LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ORGANIK EKSTRAKSI DAN ANALISA PIGMEN DAUN BAYAM Tujuan Percobaan :
1. Mempelajari teknik pemisahan senyawa pigmen (karotenoid) dari sampel padatan 2. Mempelajari teknik analisa Thin Layer Chromatografi (TLC)
Pendahuluan
Pigmen tumbuhan ditemukan dlaam plastida dan vakuola. Pigmen tumbuhan memiliki macam-macam, misalnya klorofil (pigmen hijau) di dalam kloroplas dan karotenoid (pigmen kuning-merah) di dalam kromoplas yang tidak mempunya klorofil atau hanya mengandung sedikit kloorfil. Kelompok pigmen lain adalah flavonoid (antosiasin dan flavon atau flavonol) yang biasanya terdapat di dalam vakuola, khususnya pada bunga dan bua dengan berbagai warna (Mulyani, 2005).
Karotenoid merupakan salah satu kelompok pigmen yang utama selain klorofil dan memiliki warna kuning, jingga serta merah. Karotenoid diproduksi oleh berbagai jenis organisme, mulai dari non-fototropik prokariotik sampai tumbuhan tangkat tinggi. Struktur karotenoid yang teridentifikasi berjumlah 700 struktur (Stafsnes, 2010).
Karotenoid dibagi atas 4 golongan, yaitu karotenoid hidrokarbon dan xantofil. Karotenoid
hidrokarbon (C40H55OH) seperti karoten dan likopen. Xantofil dan derivate
karoten yang mengandung oksigen dan hidroksil antara lain kriptosantin, C40H55OH dan lutein
(C40H54(OH)2). Asam karotenoid yang mengandung yang mengandung gugus karboksil dan
ester xantofil asam lemak, misalnya zeasantin (Mayer, 1996).
Karotenoid merupakan senyawa lipida yang tidak tersabunkan, larut dengan baik dalam pelarut organik, tetapi tidak larut dalam air. Sifat fisika dank imia karotenoid adalah larut dalam minyak dan tidak larut dalam air. Larut dalam kloroform, benzene, karbon disulfide dan petroleum eter, tidak larut dalam etanol dan methanol dingin. Tahan terhadap panas apabila dalam keadaan vakum, peka terhadap oksidasi, autooksidasi dan cahaya, dan mempunyai ciri khas absorpsi cahaya (Mayer, 1996).
Kromatografi yaitu pemisahan campuran senyawa dalam sesuatu sampel berdasarkan perbedaan interaksi sampel dengan fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dapat berupa padatan atau cairan yang diletakkan pada permukaan fasa pendukung. Fasa gerak dapat berupa gas
atau cairan, maka dikembangkan beberapa teknik kromatografi (Leba, 2017).
Jenis interaksi yang ada dalam proses kromatografi bermacam-macam tergantung pada kombinasi fasa diam dan fasa geraknya. Gaya yang mungkin timbul dalam kromatografi yaitu gaya atau ikatan van der waals, ikatan hidrogen, gas elektrostatik seperti interaksi ion-dipol, dipol-dipol, interaksi hidrofilik-hidrofilik dan sebagainya. Gaya atau ikatan tersebut memberikan efek yang berbeda dan spesifik antara satu komponen dengan lainnya terhadap fasa gerak dan diam (Leba, 2017).
Kromatografi lapis tipis, KLT (thin layer chromatography, TLC) adalah suatu metode analisis yang digunakan untuk memisahkan suatu campuran senyawa secara cepat dan sederhana. Metode ini termasuk dalam kromatografi cair-padat. Prinsip KLT didasarkan atau adsorpsi senyawa-senyawa oleh fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan dapat terjadi akibat perbedaan kepolaran antara senyawa-senyawa dalam campuran dengan fasa diam dan fasa gerak. Perbedaan kepolaran inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan yang diamati melalui tampaknya bercak atau noda dibawa dan dielusi oleh fasa gerak melalui fasa diam yang berada dalam kolom (Leba, 2017). Kromatografi lapis tipis berprinsip suatu analit bergerak melintasi lapisan fase diam, di bawah pengaruh fase gerak, yang bergerak melalui fase diam oleh kerja kapiler. Semakin polar suatu senyawa fase gerak, semakin besar mengadsorpsi (partisi ke dalam) fase diam gel silica. Waktu semakin sedikit yang dibutuhkan fase gerak untuk menaiki pelat sehingga semakin pendek jarak tempuh senyawa tersebut menaiki pelat dalam waktu tertentu (Watson, 2000).
Wujud fasa diam yang terdapat di dalam kolom, kromatografi gas dibagi menjadi dua jenis yaitu kromatografi gas-padat dan kromatografi gas-cair. Kromatografi gas dengan fasa diam suatu padatan disebut kromatografi gas-padat dan kromatografi gas dengan fasa diam berupa cairan disebut kromatografi gas-cair (Rubiyanto, 2017).
Kromatografi gas-padat, partisi analit didasarkan atas fenomena absorpsi (penyerapan) pada permukaan fasa diam. Jenis kromatografi ini penggunannya sangat terbatas karena kurva elusi yang dihasilkan umumnya tidak simetris. Kromatografi gas-cair, fasa diam cair dilapiskan dengan ketebalan tertentu pada suatu media padat yang disebut zat padat pendukung. Partisi analit didasarkan pada kelarutan uap analit pada fasa diam. Distribusinya bergantung pada akesetimbangan gas-cair yang terjadi di dalam kolom. Metode kromatografi ini merupakan salah satu cara kromatografi kolom yang penggunaannya sangat luas (Rubiyanto, 2017).
menetes di bawah. Fase diam ditempatkan dalam kolom yang dilewati fase gerak yang dipengaruhi oleh adanya tekanan gravitasi (Harvey, 2000).
Prinsip Kerja
Suatu analit bergerak melintasi lapisan fase diam, di bawah pengaruh fase gerak, yang bergerak melalui fase diam oleh kerja kapiler. Semakin polar suatu senyawa fase gerak, semakin besar mengadsorpsi (partisi ke dalam) fase diam gel silica, semakin sedikit waktu yang dibutuhkan fase gerak untuk menaiki pelat sehingga semakin pendek jarak tempuh senyawa tersebut menaiki pelat dalam waktu tertentu.
Alat
Mortar, pestle, tabung, chamber TLC, gelas ukur, pipet tetes, pinset, penggaris, lampu UV, neraca analitik, batang pengaduk
Bahan
Lempeng silika, pelarut aseton:heksana, kertas saring, daun bayam. Prosedur Kerja
Pengamatan sport menggunakan sinar UV 15 menit
Data
Massa awal daun bayam = 5 gram Spot 1 = 1,9 cm
Spot 2 = 2,8 cm Spot 3 = 4,5 cm Spot 4 = 4,8 cm Perhitungan
Rf =
Spot 1 = = 0,32
Spot 2 = = 0,48
Spot 3 = = 0,76
Spot 4 = = 0,81
Hasil
No Perlakuan Gambar
2. Dekantasi
3. Larutan aseton : heksana (2:3)
4. Pelat dimasukkan dalam chamber TLC
5. Hasil kromatografi kolom
Praktikum ini berjudul ekstraksi dan analisa daun bayam. Tujuan dari praktikum ini yaitu mengetahui teknik pemisahan senyawa pigmen (karotenoid) dari daun bayam dan mempelajari teknik analisa Thin Layer Chromatografi (TLC). Perlakuan praktikum ini yaitu dengan menggunakan larutan daun bayam dengan pelarut aseton, yang ditotolkan pada kolom, kemudian dilarutkan dalam chamber TLC yang berisi larutan aseton dan heksana.
Percobaan pertama yaitu dengan menggerus daun bayam dan menambahkan dengan aseton. Penambahan aseton berfungsi sebagai fasa diam. Fasa diam didekantasi dan diperas menggunakan kertas saring untuk memperoleh ekstrak aseton secara maksimal. Pembuatan eluen dilakukan dengan mencampurkan aseton dan heksana. Eluen ini berfungsi sebagai fasa gerak dan digunakan untuk memisahkan campuran. Larutan yang digunakan heksana karena merupakan larutan non-polar.
Gambar 1. Struktur molekul n-heksana
Aseton dipilih karena merupakan pelarut organik yang bersifat non-polar. Aseton memiliki gugus karboksil dimana gugus karboksil bersifat non-polar dengan elektron-elektron dalam ikatan sigma dan terutama elektron-elektron dalam ikatan pi yang tertarik ke oksigen yang lebih elektronegatif.
Gambar 2. Struktur molekul aseton
Karotenoid merupakan pigmen yang bersifat non-polar, sehingga menurut prinsip like dissolve like karotenoid dapat larut dalam eluen aseton-heksana yang juga bersifat non-polar.
CH3
ditambahkan dengan fasa diam, jika menggunakan pulpen maka warna pada pulpen akan ikut naik, karena pulpen mengandung pigmen. Fasa diam ditotolkan pada pelat di bagian garis bawah. Penotolan dilakukan berulang kali, supaya lebih tebal sehingga hasil sport lebih akurat dan lebih jelas. Penotolan dilakukan pada 1 titik. Eluen kemudian dimasukkan ke dalam chamber TLC setinggi 0,5 cm. Eluen yang dimasukkan tidak lebih tinggi dari garis bawah pelat agar warna fasa gerak tidak larut ke bawah. Pelat kemudian dimasukkan ke dalam eluen dan ditunggu eluen bergerak ke atas sampai mencapai garis atas pada pelat. Pelat kemudian diuji dengan sinar UV untuk mengetahui warna yang dihasilkan dengan jelas. Sinar UV memiliki panjang gelombang 450 nm. Karotenoid menyerap pada daerah biru pada panjang gelombang 430 – 470 nm. Ikatan rangkap terkonjugasi pada molekul karotenoid menandakan adanya gugus kromofor yang menyebabkan terbentuknya warna pada karotenoid, semakin banyak ikatan rangkap terkonjugasi maka semakin pekat warna karotenoid tersebut, yaitu semakin mengarah ke warna merah atau oranye.
Hasil yang didapatkan yaitu terdapat 4 sport dengan tinggi 1,9 cm dengan warna hijau biru; 2,8 cm dengan warna hijau kuning; 4,5 cm dengan warna coklat ke abu-abuan; dan 4,8 cm dengan warna kuning. Perbedaan ini dikarenakan terdapat tingkat kereaktifan dan polaritas yang berbeda-beda pada tiap fasanya. Warna hijau biru menunjukkan bahwa pigmen tersebut merupakan klorofil a, sedangkan warna hijau kuning menunjukkan bahwa pigmen tersebut merupakan klorofil b. Warna coklat menunjukkan bahwa pigmen tersebut merupak feofitin dan warna kuning menunjukkan bahwa pigmen tersebut merupakan karoten. Nilai Rf yang dihasilkan pada percobaan ini yaitu 0,38; 0,42; 0,76 dan 0,81.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kisaran nilai Rf pada klorofil a (hijau biru) yaitu 0,57 – 0,64. Rf pada klorofil b (hijau kuning) yaitu 0,48 – 0,56. Rf feofitin a (abu-abu) yaitu 0,74 – 0,82. Rf karoten (orange) 0,87 – 0,93 (Heriyanto, 2006). Hal ini menunjukkan bahwa bayam memiliki komposisi klorofil a dan b, feofitin dan karoten. Feofitin dan karoten merupakan pigmen yang bersifat non-polar.
Kesimpulan
Kesimpulan pada percobaan ini yaitu teknik pemisahan pigmen karotenoid dilakukan dengan ekstraksi kromatografi lapis tipis. Teknik menganalisa thin layer chomatography yaitu dengan menggunakan warna dan nilai Rf yang dihasilkan. Nilai Rf yang dihasilkan yaitu 0,32; 0,48; 0,76; dan 0,81. Komposisi yang dikandung dalam bayam yaitu klorofil a dan b, feofitin dan karoten.
Mulyani. 2005. Anatomi Tumbuhan. Yogyakarta: Kanisius
Stafsnes. 2010. Isolation and Characterization of Marine Pigmented Bacteria from Norwegian Coastal Waters and Screening for Carotenoids with UVA- Blue Light Absorbing Properties. J.microbiol, Vol 48 No 1
Mayer. 1996. Chemistry. New York: Reinhold Publishing Corporation Leba. 2017. Ekstraksi dan Real Kromatografi. Yogyakarta: CV Budi Utama Watson. 2000. Analisis Farmasi. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC Rubiyanto. 2017. Teknik Dasar Kromatografi. Yogyakarta: CV Budi Utama Harvey. 2000. Modern Analytical Chemistry. USA: The McGraw Hill Companies Gandjar. 2007. Kimia Farmasi. Yogyakarta: Pustaka Belajar
Heriyanto. 2006. Komposisi Dan Kandungan Pigmen Utama Tumbuhan Taliputri Cuscuta Australis R.Br. dan Cassytha Filiformis L. Sains. Vol 10 No 2
Saran
Saran yang disampaikan untuk percobaan ekstraksi dan analisa pigmen daun bayam yaitu, saat penotolan digunakan pipet mikro, sehingga larutan tidak menyebar. Peletakan pelat pada Chamber TLC menggunakan pinset. Aseton-heksana dicampur pada saat praktikum.
Nama Praktikan
