4.5.1 Identifikasi variabel penelitian adalah karakteristik sampel penelitian yang diukur secara numerik atau katagorik, variabel tersebut ditentukan sesuai rancangan penelitian yang direncanakan.
4.5.2 Klasifikasi variabel penelitian
a. Variabel bebas : pemberian ekstrak air umbi ubijalar ungu dengan kandungan antosianin 400 mg/Kgbb/hari
b. Variabel tergantung : kadar MDA, PGE2, ekspresi reseptor P2X4 mikroglia dan perilaku nyeri neuropatik
c. Variabel kendali : umur, galur, berat badan, jenis kelamin, makanan dan kondisi kandang
4.5.3 Hubungan antar Variabel
Gambar 4.2
Hubungan antar variabel penelitian
4.5.4 Definisi Operasional Variabel
a. Tikus Wistar adalah salah satu strain tikus yang banyak digunakan pada penelitian eksperimental dengan ciri kepala besar dengan ekor yang lebih pendek dari badannya (Malole & Pramono, 1989).
b. Jenis kelamin adalah fenotip kelamin tikus yang ditentukan oleh dokter hewan yang pada penelitian ini menggunakan jenis kelamin jantan.
c. Umur tikus adalah umur kronologis yang ditetapkan dalam minggu yang diukur sejak saat kelahiran tikus
d. Berat tikus adalah berat tikus dalam gram yang diukur dengan timbangan khusus merek Shunle yang tersedia di Laboratorium Farmakologi FK UNUD.
e. Status kesehatan tikus adalah tikus yang dinyatakan sehat oleh dokter hewan Variabel kendali
• Umur
• Galur
• Berat badan
• Jenis kelamin
• Makanan dan kondisi kandang
Variabel tergantung
• Kadar MDA serum
• Kadar PGE2 saraf tepi
• Ekspresi reseptor P2X4 mikroglia
• Perilaku nyeri neuropatik
•
Variabel bebas
Pemberian ekstrak air umbi ubi jalar ungu dengan kandungan antosianin 400 mg/kgBB/hari
f. Makanan adalah makanan campuran khusus yang telah disediakan/ dianjurkan oleh dokter hewan dan ditempatkan pada tempat yang sama dengan jumlah yang sama pada setiap kelompok. Campuran makanan yang disiapkan terdiri dari protein 20-25%, Karbohidrat 45-55% , lemak 10-12% dan serat kasar 4%.
g. Kondisi kandang adalah suasana kandang yang dibuat agar tidak menimbulkan stress terhadap binatang coba, tiap kelompok ditempatkan pada kandang yang sama, luas yang cukup dan cahaya yang tidak terang sehingga tidak terjadi hipertermia dan stres karena ketakutan.
h. Cedera saraf tepi adalah tindakan operatif menggunakan model CCI yang merupakan model untuk nyeri inflamasi dan nyeri neuropatik. Tindakan berupa 4 buah ligasi/ikatan longgar pada saraf iskiadikus menggunakan benang 4–0 chromic catgut dengan masing-masing berjarak 1mm (secara lengkap dapat dilihat pada prosedur penelitian).
i. Ekstrak air umbi ubi jalar ungu adalah ekstrak yang berasal dari umbi ubi jalar ungu (Ipomoea batas L) yang dikerjakan di Laboratorium Teknologi Hasil Pertanian Fakultas Pertanian Universitas Udayana yang memiliki kandungan senyawa antioksidan tinggi yaitu antosianin. Pada penelitian ini diberikan perlakuan ekstrak air umbi ubi jalar ungu dengan kandungan antosianin400mg/kgBB/hari (Tall et al., 2004) segera setelah tindakan operatif pembuatan model cedera saraf. (secara lengkap prosedur pembuatan dapat dilihat pada prosedur penelitian).
j. Kadar MDA adalah kadar produk akhir reaksi peroksidasi lipid. Pemeriksaan MDA dilakukan pada hari ke-29 setelah operasi pada cairan serum dengan
metode 2-ThioBarbituric Acid Reactive Substances (TBARS). Kadar MDA dalam satuan µMol (Secara lengkap dapat dilihat pada lampiran 7). Data berskala numerik.
k. Kadar PGE2 adalah sebuah produk COX, merupakan mediator lipid yang berperanan pada nyeri inflamasi (Kabawata, 2011). Pemeriksaan dilakukan pada hari ke-29. Bahan pemeriksaan dari saraf tepi yang diligasi, diperiksa dengan metode ELISA. Kadar PGE2 dalam satuan pg/mg (secara lengkap dapat dilihat pada lampiran 8). Data berskala numerik
l. Ekspresi reseptor P2X4 adalah ekspresi protein reseptor P2X4 yang dideteksi menggunakan monoklonal antibodi anti-reseptor P2X4 pada fraksi membran dari medula spinalis L4,5,6 ipsilateral melalui pemeriksaan imunofloresen.
Dihitung jumlah ekspresi reseptor P2X4 mikroglia per lapang pandang (lp) pada pembesaran 400x (secara lengkap dapat dilihat pada lampiran 9). Data berskala numerik.
m. Perilaku nyeri neuropatik adalah nyeri yang dinilai berdasarkan adanya perilaku nyeri neuropatik yaitu alodinia mekanik, hiperalgesia panas dan alodinia dingin. Alodinia mekanik dievaluasi menggunakan uji filamen von Frey. Hiperalgesia panas dengan uji plat panas dan alodinia dingin menggunakan tes aseton. Penilaian dilakukan pada kaki yang mengalami CCI.
Dicatat ukuran kekuatan filamen yang memberikan respon penarikan dalam satuan gram. Dicatat waktu penarikan saat diberikan stimulus panas dan dingin dengan satuan detik. Dilakukan penilaian pada saat sebelum operasi, hari 1,7,14,21 dan 28 setelah operasi. Data berskala numerik.
4.6 Alat dan Bahan Penelitian 4.6.1 Alat penelitian
Alat-alat yang dipergunakan dalam penelitian ini antara lain: Kandang hewan percobaan individual ukuran 20x20x40cm, 1 set peralatan operasi untuk hewan, pisau bedah, alat pencukur bulu, disposable syringe 1,5,10 cc, meja operasi untuk tikus, stapler jaringan merk Manipler (Jepang), sarung tangan steril, pot jaringan, staining jar, digital timer, filamen von Frey merk aesthesio (Bioseb, Prancis), lampu kepala, kasa steril, plate panas merk Fisher Scientific, cairan aseton, mikropipet, tape, gelas ukur, elisa reader, mikrosentrifus, bak air, mikroskop immunofloresen merk olympus BX51 serta alat-alat lain yang mendukung berlangsungnya penelitian ini.
4.6.2 Bahan penelitian
Bahan penelitian yang dipergunakan dalam penelitian ini antara lain: Tiga puluh enam ekor tikus Wistar jantan umur 2 bulan dengan berat rata rata 200–300g, ekstrak air umbi ubi jalar ungu yang mengandung antosianin 140mg/ml, anestetikum natrium phentobarbital, Catgut chromic 4-0 merk Ethicon, antiseptika povidon iodine, antibiotika topikal, larutan salin 0,9% steril, larutan formalin 10%, Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4, larutan xylene, ethanol absolut, ethanol 95%, ethanol 80%, ethanol 70%, ethanol 50%, metanol, Hidrogen peroksida absolut, akuadestilata. antibodi poliklonal anti-rat P2X4R (1:200; Oncogene).
TBARS kit (QUANTICHROMTM TBARS ASSAY KIT (DTBA-100) dari Bioassay System, USA), Solusi asam 10% dalam Dimethylsulfida, 10 nM Garam
Malonaldehyde Tertabuthlammonium, Set Spectotrophotometer 532 nm (540 nm juga dapat digunakan), gelas tabung penguji, air deionisasi (dH2O), Mikropippete yang dapat diatur (10 – 1,000 µL) dan tip, mangkok spectotrophotometrik (volume 0.5 mL atau 1 mL).
PGE2 High Sensitivity Immunoassay kit (Prostaglandin E2 Elisa Kit Cat.
No E0504Ra dari Bioassay Technology Laboratory, Shanghai, China), pengukur lempeng mikro yang mampu membaca penyerapan 405nm dengan koreksi panjang gelombang diatur antara 570nm dan 590 nm, Pipet dan ujung pipet, 1000ml silinder ukur untuk persiapan Buffer Cuci, , botol semprot atau dispenser manifold, inkubator 37°C.
Monoklonal antibodi anti-reseptor P2X4 (anti-P2X4 reseptor, 1:100, LS Bio), FBS 5% (Sigma Aldrich, USA), Fluoroshield with DAPI (Abcam, USA), Citrate buffer 1x, PBS, PBST 1X, Aquades, Alkohol 70%, 80%, 90%, 100%, Xylen, Tip biru, putih, kuning, Parafilm dan Tissue.
Prosedur awal.
Tikus sebagai hewan coba cedera saraf tepi. Persiapan membuat hewan coba (animal model) dan pengawasan yang diperlukan, modifikasi dari Muliarta dan Mulyohadi (Pinatih, 2011).
I. Persiapan lingkungan, lokasi tempat pemeliharaan dan kandang hewan coba 1. Ruangan pemeliharaan mempunyai dinding yang kedap air, ventilasi, suhu
dan kelembaban yang cukup baik, tahan air dan mudah untuk dibersihkan.
2. Kandang hewan coba terbuat dari plastik polyvinylchlorida (PVC) dengan alas gabah kering dengan tutup kawat dan setiap kandang berisi alat untuk minum.
II. Pengawasan status kesehatan
Kebersihan kandang merupakan standar tinggi. Dinding dan lantai gedung selalu diawasi kebersihannya. Alas kandang diganti paling tidak seminggu sekali. Mencatat apabila ada yang mati.
III. Pengawasan petugas pemelihara hewan
1. Petugas pengawas/pemelihara hewan coba adalah orang yang menyukai hewan. Membatasi keluar masuknya orang ke daerah kandang.
2. Membuat jadwal kerja harian dan membuat laporan (jumlah makanan dan cairan) dan laporan berat badan tikus.
3. Mengetahui gejala penyakit, pakan, minuman hewan, hewan yang sehat, tidak mau makan, sakit atau mati.
4. Petugas pemelihara menggunakan pakaian yang bersih dan menggunakan masker serta sarung tangan ada saat bekerja di kandang hewan.
IV. Pengawasan makanan dan minuman
1. Kualitas dan kuantitas pakan dan minuman untuk semua hewan coba harus cukup. Pemberian makanan dilakukan setiap hari ad libitum.