BAB IV
ANALISIS KUALITATIF PROTEIN
TUJUAN :
Mengetahui prinsip dasar uji kualitatif protein
Mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode
A. Pre-lab
1. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode ninhidrin?
Metode ninhidrin adalah metode yang digunakan untuk menguji adanya asam amino dalam suatu sampel. Prinsip analisis protein dengan metode ninhidrin yaitu asam amino akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehid dengan satu atom C lebih rendah serta melepaskan molekul NH3 dan CO2. Sedangkan ninhidrin yang telah bereaksi akan
membentuk hidrindantin. Hasil positif metode ninhidrin akan ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna biru/keunguan. Hal ini disebabkan karena molekul ninhidrin dan hidrintantin bereaksi dengan NH3 setelah gugus asam amino teroksidasi (Sato, 2012).
2. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode biuret?
Metode biuret adalah metode yang digunakan untuk membuktikan adanya ikatan peptida dari protein. Prinsip metode biuret didasarkan pada reaksi antara ion Cu 2+ dan ikatan peptida
dalam suasana basa. Ion Cu2+dari pereaksi Biuret dalam suasana basa akan bereaksi dengan
ikatan peptida yang menyusun protein dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Intensitas warna ungu menunjukkan jumlah ikatan peptida yang ada pada protein. Reaksi biuret hanya akan menunjukkan hasil positif pada sampel yang terdiri dari dua ikatan peptida atau lebih (Buxbaum, 2007).
3. Mengapa pengujian protein selalu dilakukan pada kondisi alkali/basa?
Karena dalam suasana basa, CuSO4 dalam reagen biuret akan bereaksi dengan senyawa yang
TINJAUAN PUSTAKA
1.
ProteinProtein merupakan senyawa polipeptida kompleks yang disusun oleh kumpulan asam amino dan dihubungkan oleh suatu ikatan peptida atau amida. Protein merupakan senyawa yang sangat penting dalam sistem kehidupan karena protein memainkan peran yang sangat vital dalam semua aktivitas sel-sel tubuh makhluk hidup (Buxbaum, 2007).
Protein dapat tersusun dari kumpulan 20 macam asam amino, dimana sifat asam amino ini ditentukan oleh gugus R nya. Berfungsi sebagai penyusun unit struktural dan fungsional tubuh, misalnya bahan baku enzim, hormon, penyusun sel (Simpsons, 2012).
2.
Uji NinhidrinUji yang digunakan untuk menguji adanya asam amino dalam suatu sampel. Prinsipnya asam amino akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk aldehid dengan satu atom C lebih rendah serta melepaskan molekul NH3 dan CO2. Hasil positif akan
ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna biru/keunguan (Sato, 2012).
3.
Uji BiuretUji yang digunakan untuk membuktikan adanya ikatan peptida dari protein. Prinsip uji biuret didasarkan pada reaksi antara ion Cu2+ ikatan peptida dalam suasana
basa. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya kompleks warna ungu atau violet (Sato, 2012).
4. Fungsi Reagen 4.1 Reagen ninhidrin
Reagen untuk mendeteksi adanya amonia atau amina primer dan sekunder. Saat bereaksi dengan amina bebas, akan diproduksi warna biru tua atau ungu. Dapat menyebabkan iritasi saluran pernapasan (Sumardjo, 2006).
4.2 Reagen Biuret
menyebabkan gangguan pencernaan, iritasi saluran pernapasan, mata, kulit (Sumardjo, 2006).
5. Tinjauan Bahan 5.1 Gelatin
Protein yang berasal dari jaringan kolagen hewan, biasanya dari kulit dan tulang babi atau sapi. Biasa digunakan dalam industri makanan, farmasi, obat obatan (Hidayati, 2008)
5.2 Susu skim
Merupakan bagian dari susu yang krimnya diambil sebagian atau seluruhnya. Dibuat dengan cara menghilangkan sebagian lemak dan air yang terkandung di dalamnya, sehingga hanya mengandung 1 % lemak. Mengandung semua yang terkandung pada susu umumnya kecuali lemak (Hidayati, 2008)
5.3 MSG
Merupakan garam sodium dari glutamat. Komposisinya terdiri dari air 10 % dan garam natrium glutamat 78 %. Didapat dari fermentasi tebu dan pati patian. Biasa digunakan sebagai penyedap rasa dalam makanan (Hidayati, 2008)
5.4 Aspartam
C. Hasil Percobaan Dan Pengamatan : 1. Uji Ninhidrin
a. Tuliskan data hasil uji Ninhidrin No
.
Sampel Sebelum Pemanasan Sesudah Pemanasan Hasil uji 1 Susu Skim Putih susu Tetap putih susu
(-)
2 MSG Bening Berubah warnanya ungu tua
(pekat) (+)
3 Aspartam Putih, ada endapan Berubah warna menjadi ungu
muda (+)
4 Gelatin Bening, kekuningan Tetap bening kekuningan (-)
b. Bahas dan bandingkan data-data hasil uji Ninhidrin dari beberapa sampel dalam percobaan ini!
Berdasarkan data hasil pengamatan, pada sampel pertama, susu skim, warna yang teramati sebelum pemanasan adalah putih susu. Setelah dilakukan pemanasan selama 20 detik, warna yang terbentuk masih putih susu, sehingga dapat dikatakan sampel hasil uji negatif. Pada sampel MSG, sebelum pemanasan warna sampel bening, tetapi setelah pemanasan sampel berubah warna menjadi ungu tua pekat, sehingga dapat dikatakan sampel hasil uji positif. Pada sampel aspartam, sebelum pemanasan, sampel berwarna putih dan ada endapan, tetapi setelah pemanasan warna berubah menjadi ungu muda, sehingga hasil uji sampel positif. Pada sampel keempat, gelatin, warna yang teramati sebelum pemanasan adalah bening kekuningan, dan setelah pemanasan warna yang terbentuk tetap bening kekuningan, sehingga dapat dikatakan hasil uji sampel negatif.
Dalam uji ninhidrin, adanya asam amino bebas dalam sampel dapat diketahui dari terbentuknya kompleks warna ungu. Terbentuknya kompleks warna ungu ini karena adanya reaksi antara ninhidrin dengan asam amino sehingga membentuk CO2, H2O, aldehid dan
pertama, susu skim, hasil ujinya negatif. Hal ini sudah sesuai dengan literatur. Susu skim mengandung protein yang sudah agak kompleks, sehingga tidak lagi mengandung asam amino bebas (Bellitz, 2009). Oleh karena itu hasil uji pada sampel pertama menunjukkan hasil negatif.
Pada sampel kedua, MSG, hasil uji ninhidrinnya positif yang ditunjukkan dengan terbentuknya kompleks warna ungu pekat. Hasil uji yang didapat juga sudah sesuai dengan literatur. MSG hanya mengandung satu asam amino yang terkristalisasi, sehingga hasil uji sangat positif dan warna yang dihasilkan juga sangat pekat, berupa ungu tua (Bergfors, 2009). Berbeda dengan sampel ketiga, aspartam, aspartam juga menunjukkan hasil positif, namun kompleks warna ungu yang terbentuk tidak sepekat pada MSG. Hasil yang didapat juga sudah sesuai dengan literatur. Aspastam mengandung dua asam amino, sehingga hasil yang didapat positif berupa terbentuknya kompleks warna ungu, namun karena kandungan asam aminonya lebih banyak dibanding MSG, kompleks warnanya juga berupa ungu muda (Bergfors, 2009).
Pada sampel keempat, gelatin, hasil uji ninhidrinnya negatif, ditunjukkan dengan tidak adanya perubahan warna baik sebelum maupun sesudah pemanasan. Hal ini juga sudah sesuai dengan literatur. Gelatin merupakan bagian dari kolagen, salah satu jaringan ikat dalam tubuh hewan. Kolagen merupakan salah satu jenis protein kompleks, sehingga tidak mungkin mengandung asam amino bebas. Selain itu ikatan peptidanya juga kuat sehingga sulit bereaksi dengan reagen ninhidrin (Bellitz, 2009). Oleh karena itu hasil yang didapat juga negatif dengan tidak terbentuknya kompleks warna ungu.
Reaksi antara ninhidrin dan asam amino akan menghasilkan ninhidrin tereduksi, NH3,
CO2 dan gugus aldehid. Kemudian ninhidrin tereduksi dan NH3 akan bereksi dengan
2. Uji Biuret
a. Tuliskan data hasil uji Biuret No
.
Sampel Sebelum ditambah reagen Sesudah ditambah reagen Hasil uji 1 Susu skim Putih susu Terbentuk cincin ungu di
permukaan larutan (+)
2 MSG Bening Terbentuk cincin biru
sangat muda di permukaan larutan
(-)
3 Aspartam Putih, ada endapan Terbentuk cincin biru tua
di permukaan larutan (-)
4 Gelatin Bening, kekuningan Terbentuk cincin ungu di
permukaan larutan (+)
b. Bahas dan bandingkan data-data hasil uji Biuret dari beberapa sampel dalam percobaan ini! Berdasarkan data hasil pengamatan, pada sampel pertama, susu skim, warna sebelum ditambahkan reagen biuret dan setelah ditambahkan berbeda. Sebelum ditambahkan reagen biuret, sampel berwarna putih susu, namun setelah ditambahkan biuret, terbentuk cincin ungu di permukaan larutan sehingga hasil ujinya positif. Hasil uji positif akan ditunjukkan dengan terbentuknya cincin berwarna ungu, sedangkan hasil uji negatif cincinnya berwarna biru. Pada sampel kedua, MSG, sebelum ditambahkan reagen biuret, sampel berwarna bening, namun setelah ditambahkan reagen biuret, terbentuk cincin berwarna biru. Cincin berwarna biru menunjukkan hasil uji biuret negatif. Pada sampel ketiga, aspartam, sebelum ditambahkan reagen, sampel berwarna putih dan terdapat endapan. Setelah ditambahkan reagen biuret, terbentuk cincin berwarna biru tua. Cincin berwarna biru tua menunjukkan hasil uji negatif. Pada sampel keempat, gelatin, sebelum ditambahkan reagen, warna sampel bening kekuningan. Namun setelah ditambahkan reagen biuret, hasil yang ditunjukkan positif, ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada permukaan larutan.
berwarna ungu pada permukaan larutan, sedangkan sampel negatif ditunjukkan dengan cincin berwarna biru.
Pada sampel pertama, susu skim, hasil yang ditunjukkan positif, berupa terbentuknya cincin berwarna ungu. Hal ini sudah sesuai dengan literatur. Susu skim merupakan salah satu jenis protein kompleks, sehingga di dalamnya terdapat lebih dari 2 ikatan peptida. Karena memiliki lebih dari dua ikatan peptida, maka dihasilkan cincin berwarna ungu pada permukaan larutan (Sorrel, 2008). Pada sampel kedua, MSG, hasil yang ditunjukkan negatif, berupa terbentuknya cincin berwarna biru. Hal ini juga sudah sesuai dengan literatur. Pada MSG, hanya terdapat satu asam amino terkristalisasi, sehingga tidak mengandung ikatan peptida sama sekali. Karena MSG hanya mengandung satu asam amino bebas terkristalisasi, hasil yang didapat pun negatif, ditunjukkan dengan terbentuknya cincin berwarna biru pada permukaan larutan (Bergfors, 2009).
Pada sampel ketiga, aspartam, hasil yang didapat agak negatif. Hasil agak negatif itu ditunjukkan dengan terbentuknya cincin berwarna biru tua. Hasil tersebut sudah sesuai dengan literatur. Cincin yang terbentuk berwarna biru tua, hampir pekat mendekati ungu karena sebenarnya aspartam masih mengandung ikatan peptida. Namun ikatan peptida yang dimiliki aspartam masih berjumlah satu. Hasil positif uji biuret hanya ditunjukkan apabila sampel memiliki lebih dari satu ikatan peptida (Bellitz, 2009). Sehingga dapat dikatakan pada aspartam hasil yang didapat masih agak negatif.
Pada sampel keempat, gelatin, hasil yang didapat positif, ditunjukkan dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada permukaan larutan. Hasil tersebut juga sudah sesuai dengan literatur. Gelatin merupakan bagian dari kolagen, protein kompleks penyusun jaringan ikat pada hewan, sehingga ikatan peptida yang dimilikinya pasti berjumlah banyak. (Bellitz, 2009). Oleh karena itu pada gelatin hasil ujinya positif, ditunjukkan dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada permukaan larutan.
Reaksi pada uji biuret adalah adanya ion Cu2+ dalam suasana basa akan bereaksi
PEMBAHASAN 1. Uji Ninhidrin
a. Analisa Prosedur
Pada uji ninhidrin ini, alat yang dibutuhkan di antaranya tabung reaksi sebanyak 4 buah, penjepit tabung reaksi, pipet ukur, rak tabung reaksi, gelas ukur, bulb, serta label. Sedangkan bahan yang dibutuhkan adalah reagen ninhidrin dan 4 buah sampel, yaitu susu skim, aspartam, MSG, dan gelatin. Label digunakan untuk menandai sampel dan pipet agar tidak sampai tertukar, penjepit tabung reaksi untuk menjepit tabung reaksi ketika dipanaskan, rak tabung reaksi untuk tempat tabung reaksi, tabung reaksi untuk mereaksikan sampel dengan reagen ninhidrin, bulb dan pipet ukur untuk mengambil sampel dan reagen.
Langkah pertama, tandai tabung reaksi dan pipet ukur dengan label untuk sampel yang akan digunakan. Selanjutnya setelah semua sudah ditandai, ambil sampel sebanyak 2 ml dengan menggunakan pipet ukur, lalu masukkan ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 2 ml reagen ninhidrin. Untuk susu skim jangan langsung diambil dengan menggunakan pipet ukur, tetapi gunakan gelas ukur dulu dan ambil susu skim menggunakan pipet tetes. Baru kemudian pindahkan ke tabung reaksi. Langkah selanjutnya, siapkan beaker glass berisi air. Panaskan hingga mendidih. Masukkan tabung reaksi berisi reagen dan sampel ke dalam beaker glass berisi air mendidih, panaskan hingga 20 detik. Amati perubahan warna yang terjadi, lalu catat hasilnya pada tabel. Lakukan hal yang sama pada keempat sampel, lalu catat hasilnya pada tabel.
b. Analisa Hasil
Pada sampel pertama, susu skim, sebelum maupun sesudah pemanasan tidak terjadi perubahan warna. Baik sebelum maupun sesudah pemanasan, warna sampel susu skim tidak mengalami perubahan. Pada uji ninhidrin, adanya asam amino bebas dalam sampel dapat diketahui dari terbentuknya kompleks warna ungu. Terbentuknya kompleks warna ungu ini karena adanya reaksi antara ninhidrin dengan asam amino sehingga membentuk CO2, H2O, aldehid dan kompleks warna ungu. Kompleks warna
terjadi perubahan warna menjadi kompleks warna ungu sudah sesuai dengan literatur. Susu skim mengandung protein yang sudah agak kompleks, sehingga tidak lagi mengandung asam amino bebas (Bellitz, 2009).
Pada sampel kedua, terjadi perubahan warna menjadi ungu tua, yang berarti menunjukkan sampel MSG positif pada uji ninhidrin. . Hasil uji yang didapat juga sudah sesuai dengan literatur. MSG hanya mengandung satu asam amino yang terkristalisasi, sehingga hasil uji sangat positif dan warna yang dihasilkan juga sangat pekat, berupa ungu tua (Bergfors, 2009). Sebaliknya, pada sampel ketiga, meskipun menunjukkan hasil positif juga, namun perubahan warna ungunya tidak sepekat MSG. Warna ungu yang terbentuk berupa ungu pudar. Hasil yang didapat juga sudah sesuai dengan literatur. Aspastam mengandung dua asam amino, sehingga hasil yang didapat positif berupa terbentuknya kompleks warna ungu, namun karena kandungan asam aminonya lebih banyak dibanding MSG, kompleks warnanya juga berupa ungu muda. Hal ini terjadi karena lebih banyak asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin sehingga ungu yang dihasilkan semakin pudar (Bergfors, 2009).
Pada sampel keempat, gelatin, tidak terjadi perubahan warna sebelum dan sesudah pemanasan, yang berarti menunjukkan hasil negatif. Hal ini juga sudah sesuai dengan literatur. Gelatin merupakan bagian dari kolagen, salah satu jaringan ikat dalam tubuh hewan. Kolagen merupakan salah satu jenis protein kompleks, sehingga tidak mungkin mengandung asam amino bebas. Selain itu ikatan peptidanya juga kuat sehingga sulit bereaksi dengan reagen ninhidrin (Bellitz, 2009). Oleh karena itu hasil yang didapat juga negatif dengan tidak terbentuknya kompleks warna ungu.
2. Uji Biuret
a. Analisa Prosedur
Pada uji biuret ini, alat yang dibutuhkan di antaranya tabung reaksi sebanyak 4 buah, penjepit tabung reaksi, pipet ukur, rak tabung reaksi, gelas ukur, bulb, serta label. Sedangkan bahan yang dibutuhkan adalah reagen biuret berupa larutan CuSO4 5
Langkah pertama, tandai tabung reaksi dan pipet ukur dengan label untuk sampel yang akan digunakan. Selanjutnya setelah semua sudah ditandai, ambil sampel sebanyak 3 ml dengan menggunakan pipet ukur, lalu masukkan ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 1 ml larutan NaOH 10 % dengan menggunakan pipet ukur. Kocok larutan untuk menghomogenkan. Tambahkan larutan CuSO4 5 % sebanyak 5 tetes
dengan menggunakan pipet tetes. Amati perubahan yang terjadi, catat hasilnya pada tabel.
b. Analisa Hasil
Uji biuret adalah uji yang digunakan untuk menguji adanya dua/lebih ikatan peptida dalam suatu sampel. Hasil positif akan ditunjukkan dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada permukaan larutan. Hal ini terjadi karena Cu masuk dalam struktur asam amino, mengikat empat asam amino pada ikatan N-H nya dengan tangannya untuk kemudian membentuk kompleks warna ungu. Sedangkan hasil negatif akan ditunjukkan dengan terbentuknya kompleks warna biru.
Pada sampel pertama, susu skim, terbentuk cincin berwarna ungu pada permukaan atas larutan, yang menunjukkan hasil positif. Hal ini sudah sesuai dengan literatur. Susu skim merupakan salah satu jenis protein kompleks, sehingga di dalamnya terdapat lebih dari 2 ikatan peptida. Karena memiliki lebih dari dua ikatan peptida, maka dihasilkan cincin berwarna ungu pada permukaan larutan (Sorrel, 2008).
Pada sampel kedua, MSG, terbentuk cincin berwarna biru, yang menunjukkan hasil sangat negatif. . Hal ini juga sudah sesuai dengan literatur. Pada MSG, hanya terdapat satu asam amino terkristalisasi, sehingga tidak mengandung ikatan peptida sama sekali. Karena MSG hanya mengandung satu asam amino bebas terkristalisasi, hasil yang didapat pun negatif, ditunjukkan dengan terbentuknya cincin berwarna biru pada permukaan larutan (Bergfors, 2009).
PERTANYAAN
1. Bagaimana mengidentifikasi adanya gugus amino pada sampel dengan menggunakan uji Ninhidrin?
Identifikasi gugus asam amino bebas pada suatu sampel dapat dilihat dengan perubahan warna larutan sampel setelah penambahan reagen ninhidrin dan pemanasan selama kira kira 20 detik. Sampel yang mengandung gugus asam amino akan berubah warna menjadi ungu muda hingga tua, namun sampel yang negatif asam aminonya tidak akan berubah sama sekali setelah penambahan reagen ninhidrin dan pemanasan. Kompleks warna ungu terbentuk karena reaksi antara asam amino dan ninhidrin dengan hasil samping lainnya berupa H2O dan aldehid (Sato, 2012).
2. Bagaimana reaksi yang terjadi antara sampel dengan reagen pada uji Biuret?
Reaksi yang terjadi aalah ion Cu2+ pada reagen biuret dalam suasana basa akan
KESIMPULAN
Praktikum analisis kualitatif protein yang telah dilakukan bertujuan untuk mengetahui prinsip dasar uji protein dan mengetahui prinsip dari masing masing metode. Prinsip uji ninhidrin adalah menguji ada atau tidaknya protein dalam suatu sampel dengan menambahkan reagen ninhidrin untuk mengetahui jumlah kadar asam amino bebas yang terkandung di dalamnya, dimana asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk kompleks warna ungu. Prinsip uji biuret adalah menguji ada atau tidaknya protein dalam suatu sampel dengan penambahan NaOH dan CuSO4, dimana ion Cu2+ dalam pereaksi biuret
