2. Kandang hewan coba terbuat dari plastik polyvinylchlorida (PVC) dengan alas gabah kering dengan tutup kawat dan setiap kandang berisi alat untuk minum.
II. Pengawasan status kesehatan
Kebersihan kandang merupakan standar tinggi. Dinding dan lantai gedung selalu diawasi kebersihannya. Alas kandang diganti paling tidak seminggu sekali. Mencatat apabila ada yang mati.
III. Pengawasan petugas pemelihara hewan
1. Petugas pengawas/pemelihara hewan coba adalah orang yang menyukai hewan. Membatasi keluar masuknya orang ke daerah kandang.
2. Membuat jadwal kerja harian dan membuat laporan (jumlah makanan dan cairan) dan laporan berat badan tikus.
3. Mengetahui gejala penyakit, pakan, minuman hewan, hewan yang sehat, tidak mau makan, sakit atau mati.
4. Petugas pemelihara menggunakan pakaian yang bersih dan menggunakan masker serta sarung tangan ada saat bekerja di kandang hewan.
IV. Pengawasan makanan dan minuman
1. Kualitas dan kuantitas pakan dan minuman untuk semua hewan coba harus cukup. Pemberian makanan dilakukan setiap hari ad libitum.
Sampel adalah tikus Wistar jantan dewasa muda dengan berat 200-300 gram dari satu perindukan.Hewan dikandangkan dalam kandang individual ukuran 40x30x20 cm pada fasilitas perawatan hewan di laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana dengan siklus terang-gelap 12/12 jam (gelap dari jam 8 malam sampai 8 pagi dan terang dari jam 8 pagi sampai jam 8 malam). Hewan diberikan akses bebas ke makanannya dan air. Tikus dibiarkan dalam keadaan ini selama 1 minggu sebelum dilakukan operasi pembuatan model cedera saraf tepi. Jumlah seluruh tikus yang digunakan berdasarkan rumus besar sampel adalah sebanyak 36 ekor tikus.
4.7.2 Prosedur Pembuatan ekstrak air umbi ubi jalar ungu
Ekstrak air umbi ubi jalar ungu dikerjakan di Laboratorium Teknologi Hasil Pertanian Universitas Udayana. Ekstrak dibuat dengan prosedur sebagai berikut: Ubi jalar ungu segar yang didapat dari petani dicuci sampai bersih kemudian dikupas kulitnya. Ubi jalar ungu dipotong melintang dengan ketebalan 2-2,5 cm. Potongan ubi jalar tersebut dicampur dengan air bersih dengan perbandingan 1 kg ubi jalar ditambah 1 liter air, kemudian dibelender dan disaring dengan 3 lapis kain kasa. Cairan yang diperoleh dari penyaringan tersebut dipanaskan hingga mendidih selama 30 menit untuk sterilisasi. sesuai dengan surat nomor: 145/AN/Lab/FTP/XII/2015. Kandungan antosianin dari bahan ini adalah 140,23-147,0 mg/ml yang diuji dengan metode spektofotometer (Suprapta, 2004).
Dalam penelitian ini menggunakan ekstrak ubi jalar ungu dengan kandungan antosianin dosis 400mg/kgBB/hari yang diberikan segera setelah operasi (Tall et al., 2004).
4.7.3 Prosedur Pembuatan Model Cedera Saraf Tepi
Penelitian ini menggunakan model CCI. Prosedur operasi dimulai dengan mencukur bulu tikus di daerah lumbal hingga bersih, dibersihkan dengan kapas dan larutan deterjen, diolesi alkohol 70%, kemudian diolesi povidon iodine secukupnya.
Insisi dilakukan longitudinal sejajar dengan vertebra sepanjang 1,5 cm yang dibuat 0,5 cm di bawah pelvis. Muskulus biceps femoris dan gluteus superficialis dipisahkan, tampak nervus iskhiadikus, selanjutnya dilakukan isolasi dan ligasi sebanyak 4 buah menggunakan benang 4–0 chromic catgut, masing-masing ligasi dipisahkan dengan jarak 1mm. Selanjutnya luka ditutup lapis demi lapis sampai kulit. Kulit disteples menggunakan steples kulit untuk mencegah terbukanya kulit akibat digigit tikus (Gambar 4.3).
Dioleskan antibiotika topikal untuk mencegah infeksi pada luka operasi.
Perilaku alodinia, hiperalgesia dan nyeri spontan akan muncul setelah 10-14 hari pasca pembedahan (Bennett and Xie, 1988; Bridges et al., 2001; Hogan, 2002;
Wang and Wang, 2003; Austin et al.,2012).
Gambar 4.3
Ilustrasi posisi ligasi pada model CCI (Austin et al., 2012)
4.7.4 Prosedur randomisasi
Setelah pembuatan model CCI, seluruh hewan coba (36 ekor) dimasukkan ke dalam kandang. Dilakukan randomisasi secara sederhana (simple random sampling) yaitu dengan mengambil secara acak hewan coba satu persatu dengan mata tertutup yang dimasukkan dalam kandang yang baru sebagai kelompok perlakuan sampai tercapai sejumlah 18 ekor. Sedangkan sisa 18 hewan coba dalam kandang sebelumnya sebagai kelompok kontrol.
4.7.5 Prosedur Penilaian Perilaku Nyeri Neuropatik
Perilaku nyeri neuropatik dinilai berdasarkan penilaian alodinia taktil, hiperalgesia panas dan alodinia dingin. Penilaian dilakukan sebelum operasi, hari ke 1,7,14,21 dan 28 pasca CCI.
a. Penilaian alodinia mekanik dengan cara hewan coba diletakkan dalam kotak fleksiglas ukuran 20x20x40 cm dengan lantai kawat. Diberikan waktu selama 15 menit untuk adaptasi dan grooming. Setelah itu dilakukan penilaian alodinia mekanik dengan monofilament von frey ukuran 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 15.0 dan 26.0 gram. Filamen diaplikasikan secara vertikal pada permukaan plantar hewan coba dari ukuran terkecil sampai terbesar sampai gerakan menarik kaki yang cepat teramati. Hasil dikatakan positif bila terjadi penarikan kaki.
Pemeriksaan diulang sebanyak 5 kali untuk setiap filament dengan interval 2-3 detik. Ambang batas kekuatan dinyatakan positif jika hewan memberi respon 3 kali dari 5 kali pemeriksaan (paw withdrawal tereshold). Untuk mencegah cedera, ukuran 60 gram dinyatakan sebagai batasnya (Amin & Hosseinzadeh, 2012). Dicatat ukuran monofilamen terkecil sebagai ambang penarikan kaki.
b. Penilaian hiperalgesia panas (Hot Plate Test) menggunakan lempeng panas dengan suhu 51± 0,5°C. Hewan diletakkan di atas lempeng yang telah dikontrol suhunya dan dicatat waktu pertama kali menunjukkan respon penarikan kaki belakang(paw withdrawal latency). Nilai batas waktu yang dipergunakan untuk pengamatan adalah selama 20 detik untuk mencegah kerusakan jaringan (Bhardwaj et al., 2016).
c. Penilaian alodinia dingin menggunakan metode tetes aseton. Kaki belakang hewan coba disemprot dengan 0,1ml cairan aseton dengan bantuan spuit plastik.
Pada tikus normal akan terjadi pengabaian stimulus atau kadang terjadi respon berupa penarikan singkat dan kecil pada kaki belakang. Respon abnormal berupa menjilat, gemetar atau menggosok kaki belakang diamati dan dicatat sebagai durasi angkat kaki (paw withdrawal latency). Nilai batas waktu yang dipergunakan untuk pengamatan adalah selama 20 detik untuk mencegah kerusakan jaringan (Bhardwaj et al., 2016).
4.7.6 Prosedur euthanasia
Sebelum pengambilan darah, saraf tepi yang diligasi dan medula spinalis segmen L4-6 dilakukan proses euthanasia dengan disuntik pentobarbital dosis letal yaitu 100mg/kgBB secara ip.
4.7.7 Prosedur penilaian kadar MDA, PGE2 dan ekspresi reseptor P2X4
Pemeriksaan MDA darah menggunakan metode TBARS (secara lengkap dapat dilihat pada lampiran 7). Pengukuran konsentrasi PGE2 menggunakan metode ELISA (secara lengkap dapat dilihat pada lampiran 8). Penilaian ekspresi
reseptor P2X4 mikroglia menggunakan metode imunofloresen (secara lengkap dapat dilihat pada lampiran 9).