3 METODOLOGI
3.1Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan April sampai dengan Mei 2010, bertempat di Pengolahan Hasil Perikanan Tradisional (PHPT) Muara Angke Jakarta Utara. Pengujian Mutu bahan baku dan produknya dilakukan di Laboratorium Balai Pengujian Mutu dan Pengolahan Hasil Perikanan dan Kelautan (BPMPHPK) Dinas Kelautan dan Pertanian Propinsi DKI Jakarta.
3.2Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan tongkol (Euthynnus affinis), sebagai bahan baku dan pindang tongkol sebagai produk jadi. Bahan- bahan kimia yang digunakan analisis histamine adalah Resin penukar ion-50-100 mesh, asam fosfat-3,57 N, orto-ptalatdikarboksialdehid (OPT) 1%. Selanjutnya bahan kimia yang digunakan untuk analisis TVB antara lain: larutan asam borat 2 %, indikator : campuran 1 bagian volume bromecresol 0,1 % dalam alkohol, larutan asam klorida (HCl) 0,02 N, larutan Trichloracetic acid (TCA) 7 %, larutan kalium karbonat (K2CO3) jenuh (1:1), larutan formalin 40 %, dan
vaselin.
Bahan-bahan untuk uji mikrobiologi antara lain Brilliant Green Lactose Bile
(BGLB), 2 % Broth, Lauryl Triptose Broth (LTB), EC Broth, Levine’s Eosin Methilen Blue (L-EMB) agar, Tryptone (tryptophane) broth (TB), MR-VP Broth,
Simmon Citrate Agar, Plate Count Agar, larutan butterfield’s phospahat buffered, pereaksi kovacs, pereaksi VP, indikator MR, pereaksi pewarnaan gram. Bismuth Sulfite Agar (BSA), Brain Heart Infusion Broth, Hectoen Enteric (HE), Lactose Broth, Lysine Decarboxylase Broth, Lysine Iron Agar (LIA), Malonate Broth, Motility Test Medium, MR-VP Broth, Phenol Red Carbohydrate Broth, Potasium Cyanide (KCN) Broth, Purple Carbohydrate Broth, Rappaport-Vassiliadis (RV)
Medium, Selenite Cystine Broth (SCB), Simmon Citrate Agar,Tetrathionate Broth
(TTB).
Alat-alat yang digunakan untuk analisis kimia, kolom kromatografi ukuran 200x7 (diameter dalam) mm, Spektrofluorometer, Rapipiet-1 dan 5 ml, timbangan analitik, blender, blender jar stainless steel kapasitas 100 ml, erlenmeyer 25 ml,
stop watch, corong, kertas saring diameter 15 cm, gelas ukur 100 ml, pipet, cawan conway beserta tutupnya, inkubator, buret 2 ml berskala 0,05 ml.
Waterbath, stomacher, botol pengencer, tabung durham, cawan Petri ukuran 15 mm x 90 mm, tabung reaksi ukuran 16 mm x 150 mm dan 13 mm x 100 mm, mikroskop.
3.3Prosedur Penelitian
Rancangan penelitian untuk mengkaji dan mempelajari penerapan sanitasi pengolahan pindang ikan tongkol (Euthynnus Affinis) serta mutu keamanannya, dilakukan dengan wawancara (interview), pengamatan (observasi), dan analisis mutu pindang ikan tongkol. Pengamatan adalah mengumpulkan data dengan melihat langsung ke lapangan. Wawancara adalah pengumpulan data dengan langsung mengadakan tanya jawab kepada objek yang diteliti atau kepada perantara yang mengetahui persoalan dari objek yang sedang diteliti. Analisis adalah pengujian sampel yang dilakukan di laboratorium mutu.
Penilaian sanitasi pada pengolahan tradisional pindang ikan tongkol dilakukan dengan mengamati penerapan sanitasi pada proses pengolahan pindang ikan tongkol. Pada umumnya pengolahan tradisional tidak memiliki prosedur standar operasional sanitasi, sehingga terlebih dahulu dibuat lembar penilaian tersebut yang mengacu pada Direktorat Jenderal Pengolahan dan Pemasaran Hasil Perikanan (2007) yang disesuaikan dengan kondisi di lapangan (Lampiran 1). Aspek-aspek yang dinilai, dihitung jumlah penyimpangannya yang meliputi penyimpangan Minor (MN), Mayor (MY), Serius (SR) maupun Kritis (KR) sesuai dengan yang telah ditentukan dalam daftar tersebut. Analisis mutu dilakukan untuk mengetahui mutu bahan baku dan produk pindang tongkol yang dikaitkan dengan proses pengolahan yang dilakukan oleh para pengolah.
Analisis mutu terdiri dari uji organoleptik, uji kimia, dan uji mikrobiologi . Uji kimia meliputi uji kadar histamine, TVB dan Formalin. Uji mikrobiologi, yaitu TPC (Total Plate Count), Escherechia coli, dan uji Salmonella. Prosedur penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Diagram alir prosedur penelitian 3.4Analisis
3.4.1 Uji organoleptik (SNI 01-4110.1-2006)
Metode yang digunakan untuk uji organoleptik ikan tongkol ini berdasarkan SNI 01-4110.1-2006 ikan beku. Metode ini menggunakan angka yang berkisar antara 1 sampai 9 dengan penilaian dalam keadaan beku dan setelah pelelehan(thawing). Penilaian dalam keadaan beku antara lain lapisan es, dehidrasi, dan diskolorasi. Pengukuran organoleptik merupakan cara penilaian mutu ikan tongkol yang bersifat subyektif dengan menggunakan indera manusia. Jumlah panelis yang digunakan adalah 6 orang dengan kategori panelis expert.
Pengolahan pindang ikan tongkol
Penilaian pengolahan pindang ikan tongkol wawancara ‐ Keadaan umum pengolahan pindang ikan tongkol ‐ Kapasitas produksi ‐ Asal bahan baku ‐ Proses pengolahan Penilaian penerapan Sanitasi ‐ Penyimpangan Minor ‐ Penyimpangan mayor ‐ Penyimpangan kritis ‐ Penyimpangan serius Analisis mutu pindang ikan tongkol
Mutu bahan baku Mutu produk
‐ Uji organoleptik ‐ Kadar histamin ‐ Kadar TVB ‐ Uji formalin ‐ Uji TPC ‐ Uji bakteri E. coli ‐ Uji Bakteri Salmonella
3.4.2 Uji kimia
Pengujian kimia dilakukan untuk mengetahui karakteristik kimia ikan pindang meliputi uji kadar histamin, Total Volatile Base (TVB), dan pengujian formalin.
(1) Pengujian kadar histamin (SNI 2534-10.2009)
Tahapan prosedur kerja yang dilakukan dalam pengujian histamin adalah sebagai berikut:
a) Tahap ekstraksi
Sebanyak 10 gram sampel ditimbang dan ditambah 50 ml metanol, selanjutnya dihomogenkan dengan homogenizer (blender) selama 1-2 menit. Larutan sampel yang sudah dihomogenkan dipanaskan dalam waterbath pada suhu 60 0C selama 15 menit, kemudian didinginkan dalam suhu ruang. Sampel yang sudah dingin dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan metanol sampai tanda tera serta dikocok agar homogen. Larutan sampel disaring dengan kertas saring dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Sampel siap untuk di clean-up.
b) Tahap clean-up/elusi
Tahap ini disiapkan kolom kromatografi (panjang 20 cm diameter 7 mm), sebelum digunakan kolom tersebut di isi dengan glass woll secukupnya (tinggi 1 cm) dan aquadest. Kemudian dimasukkan resin penukar ion (dowex 1-x800-100-mesh) ke dalam kolom sampai tingginya kurang lebih 8 cm. Pada saat digunakan, diusahakan kolom jangan sampai kering hingga kebagian resinnya, karena akan mempengaruhi daya kerja penukar ion tersebut. Supaya tidak kering dibilas dengan akuades. Kemudian sampel dilewatkan sebanyak 1 ml ke dalam kolom yang telah diberi aquadest dan tampung hasilnya dalam labu ukur 50 ml yang telah diberi 5 ml HCl 1 N.
c) Tahap pembentukan
Beberapa tabung reaksi disiapkan, sebanyak 10 ml HCl 0,1 N dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 5 ml sampel (hasil elusi), 5 ml standar histamin (sebagai larutan standar) dan 5 ml HCl 0,1 N (sebagai blanko). Setelah itu ditambahkan 3 ml NaOH 1 N lalu dihomogenkan dan dibiarkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan lagi sebanyak 1 ml OPT (O-phtalaldehid) 1%
lalu dihomogenkan dan didiamkan selama 4 menit. Setelah itu ditambahkan 3 ml H3PO4 3,57 N lalu homogenkan. Setelah selesai sampel siap untuk dibaca dengan
Spetroflourometer pada panjang gelombang 450 nm. Perhitungan nilai histamin dapat dihitung dengan rumus:
Keterangan :
y : fluresensi contoh a : intersep
b : slope
x : konsentrasi contoh yang akan dihitung
konsentrasi histamin µg/g contoh Ax X volume akhir ml X fp
gram contoh Keterangan :
A = konsentrasi (x) yang didapat dalam perhitungan ( / (2) Pengujian TVB (SNI 01-4495-1998)
Sampel ditimbang sebanyak 25 gram, kemudian ditambahkan 75 ml TCA 7% dan diblender sampai homogen, lalu disaring dengan kertas saring dan ditampung dalam erlenmeyer. Selanjutnya diambil 1 ml ekstrak dimasukkan ke dalam cekungan luar pinggir kiri dari cawan conway, dipipet sebanyak 1 ml K2CO3 dan dimasukkan ke dalam cekungan luar pinggir kanan. Setelah itu
sebanyak 2 ml asam borat dipipet dan masukkan ke dalam cekungan tengah cawan conway lalu tetesi dengan indikator conway sebanyak 2 tetes menggunakan pipet tetes. Kemudian cawan ditutup, sedikit digoyangkan untuk mencampur ketiga larutan tersebut. Setelah selesai inkubasi titrasi larutan borat pada bagian dalam (inner chamber) cawan conway blanko dengan larutan HCl 0,02 N sehingga warna larutan asam borat berubah menjadi merah muda (pink), selanjutnya berturut-turut titrasi larutan asam borat pada cawan conway contoh sampai diperoleh warna merah yang sama dengan blanko. Perhitungan nilai TVB dapat dihitung dengan rumus:
TVB mgN 100 g
i j x N HCl x 14,007 x Fp x 100 Berat sampel g
Keterangan:
i = volume titrasi sampel (ml) j = ml titrasi HCl blanko Fp = faktor pengenceran
(3) Pengujian formalin (formaldehyde test-aquamerck®)
Pengujian kandungan formalin pada ikan tongkol menggunakan metode kualitatif, dengan indikator warna setelah dilakukan reaksi. Prosedurnya sebagai berikut: contoh ditimbang sebanyak 10 gram, kemudian ditambah akuades sebanyak 100 ml, dihomogenkan dengan stomacher. Contoh diambil sebanyak 50 ml dan disentrifuse selama 5 menit. Sebanyak 5 ml sampel yang telah dihomogenkan ditempatkan dalam dua botol sampel. Kemudian ke dalam salah satu botol sampel tersebut diteteskan sebanyak lima tetes larutan sodium hidroksida (reagent 1). Nilai pH harus diatas 13, dilakukan pengecekan dengan kertas pH. Selanjutnya ditambahkan sebanyak satu sendok mikro reagent 2. Botol sampel ditutup dan dikocok sampai larut dengan sempurna. Sampel didiamkan selama 5 menit dan dilakukan perbandingan warna pada kartu warna. Apabila terdapat warna ungu maka positif (+) mengandung formalin. Jika warnanya kuning maka negatif (-).
3.4.3 Uji mikrobiologi
Uji mikrobiologi dilakukan untuk mengetahui cemaran biologis pada bahan baku dan pindang ikan tongkol. Uji mikrobiologi terdiri dari pengujian
Total Plate Count (TPC), bakteri Escherichia coli, dan Salmonella.
(1) Pengujian Total Plate Count (TPC) atau penentuan angka lempeng total (ALT) pada produk perikanan (SNI 01-2332.3-2006).
a) Preparasi Contoh
Sampel diambil secara acak dan dipotong kecil – kecil hingga beratnya 300 gram, kemudian dimasukkan dalam wadah atau plastik steril. Selanjutnya ditambahkan 225 ml larutan Bufferfield’s phosphate buffered dan dihomogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran10-1, kemudian
dengan pipet steril diambil 1 ml homogenat diatas dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan bufferfield’s phosphate buffered untuk mendapatkan pengenceran 10-2. Pengenceran selanjutnya (10-3), dilakukan dengan mengambil 1 ml sampel dari pengenceran 10-2 dimasukkan kedalam 9 ml larutan bufferfield’s phosphate buffered. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Selanjutnya dilakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-4, 10-5 dan seterusnya sesuai kondisi sampel.
b) Metode agar tuang/pour plate method
Sampel yang telah dienceran 10-1, 10-2 dan seterusnya, dipipet masing-masing 1 ml dan dimasukan ke dalam cawan petri steril. Prosedur tersebut dilakukan secara duplo untuk setiap pengenceran.
Media Plate Count Agar (PCA) yang telah didinginkan dalam waterbath
hingga mencapai suhu 45 oC, dituangkan sebanyak 12-15 ml ke dalam masing-masing cawan yang sudah berisi sampel. Cawan yang telah terisi sampel dan media PCA digerakkan ke depan ke belakang ke kiri dan ke kanan supaya tercampur sempurna. Setelah agar menjadi padat, untuk penentuan mikroorganisme aerob cawan-cawan tersebut diinkubasi dalam posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 22 oC (psikrofilik), 35 oC(mesofilik), dan 45 oC (termofilik). Mikroorganisme anaerob ditentukan dengan
anaerobic jar, dengan cara cawan-cawan tersebut diinkubasikan dalam anaerobic jar dengan posisi terbalik dan dimasukkan ke dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 22 oC (psikrofilik), 35 oC (mesofilik), dan 45 oC (thermofilik).
Pengenceran yang digunakan dicatat dan dilakukan penghitungan jumlah total koloni. Jumlah koloni bakteri yang dihitung adalah cawan petri yang mengandung koloni bakteri antara 25 koloni-250 koloni dan bebas spreader.
(2) Pengujian Bakteri Escherichia coli (SNI 01-2332.1-2006)
Pengujian bakteri Escherichia coli dilakukan dalam beberapa tahap. Tahap uji tersebut adalah uji pendugaan, uji penegasan, uji morfologi, dan uji biokimia. a) Tahap analisis
Pengenceran 10-2 disiapkan dengan cara melarutkan 1 ml larutan 10-1 ke dalam 9 ml larutan pengencer Butterfield’s Phosphate Buffered. Pengenceran selanjutnya dilakukan sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh.
Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Sebanyak 1 ml larutan dipindahkan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung
Lauryl Ttryptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham. Tabung-tabung tersebut diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 oC. Selanjutnya diperhatikan gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam dan diinkubasikan kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
b) Uji pendugaan Escherichia coli (presumptive Escherichia coli)
Setiap tabung LTB yang positif diinokulasi dengan jarum ose ke tabung-tabung yang berisi larutan EC Broth dan tabung durham. Selanjutnya tabung-tabung tersebut diinkubasi dalam waterbath sirculation selama 48 jam pada suhu 45 oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari cairan yang ada dalam tabung yang diinkubasi. Tabung-tabung tersebut diperiksa setelah 24 jam diinkubasi, untuk menguji timbulnya gas. Apabila tidak menghasilkan gas atau negatif, diinkubasi kembali sampai 48 jam. Tabung yang positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Selanjutnya ditentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nilainya dinyatakan sebagai “APM/g faecal coliform”. c) Uji penegasan Escherichia coli (confirmed Escherichia coli)
Tabung-tabung EC Broth positif diambil dan digoreskan ke LEMB agar dengan menggunakan jarum ose, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Koloni Escherichia coli akan memberikan ciri yang khas, yaitu terdapat warna hitam pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik. Beberapa koloni (typical) Escherichia coli diambil dari masing-masing cawan LEMB dan digoreskan ke media PCA miring dengan jarum tanam, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Jika tidak ada koloni yang khas (typical), pindahkan satu atau lebih koloni yang tidak khas (typical) Escherichia coli
ke media PCA miring. d) Uji morfologi
Prosedur uji morfologi dilakukan dengan pewarnaan gram dari setiap koloni
24 jam. Dengan menggunakan mikroskop, bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus.
e) Uji biokimia 1. Produksi indol ( I )
Sebanyak satu ose koloni E. coli dari PCA miring yang diduga positif diambil dan dilakukan inokulasi kedalam tryptone Broth serta diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Uji Indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 ml-0,3 ml pereaksi Kovacs. Reaksi menunjukkan positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif jika terbentuk cincin warna kuning.
2. Uji voges proskauer (VP)
Sebanyak satu ose koloni E. coli dari PCA miring yang diduga positif diambil dan dilakukan inokulasi kedalam MRVP Broth serta diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 0C. Dipindahkan 1 ml dari setiap MRVP Broth yang tumbuh ke tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril dan ditambahkan 0,6 ml larutan alpha naphtol dan 0,2 ml 40 % KOH, dan dikocok. Untuk mempercepat reaksi ditambahkan sedikit kristal kreatin. Selanjutnya dikocok kembali dan didiamkan selama 2 jam. Reaksi menunjukkan positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby).
3. Uji methyl red (MR)
Media MRVP Broth di atas diinkubasi kembali selama 48 jam pada suhu 35 0C. Selanjutnya diambahkan 5 tetes indikator Methyl red pada setiap MRVP
Broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning.
4. Uji sitrat (C)
Sebanyak 1 ose dari PCA miring digoreskan ke permukaan simmon citrat agar. diinkubasi selama 96 jam pada suhu 35 0C. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.
5. Produksi gas dari laktosa
Sebanyak 1 ose dari PCA miring diinokulasikan kedalam LTB, dan diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 35 0C. Reaksi positif jika menghasilkan
gas pada tabung durham. Interpetasi hasil pengujian bakteri Escherichia coli dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Interpetasi Hasil Pengujian Bakteri Escherichia coli
(SNI 01-2332.1-2006)
Kriteria Biotipe 1 Biotipe 2
Gas pada tabung LTB + +
Indol + -
MR + +
VP - -
Citrat - -
Uji Morfologi Gram negatif, bentuk batang pendek berspora
Gram negatif, bentuk batang pendek tidak berspora (3) Pengujian Bakteri Salmonella (SNI –01-2332.2-2006)
Prinsip dasar uji bakteri Salmonella adalah dengan menumbuhkan terlebih dahulu koloni Salmonella dari sampel yang diuji pada media pengkayaan, kemudian dideteksi dengan menumbuhkannya pada media agar selektif. Koloni-koloni yang diduga Salmonella (suspected colonies) pada media selektif diisolasi dan dilanjutkan dengan konfirmasi melalui uji biokimia dan uji serologi untuk meyakinkan ada atau tidaknya bakteri Salmonella.
Sampel ditimbang sebanyak 25 g, kemudian dimasukkan ke dalam wadah atau plastik steril dan ditambahkan 225 ml larutan Lactose Broth. Sampel yang akan dianalisis dihomogenkan selama 2 menit dan dikocok hingga rata serta dikendurkan tutup wadah secukupnya. Selanjutnya sampel diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Sebanyak 0,1 ml larutan sampel dipindahkan ke dalam 10 ml Rappaport-Vassiliadis (RV) medium dan 1 ml larutan sampel ke dalam 10 ml Tetrathionate Broth (TTB). Selanjutnya 1 ml larutan sampel dipindahkan ke dalam masing-masing 10 ml TTB. RV medium diinkubasi selama 24 jam pada suhu 42 oC (Waterbath) dan inkubasi TTB selama 24 jam pada suhu 43 oC (Waterbath).
Tabung dikocok menggunakan vortex dan digoreskan TTB yang telah diinkubasi ke dalam media Hectoen Enteric (HE), Xylose Lysine Desoxycholate
(XLD) agar, dan Bismuth sulfite Agar (BSA). Media BSA disiapkan sehari sebelum digunakan untuk analisis, dan simpan di tempat gelap pada suhu ruang. Tahap berikutnya digoreskan ke dalam media yang sama dari RV Broth. Cawan
HE, XLD, dan BSA diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC, kemudian dilakukan pengamatan akan kemungkinan adanya koloni Salmonella.
Koloni Salmonella diambil 2 atau lebih dari masing-masing media agar selektif setelah 24 jam inkubasi. Kriteria koloni-koloni Salmonella yang khas (typical) pada masing-masing media adalah sebagai berikut :
1) HE Agar, koloni hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
2) XLD Agar, koloni merah jambu (pink) dengan atau tanpa inti hitam. Umumnya kultur Salmonella membentuk koloni besar, inti hitam mengkilat atau hampir seluruh koloni terlihat berwarna hitam.
3) BSA, koloni coklat, abu-abu atau hitam, kadang-kadang metalik. Biasanya media di sekitar koloni pada awalnya berwarna cokelat, kemudian berubah menjadi hitam (halo effect) dengan semakin lamanya waktu inkubasi. Apabila koloni yang khas (typical) tumbuh pada BSA setelah 24 jam inkubasi, diambil 2 koloni atau lebih, kemudian diinkubasikan kembali media BSA selama 24 jam. Setelah 48 jam inkubasi, diambil 2 atau lebih koloni yang khas (typical) yang tumbuh pada media BSA. Pengambilan ini dilakukan jika hanya koloni yang tumbuh pada media BSA yang diinkubasi selama 24 jam memberi reaksi yang tidak sesuai pada Triple Sugar Iron
(TSI) dan Lysine Iron Agar (LIA), yang menjadikan kultur ini dinyatakan sebagai bukan Salmonella.
Bagian tengah koloni diambil menggunakan jarum inokulasi steril dan digoreskan ke permukaan media TSI agar, dilanjutkan dengan menggoreskan jarum tersebut pada media LIA dengan cara menusuk agar tegak lebih dahulu, setelah itu goreskan pada media agar miring. Kedua media tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC dengan membiarkan tutup sedikit kendur untuk mencegah terbentuknya H2S. Pengamatan dilakukan untuk kengetahui adanya
koloni salmonella.
Sebanyak satu ose dari media TSI diambil menggunakan jarum inokulasi steril, dimasukkan kedalam Indol, MR-VP, Simmon Citrat Agar, Dulcit, Lactose, Sukrose,Urea Broth dan LDB. Media-media tersebut diinkubasi selama 24 jam
pada suhu 35 oC. Media indol yang telah diinkubasi 24 jam, dilanjutkan dengan uji KCN, malonat, dan uji indol menggunakan pereaksi Kovaks.
Pengujian Methyl Red dilakukan dengan memindahkan satu ml MR-VP Broth yang telah diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35 °C ke dalam tabung reaksi steril dan diinkubasikan kembali MR-VP Broth selama 48 jam pada suhu 35°C. Sebanyak 0,6 ml alpha naphtol ditambahkan dan dikocok, ditambahkan lagi 0,2 ml larutan 40 % KOH dan kocok kembali. Kristal keratin ditambahkan sedikit untuk mempercepat reaksi dan hasilnya dapat diamati setelah 4 jam. Pengujian Methyl red (MR) ditambahkan 5-6 tetes indikator Methyl Red kedalam media MR-VP yang telah diinkubasi selama 96 jam. Umumnya, Salmonella
memberikan reaksi positif, ditandai dengan terjadinya difusi warna merah pada media. Reaksi positif ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna menjadi merah muda eosin sampai merah delima (ruby) pada media. Terjadinya warna kuning menunjukan reaksi negatif. Salmonella memberikan reaksi VP negatif.
Uji serologi Polyvalent Flagellar (H) dapat dilakukan setelah uji biokimia. Sebanyak satu ose dari masing-masing TSI Agar yang memberikan reaksi negatif dipindahkan ke dalam 5 ml BHI Broth, dan diinkubasi selama 4-6 jam pada suhu sampai terlihat pertumbuhan. Sebanyak 2,5 ml larutan Formanilized Physiological Saline ditambahkan ke dalam BHI Broth (untuk uji pada hari yang sama) atau 5 ml Trypticase Soy-Tryptose Broth (TSTB) dan inkubasi selama 24 jam pada suhu 35oC, 2,5 ml larutan Formanilized Physiological Saline ke dalam TSTB (untuk uji pada hari berikutnya).
Sebanyak 2 kultur dari TSI (contoh dan control) yang telah diberi
Formanilized Physiological Saline dan uji dengan Salmonella Polyvalent Flagellar (H) disiapkan, kemudian dimasukkan 0,5 ml larutan Salmonella Polyvalent Flagellar (H) antisera dalam tabung serologi 10 x 75 mm atau 13 x 100 mm. Selanjutnya ditambahkan 0,5 ml antigen yang akan diuji. Disiapkan kontrol saline dengan mencampur 0,5 ml Formanilized Physiological Saline dengan 0,5 ml formalinized antigen. Inkubasi campuran tersebut dalam
waterbath pada suhu 48-50 oC. Pengamatan dilakukan pada setiap interval waktu 15 menit dan diamati juga hasilnya selama 1 jam. Reaksi positif apabila terjadi penggumpalan dalam uji campuran dan tidak ada penggumpalan dalam kontrol.
Reaksi negatif apabila tidak ada penggumpalan dalam uji campuran dan tidak ada penggumpalan dalam kontrol.
Perlakuan terhadap kultur yang memberikan hasil uji serologi flagellar (H) negatif maka menunjukkan bahwa kultur tersebut adalah Salmonella. Penggumpalan flagellar (H) negatif mungkin disebabkan karena organisme non motil atau karena antigen flagellar tidak berkembang. Pembuatan kultur dilakukan dengan diinokulasi Motility Test Medium dalam petridish menggunakan koloni yang tumbuh pada TSI miring. Media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 oC. Bila organisme berpindah sejauh 40 mm atau lebih maka dilakukan uji ulang dengan cara diinokulasi sejumlah pertumbuhan terjauh ke dalam Trypticase Soy-Trytose Broth.
Pengulangan pengujian Polyvalent Flagellar (H) dilakukan apabila tidak terjadi pergerakan setelah 24 jam pertama, diinkubasikan kembali selama 24 jam pada suhu 35 oC, dan apabila masih tidak bergerak diinkubasi sampai 5 hari pada suhu 25 oC. Kultur yang tidak bergerak (non motile) pada semua uji diatas menunjukkan hasil uji yang negatif. Selanjutnya, bila kultur memberikan reaksi flagellar (H) negatif tetapi memberikan reaksi biokomia positif, maka kultur perlu untuk diuji serologi.
Uji serologi Polyvalent Somatic (O) dilakukan dengan mengambil 1 ose kultur dari TSI yang telah diinkubasi selama 24-48 jam dan diletakkan diatas gelas preparat. Gelas preparat yang telah diberi kultur ditetesi dengan larutan saline 0,85% steril dan diemulsikan. Koloni Antiserum dicampurkan sedikit demi sedikit dengan suspensi koloni sampai tercampur sempurna. Pembuatan kontrol dengan menggunakan larutan saline dan Antiserum. Hasil uji positif apabila terjadi penggumpalan pada larutan kultur dan tidak terjadi penggumpalan pada larutan kontrol, dan hasil uji negatif apabila tidak terjadi penggumpalan buih pada larutan kultur maupun larutan kontrol.
C
PROSES PENGUJIAN
SALMONELLA (2)
Positif Koloni Samonella ? YAmbil Koloni & Teteskan Serum Positif Koloni Samonella ? Y T T E D Positif Koloni Samonella ? Y
Ambil Koloni & Teteskan Serum Positif Koloni Samonella ? Y T T F Laporan Salmonella END
3.5 Pengambilan Sampel
Cara pengambilan contoh disesuaikan dengan metode sampling, peralatan yang digunakan untuk pengambilan contoh ini harus bersih, kering, tidak bocor, steril dan ukurannya harus sesuai dengan contoh yang diambil. Pengambilan contoh dilakukan pada bahan baku dan produk jadi (pindang tongkol), dengan menggunakan cool box, supaya suhu dapat dipertahankan. Sampel produk jadi (pindang tongkol) diletakkan dalam wadah plastik dengan menggunakan tutup yang aman.
Pengambilan sampel dengan metode tak acak (nonprobability sampling), yaitu purposive sampling (perkiraan) dimana penarikan sampel dilakukan dengan perkiraan yang dapat dianggap mewakili populasi. Pengambilan jumlah sampel untuk bahan baku dan produk jadi (pindang tongkol) mengacu pada pengambilan sampel padat atau curah dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Daftar pengambilan sampel padat dalam karung/peti Jumlah contoh per lot
Karung/peti
Jumlah sampel yang diambil Karung/peti 1 – 10 11 – 25 26 – 50 51 – 100 > 100
Semua karung atau peti harus diambil 5
7 10
Akar pangkat dua dari jumlah karung atau peti Sumber: Keputusan Kepala Badan Karantina Pertanian No. : 2897.a/PD.670.320/L/10/07. 3.6 Analisis Data
Analisis data yang digunakan adalah analisis statistik deskriptif, yaitu analisis data dengan cara menggambarkan keadaan dan kondisi pengolahan ikan pindang. Data disajikan dalam bentuk histogram, tabel atau gambar kemudian diinterpretasikan. Statistik deskriptif atau statistik deduktif adalah bagian dari statistik yang mempelajari cara pengumpulan dan penyajian data sehingga mudah dipahami (Hasan 2008).
