BAB III
METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental meliputi pengumpulan bahan, pengolahan bahan, penyiapan hewan percobaan (mencit), penyiapan bahan uji dan pengujian efek imunomodulator ekstrak etanol daun mahkota dewa terhadap respon hipersensitivitas tipe lambat dan titer antibodi sel imun pada hewan percobaan. Data hasil penelitian dianalisis dengan program SPSS 19 menggunakan uji One Way ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tukey.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, neraca listrik, mortar dan stamfer, neraca hewan, spuit, oral sonde, plethysmometer digital, centrifuse PLC Series, microtube, microtitration plate, dan
micropipette (Microlit).
3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak etanol daun mahkota dewa, akuades, CMC Na, sel darah merah sapi (SDMS), tablet Phosphate Buffered Saline (PBS), heparin (inviclot®), triton dan levamisol (Askamex®).
3.3 Hewan Percobaan
(t-1)(n-1)>15
Keterangan:
t : jumlah perlakuan
n : banyaknya sampel setiap perlakuan.
Dengan rumus ini didapat jumlah sampel untuk masing-masing kelompok adalah minimal 5 (lima) ekor mencit. Total adalah 25 ekor mencit (Lampiran 4).
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan berat 30-40 g dibagi 5 kelompok dimana tiap kelompok terdapat 5 ekor yang terdiri dari 1 kelompok kontrol (CMC 1%), 1 kelompok pembanding (levamisol) dan 3 kelompok uji (variasi dosis dari ekstrak yaitu 50, 100 dan 200 mg/kg bb).
Sebelum diberi perlakuan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama kurang lebih satu minggu untuk penyesuaian lingkungan, mengontrol kesehatan dan berat badan serta menyeragamkan makanannya (Sabina, 2009).
3.4 Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa
Ekstrak diperoleh dari Hotmaida pada Agustus 2016. Metode ekstraksi yang digunakan yaitu metode maserasi bertingkat, sesuai dengan yang tertera dalam Farmakope Indonesia Edisi III (1979).
3.5 Pembuatan Larutan
3.5.1 Pembuatan Suspensi CMC Na 1%
Sebanyak 500 mg CMC Na ditaburkan ke dalam lumpang berisi akuades panas sebanyak 20 ml. Didiamkan selama 15 menit lalu digerus hingga diperoleh massa yang transparan, lalu diencerkan dengan akuades, dihomogenkan dan dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, dicukupkan volumenya dengan akuades hingga 50 ml.
3.5.2 Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa 200, 100 dan 50 mg/ kg bb
Untuk dosis 200 mg/kg bb dibuat dengan cara ditimbang 200 mg ekstrak etanol daun mahkota dewa, kemudian dimasukkan ke dalam lumpang. Kemudian tuang sedikit demi sedikit suspensi CMC Na 1% sambil digerus hingga homogen, setelah homogen dituangkan ke dalam labu tentukur 10 ml dan dicukupkan dengan suspensi CMC Na 1% hingga garis tanda. Begitu juga untuk pembuatan dosis 100 dan 50 mg/kg bb dilakukan hal yang sama.
3.5.3 Pembuatan Suspensi Levamisol 25 mg/kg bb
Pengambilan sampel tablet levamisol yaitu dengan cara ditimbang dan digerus tidak kurang dari 20 tablet. Ditimbang serbuk yang telah dihaluskan tersebut kemudian ditimbang seksama sejumlah serbuk setara dengan lebih kurang 25 mg levamisol (Depkes, 1995: Wiratmi 2014).
ml, dan kemudian ditambahkan suspensi CMC Na 1% sampai batas tanda (Wiratmi, 2014). Perhitungan serbuk levamisol yang ditimbang dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 40.
3.5.4 Pembuatan Larutan Phosphate Buffered Saline (PBS)
Pembuatan larutan PBS dilakukan dengan cara 1 tablet PBS terlebih dahulu digerus lalu dilarutkan dalam 200 ml akuades.
3.5.5 Pembuatan Sel Darah Merah Sapi (SDMS)
Penyiapan dan pembuatan SDMS dilakukan dengan cara sebagai berkut:. Darah segar dikumpulkan dari darah sapi yang disembelih, diperoleh 500 ml. Kemudian ditambahkan 1,5 ml heparin dan dimasukkan ke dalam termos yang berisi es.
3.5.6 Pembuatan Larutan Triton
Pembuatan larutan triton dengan cara sebagai berikut: ditimbang NaCl sebanyak 0,2 gram, dilarutkan dalam akuabides 100 ml, kemudian 2 tetes triton lalu diaduk hingga homogen.
3.6 Uji Respon Hipersensitivitas
Efek imunomodulator ekstak etanol daun mahkota dewa ditentukan dengan mengukur volume respon hipersensitivitas menggunakan uji pembengkakan telapak kaki hewan uji (foot paw swelling test) (Lakhsmi, 2003; Ray 1996).
Sebanyak 25 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok dengan pembagian 1 kelompok kontrol pelarut, 1 kelompok kontrol positif, dan 3 kelompok uji. Tiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit jantan. Hewan dikelompokkan sebagai berikut:
Kelompok I : diberi sediaan suspensi CMC Na 1%
Kelompok II : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 50 mg/kg BB Kelompok III : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 100 mg/kg BB Kelompok IV : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 200 mg/kg BB Kelompok V : diberi sediaan suspensi Levamisol dengan dosis 25 mg/kg BB
volume awal (V0). Kemudian mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml suspensi SDMS 1% dalam larutan PBS secara intraplantar pada telapak kaki sebelah kanan.
Pada hari kedelapan (setelah 24 jam) diukur volume pembengkakan kaki mencit dengan plethysmometer digital. Pengukuran dilakukan dengan mencelupkan kaki mencit ke dalam tabung yang berisi larutan triton sampai tanda batas pengukuran. Perubahan volume larutan triton terlihat pada angka analog yang tertera pada alat sebagai volume waktu tertentu (Vt) kaki mencit. Volume pembengkakan kaki mencit ditentukan berdasarkan selisih antara volume waktu tertentu (Vt) dengan volume awal (V0) (Shivaprasad, 2006).
3.7 Uji Titer Antibodi
Pada kelompok mencit diinjeksikan dengan 0,1 ml sel darah merah sapi dalam larutan PBS secara intraperitonial pada hari ke-0. Perlakuan pemberian ekstrak etanol daun mahkota dewa dimulai dari hari ke-1 dan diberikan satu kali setiap hari selama 7 hari. Pada hari ke-7, sampel darah pada masing masing mencit diambil melalui pembuluh darah vena bagian ekor. Sampel darah diikumpulkan dalam tabung mikro (microtube), kemudian dilakukan pemusingan 1900 rpm dengan alat sentrifugasi selama 10 menit, lalu diambil serumnya.
Kemudian tiap lubang ditambahkan SDMS 1% sebanyak 25 µl. Setelah itu didiamkan selama 1 jam dan diamati hemaglutinasi secara visual (Makare, 2001: Puri, 1993). Nilai titer antibodi ditentukan berdasarkan pengenceran terakhir dimana antibodi masih terdeteksi melalu hemaglutinasi yang terlihat secara visual. Nilai titer antibodi tersebut selanjutnya ditransformasikan dengan [2log(titer)+1] (Hargono, 2000).
3.8 Analisis Statistik
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini digunakan ekstrak etanol daun mahkota dewa yang sama dengan ekstrak yang digunakan Hotmaida (2016). Hasil skrinning fitokimia yang telah dilakukan Hotmaida diperoleh ekstrak etanol mengandung senyawa golongan alkaloida, flavonoid, saponin, tannin, glikosida dan steroid/triterpenoid. Hasil pemeriksaan karakteristik simplisia diperoleh kadar air 1,65%, kadar abu total 4,18%, dan kadar abu tidak larut asam 0,09%.
4.1 Hasil Uji Efek Imunomodulator
Pengujian efek imunomodulator ekstrak etanol daun mahkota dewa yang dilakukan dengan metode respon hipersensitivitas tipe lambat dan titer antibodi digunakan untuk melihat pengaruh ekstrak terhadap aktivitas dan mekanisme sistem imun seluler dan imun humoral yang melibatkan sel T dan sel B serta plasma yang berfungsi memproduksi antibodi (Nafrialdi, 2007). Respon imun spesifik humoral dapat dilihat dari parameter peningkatan hemaglutinasi sedangkan repon imun seluler dilihat dari parameter pembengkakan kaki mencit. Menurut Makare, et al. (2001), kombinasi kedua metode tersebut mempunyai keuntungan diantaranya memungkinkan dua komponen respon imun diukur pada spesies yang sama dibawah kondisi ideal, relatif sederhana dan tidak mahal.
meningkatkan reaksi inflamasi yang ditandai dengan pembengkakan kaki hewan uji (Roitt, 2002).
Pengukuran nilai titer antibodi dilakukan dengan menggunakan metode hemaglutinasi. Hemaglutinasi adalah ikatan antara sel darah merah sebagai antigen dengan antibodi sehingga menimbulkan suatu gumpalan endapan yang dapat dilihat. Pada lingkungan dengan pH netral, sel darah merah bermuatan sehingga terjadi aksi tolak menolak antar sel. Oleh karena itu sel darah merah yang digunakan disuspensikan dalam larutan penyangga dengan pH netral + 7 (PBS) untuk menjaga agar sel darah merah tetap dalam kondisi netral, sehingga tetap bermuatan negatif. Hemaglutinasi terbentuk karena adanya ikatan silang antara sel darah merah dengan antibodi. Antibodi yang mempunyai kemampuan lebih besar untuk berikatan dengan sel darah merah adalah IgM. IgM mempunyai ukuran yang lebih besar dan valensi yang tinggi, sehingga dapat melawan rintangan elektrik dan membentuk ikatan silang dengan sel darah merah sehingga menyebabkan aglutinasi. Antibodi lainnya seperti IgG mempunyai ukuran dan valensi yang lebih kecil, sehingga kemampuan IgG melawan rintangan elektrik lebih lemah dibandingkan dengan IgM (Kuby, 1994).
4.1.1 Uji Respon Hipersensitivitas Tipe Lambat
Data hasil penelitian dapat dilihat pada tabel 1 berikut.
Tabel 4.1 Pembengkakan Kaki Mencit dan Nilai Titer Antibodi (Mean + SD)
0
CMC Na EEDMD 50 EEDMD 100 EEDMD 200 Levamisole
V
Volume pembengkakan kaki mencit yang terjadi pada tiap kelompok perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.1.
Gambar 4.1 Volume Pembengkakan Kaki Mencit Pada Berbagai Perlakuan (Data = Mean + SD, n = 5)
Keterangan:
* = P<0,05, signifikan terhadap kontrol + = P<0,05, signifikan terhadap levamisol
dosis 50 dan 100 mg/kb bb. Tetapi dosis 200 mg/kg bb menunjukkan hasil yang tidak berbeda signifikan terhadap kontrol positif (levamisol) (p>0,05) (Lampiran 8). Hal ini terkait dengan mekanisme kerja levamisol.
Mekanisme kerja levamisol terhadap hipersensitivitas tipe lambat adalah dapat meningkatkan proliferasi dan sitotoksisitas sel T. Levamisol dapat meningkatkan efek antigen, mitogen, limfokin dan faktor kemotaktik untuk merangsang limfosit, granulosit dan makrofag (Baratawidjaja, 2014)
Mekanisme kerja dari respon hipersensisitivitas tipe lambat adalah antigen yang terdiri dari suatu kompleks hapten dan protein, bereaksi dengan T-limfosit yang sudah disensitasi. Limfokin tertentu (sitokin dari limfosit) dibebaskan, yang menarik makrofag dan neutrofil, sehingga terjadi reaksi peradangan. Proses penarikan makrofag dan neutrofil ke tempat terjadinya infeksi disebut kemotaksis. Mulai reaksinya sesudah 24-48 jam dan bertahan beberapa hari (Tjay dan Rahardja, 2013).
0
CMC Na EEDMD 50 EEDMD 100 EEDMD 200 Levamisole
Ni mengaktivasi makrofag yang berperan dalam proses fagositosis (Roitt, 1990). 4.1.2 Titer Antibodi
Titer antibodi yang terjadi pada tiap kelompok perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.2.
Gambar 4.2 Titer Antibodi Sel Imun Mencit Setelah Pemberian Ekstrak (Data = Mean + SD, n = 5)
Keteranagn:
* = P<0,05, signifikan terhadap kontrol + = P<0,05, signifikan terhadap levamisol
mg/kg bb dan levamisol (p<0,05). Dosis 100 mg/kg bb menunjukkan hasil yang tidak berbeda signifikan terhadap dosis 50 mg/kb bb dan dosis 200 mg/kb bb (p>0,05). EEDMD dosis 200 mg/kg bb menunjukkan hasil yang tidak berbeda signifikan terhadap kontrol positif (p>0,05) (Lampiran 8).
Berdasarkan data yang didapat dapat disimpulkan bahwa pemberian EEDMD dosis 50, 100, dan 200 mg/kg BB memberikan efek peningkatan titer antibodi sel imun mencit. Peningkatan titer antibodi terjadi karena peningkatan aktivitas sel B dalam pembentukan antibodi (Roit, 1990). Antibodi akan berikatan dengan antigen yang menginfeksi tubuh. Ikatan antigen dan antibodi memberikan gambaran adanya efek stimulasi ekstrak etanol daun mahkota dewa terhadap respon imun humoral yang berkaitan dengan stimulasi dan aktivasi sel B.
Uji titer antibodi berdasarkan uji hemaglutinasi. Hemaglutinasi merupakan cara untuk menemukan antibodi atas dasar aglutinasi sel darah merah. Sebagai antigen dapat digunakan sel darah merah itu sendiri atau antigen yang mensensitisasi sel darah merah. Antibodi adalah imunoglobulin yang merupakan golongan protein yang dibentuk oleh sel plasma atau berasal dari proliferasi sel B akibat adanya kontak dengan antigen. Titer antibodi yang tinggi menunjukkan bahwa sediaan uji dapat meningkatkan sistem imun (Hargono, dkk, 2000)
memberikan efek yang lebih baik dibandingkan dengan CMC Na 1%. Pemberian EEDMD dosis 200 mg/kg BB memberikan efek yang mendekati dengan pemberian levamisol dosis 25 mg/kg BB.
Maka dapat disimpulkan bahwa EEDMD dapat meningkatkan sistem imun, dimana EEDMD memberikan efek yang mendekati efek dari levamisol. Dimana levamisol bekerja dengan memperbaiki mekanisme pertahanan seluler dan memacu pematangan limfosit T (Syarif, 2007). Levamisol dapat memulihkan fungsi sel-sel B, sel-sel T, monosit dan makrofag yang terdepresi (Goodman dan Gilaman, 2012). Sehingga suspensi ekstrak etanol daun mahkota dewa (EEDMD) dapat digunakan sebagai imunostimulator terkait dengan pengaruhnya dalam meningkatkan respon hipersensitivitas tipe lambat dan titer antibodi sel imun mencit. Menurut Gotama dkk, (1999), flavonoid memiliki berbagai macam efek, salah satunya sebagai imunostimulan. Hal ini sesuai dengan pernyataan Wagner (1985) yang secara umum menyebutkan bahwa golongan terpenoid, alkaloid atau polifenol mempunyai sifat imunostimulator.
mengenai fungsi imunitas seluler yang dilakukan secara in vivo pada tikus membuktikan bahwa senyawa flavonoid dapat memacu proliferasi limfosit, meningkatkan jumlah sel T, dan meningkatkan aktivitas IL-2. senyawa tanin juga dapat mempengaruhi aktivitas fisiologi seperti menstimulasi sel fagosit, antitumor, dan antiinfeksi (Haslam, 1996). Saponin meningkatkan sistem kekebalan tubuh dengan cara meningkatkan produksi sitokin seperti interleukin dan interferon (Francis, dkk., 2002).
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil dari penelitian ini diperoleh bahwa:
a. EEDMD mempunyai pengaruh terhaddap respon hipersensitivitas tipe lambat. EEDMD 50, 100 dan 200 mg/kg bb menunjukkan volume pembengkakan kaki mencit yang lebih besar dibandingkan dengan kontrol CMC Na 1%. EEDMD 200 mg/kg bb memberikan efek yang sama dengan kontrol positif levamisol. b. EEDMD dapat meningkatkan titer antibodi sel imun mencit jantan dimana
pada dosis 50, 100, dan 200 mg/kg BB diperoleh nilai titer antibodi rata-rata 3,04 µl, 3,4 µl, dan 4,008 µl, dimana hasil dari dosis 200 mg/kg BB dekat dengan nilai titer antibodi kontrol positif (levamisol) dengan nilai 4,25 µl.
. 5.2 Saran
