapatkan pelet yang lebih ringan atau kecil daripada pelet pertama, dengan sentrifugasi diferensial, supernatan disentrifugasi dengan kecepatan yang makin tinggi sehingga didapatkan komponen yang makin kecil dalam pelet yang berurutan. Pelet tersebut dapat di resuspensi dan dimurnikan lebih lanjut dengan sentrifugasi densitas gradien (Horton , 2006).
Fraksionasi sel digunakan untuk mempelajari sifat biokimia dan fisiologi organel di luar sel. Prosedur dasar fraksionasi sel dimulai dengan homogenasi untuk menghancurkan membran plasma dan dinding sel untuk mengeluarkan sitoplasma dan kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi untuk memisahkan organel sel. Kemurnian tiap fraksi di komfirmasi menggunakan mikroskop (Metzler, 2001).
Teknik yang digunakan untuk pemisahan organel sel adalah semata-mata di dasarkan pada sentrifugasi, kepadatan dan kecepatan membuat perbedaan koefisien kepadatan dan sedimentasi. Hasil akhir dari proses sentrifugasi yaitu organel sel dapat keluar atau lepas dari membran plasma. Pelet yang di hasilkan dari skema atau proses sentrifugasi pertama dapat mengandung organel namun dengan presentase kecil. Fraksi lebih lanjut pada proses sentrifugasi akan menghasilkan inti, mitokondria, serta mikrosom masing-masing dengan densitas yang berbeda. Langkah-langkah sentrifugasi di lakukan dalam larutan buffer agar struktur protein tetap lestari (Nilsson, 2004).
Tujuan dari praktikum kali ini adalah memisahkan komponen sel untuk membedakan komponen-komponen sel tersebut.
II. METODE
II.1. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Terpadu I UIN Sunan Gunung Djati Bandung pada pukul 15.30-18.00 WIB.
II.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah homogenizer (blender), sentrifuge, mikro pipet dan tip (100µl, 1000µl), tabung mikrofuge, mikroskop cahaya, kaca objek dan gelas penutup. Bahan yang digunakan adalah daun bayam, sukrosa 2%, PBS (Phospat Buffer Saline), metylen blue, janus green.
II.3. Langkah Kerja
Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan, kemudian membuat homogenate daun bayam dengan cara menghancurkan daun bayam menggunakan blender yang sebelumnya telah diberi larutan sukrosa 2%. Selanjutnya mengambil 1,5 ml homogenate pada tabung mikrofuge, dan memutarnya dengan sentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit, memisahkan supernatant dan memindahkan ke tabung mikrofuge yang baru, lalu mengencerkan endapan atau pellet dengan menambahkan 200µl PBS, kemudian menambahkan metylen blue dengan perbandingan 1:1, meneteskan pada kaca objek dan memeriksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 40x10, lalu mengamati komponen sel yang di dapat, dan membuat catatan maupun gambarnya. Selanjutnya memutar kembali supernatant yang di dapat
sebelumnya dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit, setelah selesai lalu mendiamkan sejenak kemudian mengulangi lagi dengan kecepatan yang sama selama 5 menit, lalu memisahkan endapan dan membuang supernatant, kemudian mengencerkan kembali
endapan atau pellet dengan menambahkan 100 µl PBS dan memberi janus green di bawah mikroskp dengan perbesaran 10x100, dan yang terakhir adalah mengamati organel sel yang di dapat juga membuat catatan maupun gambarnya.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN IV.
No.
V. Foto Pengamatan VI. Literatur
VII. 1.
VIII. IX.
X. Perbesaran: 10x10 XI. Sumber: (Dokumentasi Pribadi,
2016).
XII.
XIII. Perbesaran: 10x10 XIV. Sumber: (Behike, 2010) XV. Keterangan:
1. Inti Sel 2. Mitokondria
XVI. Percobaan kali ini adalah mengenai fraksinasi subseluler. Prinsip dari percobaan ini adalah partikel yang tersuspensi akan mengendap ke dasar karena pengaruh gravitasi, juga didasarkan atas massa, ukuran, panjang partikel, dan densitas partikel
(Rickwood, 2000). Fraksionasi sel ini dapat digunakan untuk mempersiapkan komponen-komponen spesifik sel dalam jumlah besar untuk mengkaji komposisi dan fungsinya (Campbell 2000) Komponen spesifik yang ada pada percobaan ini ialah inti sel dan 2
1
mitokondria. Kedua organel ini merupakan perpustakaan genetik yang dimiliki oleh sel eukariot. Hal itu dikarenakan keduanya memiliki struktur DNA yang mengontrol sistem kerja pada sel tersebut. Pada proses fraksinasi digunakan dua bahan kimia yaitu sukrosa 2%m dan PBS (Phosphat Buffer Saline), menurut Artika (2010) menjelaskan bahwa sukrosa EDTA berfungsi untuk menjaga struktur bayam supaya tidak mati sel-selnya sehingga ketika diisolasi masih bisa berfungsi. Sedangkan fungsi PBS menurut Yuwono (2008) adalah PBS sering digunakan dalam percobaan biologi sel untuk mempertahankan osmolaritas sel. Garam mengandung ion, yang menyeimbangkan jumlah ion garam di dalam sel. Jika sel yang tenggelam ke dalam solusi yang memiliki terlalu banyak garam ion, air akan bocor keluar dari sel,menyebabkan sel menyusut. Sebaliknya, jika sel terbenam ke dalam solusi yang memiliki ion terlalu sedikit garam, air akan masuk ke dalam sel, menyebabkan sel pecah. Oleh karena itu, sangat penting saat melakukan percobaan biologi sel untuk menjaga sel-sel di osmolaritas tertentu. PBS adalah pada osmolaritas yang benaruntuk menjaga sel-sel dalam
negara isotonik. PBS sering digunakan sebagai larutan penyangga dalam berbagai eksperimen untuk mempertahankan pH protein. Protein memerlukan kisaran pH tertentu untuk menjaga netralitas pada asam amino tertentu, untuk mempertahankan struktur protein. Jika tidak, struktur protein akan terdenaturasi.
XVII. Fraksionasi sel dilakukan dengan menggunakan alat sentrifuse yang prosesnya dinamakan sentrifugasi. Sentrifugasi ini dilakukan berdasarkan perbedaan densitas molekul sel. Percobaan ini menggunakan sentrifugasi untuk pemisahannya. Prinsip kerja sentrifus adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat (pelet) akan berada di dasar sedangkan substansi yang lebih ringan (supernatan) akan terletak di atas. Teknik ini dapat digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi molekul biologi juga komponen subseluler (Underwood, 2002). Isolasi fraksi mitokondria dilakukan sentrifugasi sebanyak dua kali. Penyebabnya organel mitokondria yang kecil membutuhkan perbedaan kecepatan yang besar dalam sentrifugasi.
Hal ini dikarenakan semakin kecil ukuran suatu komponen sel maka akan semakin sulit untuk mendapatkan fraksinya dan semakin besar kecepatan yang digunakan untuk mengisolasi komponen tersebut (Hendra, 2001).
XVIII. Berdasarkan
perbedaan densitas tersebut, mitokondria yang memiliki densitas yang lebih rendah dibandingkan dengan inti sel. Hal itu terbukti dengan praktikum yang telah dilakukan dengan mensentrifugasi homogenat pada kecepatan 700 g dalam waktu 10 menit menghasilkan pellet yang di dalamnya terdapat inti sel sedangkan sentrifugasi supernatannya pada kecepatan 5000 g dalam waktu 15 menit menghasilkan pellet yang di dalmnya terdapat mitokondria. Berdasarkan prinsip ketergantungan laju pengendapan terhadap densitas, semakin berat densitas partikel maka semakin banyak diperlukan kecepatan dan waktu untuk mensentrifugasinya. Pada pengamatan dibawah mikroskop pellet yang telah di sentrifugasi diberi metylen blue yang diteteskan pada kaca objek, fungsi metylen blue ini adalah menurut Hendra (2001) menjelaskan bahwa metylen blue berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang diamati melalui mikroskop.
Metylen blue tidak beracun, sehingga aman digunakan. Secara fisik, metylen blue memberi warna pada sel, namun secara kimia tidak menggangu metabolisme dalam sel, sehingga pengamatan tetap akurat. Selain itu, metylen blue bisa menjadi indikator adanya kehidupan dalam sel. Jika warnanya berangsur-angsur memudar, maka sel yang diamati masih hidup dan menghasilkan enzim yang menguraikan metilen biru. Jika warnanya tetap biru, berarti sel yang diamati sudah mati. XIX. KESIMPULAN
XX. Metode yang
digunakan untuk fraksinasi subseluler adalah sentrifugasi. Prinsip sentrifugasi pada percobaan ini berdasarkan perbedaan massa, ukuran, panjang partikel, dan densitas partikel. Sentrifugasi digunakan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi molekul biologi juga komponen subseluler yaitu inti sel dan mitokondria berdasarkan perbedaan densitas yang dimiliknya. Inti sel dan mitokondria memiliki DNA yang sangat penting untuk metabolisme sel terutama sintesis protein. Densitas inti sel lebih besar dibandingkan dengan densitas mitokondria ditunjukkan dari bobot inti
sel yang lebih besar dibandingkan dengan bobot mitokondria. Semakin kecil ukuran suatu komponen sel maka akan semakin sulit untuk mendapatkan fraksinya dan semakin besar kecepatan yang digunakan untuk mengisolasi komponen tersebut.
XXI. DAFTAR PUSTAKA
XXII. Artika, Mega. 2010. Struktur dan Fungsi Subseluler. Bogor: Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.
XXIII. Campbell. 2000. Biologi Jilid Kesatu Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.
XXIV. Hendra A. 2001. Teknik Pemisahan dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press. XXV. Horton, H. R. et al. 2006.
Principles of Biochemistry, 4th ed. Upper Saddle River, NJ: Pearson/Prentice Hall.
XXVI. Metzler, D.E. 2001.
Biochemistry: The Chemical Reactions of Living Cells,2nd ed.San Diego: Academic Press. XXVII. Nilsson, T., et al. 2004. Mass
spectrometry in high throughput proteomics: ready forthe big time. Journal of Sitology. 7(9): p. 68-15.
XXVIII. Ningsih, Dian Riana., Warsinah, dan Suwandri. 2006. Fraksinasi Ekstrak Metanol Kulit BatangRhizophora mucronatadan Uji Daya
Hambatnya Terhadap
Escherichia coli. Jurnal Molekul. Vol. 1. No. 1. Hal: 15-30.
XXIX. Rickwood D. 2000.
Centrifugation : a practical approach. Washington DC : IRLPress.
XXX. Underwood AL. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta :Erlangga.
XXXI. Yuwono, Tribowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.
XXXII. Behike, Joachim dan Otto Ristau. 2010. Enhanced Resolution of Sedimentation CoefficientDistribution Profiles by Extrapolation to Infinite Time. Journal Biophysics. 2(39): 449-455.
XXXIV.
XXXV. Gambar 1. Proses Homogenizer
Pada Bayam
XXXVI.
XXXVII. Gambar 2. Proses Pengambilan Supernatan Bayam Menggunakan
Mikropipet
XXXVIII.
XXXIX. Gambar 3. Supernatan yang Telah
di Homogenizer
XL.
XLI. Gambar 4. Proses Centrifuge
XLII.
XLIII. Gambar 5. Hasil Centrifuge 5000 rpm
XLIV.
XLV. Gambar 6. Endapan di Ambil
XLVI.
XLVII. Gambar 7. Endapan Setelah
XLVIII.
XLIX. Gambar 8. Hasil Centifuge ulang
12.000 rpm
L.
LI. Gambar 9. Proses Pemasukan
Kedalam Freezer
LII.
LIII. Gambar 10. Hasil setelah di Freezer
