【解説】
フォルミンファミリーは，真核生物に広く保存されたアクチ ン重合促進因子であり，アクチン線維の速い重合端に結合し たままプロセッシブ（連続的）にアクチンを伸長する性質を もつことが，われわれの蛍光単分子イメージングなどによっ て解明されてきた．最近，われわれは単分子蛍光偏光観察に よって，フォルミンファミリーがアクチン線維のらせん構造 に沿って回転しながらアクチンを伸長することを証明した．
また，フォルミンファミリーのもつ著明なアクチン伸長加速 活性に，アクチンに結合したATPが重要な役割を果たすこ とが付随的に見いだされた．
フォルミンファミリーは，細胞質分裂や細胞極性，ア クチンストレス線維形成に必要なアクチン線維を供給す るアクチン重合促進因子（1, 2）である．真核細胞に広く存 在し，ヒトでは約15個，シロイヌナズナで約20個の遺 伝子にコードされる（3, 4）
．これらの分子群は，C末端側
にFH1‒FH2ユニット構造というファミリー独特のドメ イン構造を共有する．FH2ドメインは，リング状のホモダイマーを形成し，単量体アクチン（Gアクチン）か ら線維核が形成される重合核形成のステップを加速す る．そして，アクチン線維（Fアクチン）の速い重合端
（barbed end : B端）に連続的に結合しながら，プロ セッシブに線維を伸ばすユニークな性質をもつ（5, 6）
．一
方，FH1ドメインは，アクチン単量体結合タンパク質 プロフィリンに結合するポリプロリンモチーフを繰り返 し有しており，アクチン伸長速度を加速する作用をも つ（7）．通常のアクチン伸長は，Gアクチンが自由拡散し
ながら線維末端に衝突する頻度が律速となって進むこと が知られている（8, 9）．ところがフォルミンファミリーが
結合したアクチンでは，さらにその5 〜 10倍の速さで 線維が伸長するといった理論的限界を超えた速度での分 子アッセンブリーを実現することが知られている．それ を可能とするのは，FH1ドメインが複数のプロフィリ ンアクチン複合体と結合することで，アッセンブリー可 能なGアクチンを増やす機構（局所集積メカニズム）で あると提唱されている（10）．実際，以前のわれわれの研
究（5）でも，フォルミンファミリーの一つで低分子量Gタ ンパク質RhoのエフェクターであるmDia1が，アクチ ン線維のB端に結合したまま毎秒720個ものアクチン分フォルミンタンパク質のアクチン 二重らせんに沿った回転重合
渡邊直樹，水野裕昭
Rotational Polymerization of Formin Homology Proteins along the Actin Double Helix
Naoki WATANABE, Hiroaki MIZUNO, 東北大学大学院生命科学 研究科
子を次々と取り込み，線維を伸長させながら移動する姿 が細胞内で分子可視化されている．また，植物のフォル ミンファミリーのような例外はあるものの（3）
，プロセッ
シビティーが高く，細胞内で数十ミクロン以上，でも数千サブユニットのアクチン線維を連続的に 伸長することができる．
この高いプロセッシビティーを伴う分子移動の性質か ら，フォルミンファミリーは，細胞構造にアンカーする ことで，アクチン重合の力を細胞小器官の運搬や細胞変 形のための力へと変換する性質をもつことが想定されて きた．一方で，アクチン線維は72ナノメートルで1回転 する二重らせん構造（ロングピッチらせん）（11） をもつ ことから，フォルミンファミリーは回転しながらアクチ ンを伸長させることが予測される．このらせん回転は，
「もの」を運搬したり，重合する線維端を「アンカーす る」といった想定された機能とは干渉する可能性があ り，フォルミンファミリーの機能を推測するうえで重要 な未解決問題であった．
単分子蛍光偏光によるらせん回転アクチン重合の可 視化
らせん回転を検証するために，ガラス上に固定した mDia1から伸長するアクチン線維を低密度のテトラメ チルローダミン （TMR） で標識し，TMR 1分子の蛍光
偏光を高感度顕微鏡で観察した（12） （図
1
）．Cys-374が修
飾されたTMR標識アクチンは，線維軸から45度の方向 に偏光した蛍光を発する（13）．よって，視野に斜めに横
たわるアクチン線維が回転すると，TMR分子から出る 蛍光の偏光成分が縦から横，さらに縦へと変化する．そ のためプロセッシブ重合中の線維内の単分子蛍光偏光の 変動よりらせん回転の有無や周期を検出することができ る．蛍光スポットの移動距離との偏光の変動の回数の比較 から， およそ36ナノメートル伸長するごとに偏光が縦 から横，あるいは，横から縦に切り替わることを確認し た．この距離はアクチン線維構造のらせん周期に一致し ており，mDia1がらせん回転の性質をもつことが示され た（12） （図
2
）．
以前の論文で，酵母のフォルミンファミリー Bni1pと ア ク チ ン 線 維 の 反 対 側 に あ た る 矢 じ り 端（pointed end : P端）の両側をガラス面に固着したまま，プロ セッシブにアクチンを伸長させると，線維がDNA状の スーパーコイルを形成することなく，大きく弧を描きな がら伸長すること（バックリングと呼ぶ）が観察され た（14）
．このことよりKovarとPollardは，
フォルミン ファミリーがアクチン線維軸周りをベアリングのように 滑り回転すると提唱した．これはらせん回転の所見と矛 盾 す る．わ れ わ れ は，こ の 矛 盾 を 解 く た め にGST- 図1■単分子蛍光偏光観察によるら せん回転可視化（12）の原理リコンビナントmDia1は抗体を用い てガラス上に固相化され，そこから プロセッシブに伸長するアクチン線 維を蛍光顕微鏡下で観察した．線維 には低頻度でCys-374がテトラメチル ローダミン （TMR） で標識されたア クチンが取り込まれるようにした．
この標識アクチンは，線維軸に対し 45度に偏光した蛍光を発する（13）．斜 め方向に伸長する線維の標識アクチ ン1分子からの蛍光を偏光ビームス プリッターを用い縦と横方向の成分 に分離することで，らせん回転重合 を可視化した．文献12より改変．
mDia1 FH1‒FH2を非特異的にガラス面に吸着させた場 合と，抗GST抗体と2次抗体によってタンパク質凝集 体中に固定した場合の比較を行った．その結果，前者の ほうがバックリングしながら線維が伸長し続ける頻度が 高く，後者ではわずかにたわんだのちに線維伸長が止ま ることが多く観察された．これらの所見から，前者のよ うに固定が弱い場合はより多い頻度でガラス面とフォル ミンファミリーの間が滑り，バックリングを伴って線維 の伸長が可能になったと推測できる．われわれは，フォ ルミンファミリーが忠実にアクチンのロングピッチに 沿ってらせん回転しながらアクチンを伸長させると結論 した．また，重要なことに，後者の条件で線維伸長が早 期に停止した所見は，軸トルクの負荷が増えるとプロ セッシブな線維伸長が停止することを意味しており，線 維やフォルミンファミリーの動きの自由度が変わること でアクチン重合が変化する細胞骨格の新しい物理制御メ カニズムが示唆される．
アクチンに結合したATPの重要な役割
ADP-Gアクチンによって線維が伸長する場合やプロ フィリン存在下でもらせん回転は観察された．さらに，
アクチン単量体を除くことで固定されたmDia1に向 かって線維が短縮する状態，つまりプロセッシブな脱重 合が初めて可視化された．このときもらせん回転が観察 された．蛍光偏光の入れ替わりは，どの条件下において も約36ナノメートルの周期で起きることから，フォル ミンファミリーは忠実にアクチン線維のロングピッチの らせん構造に沿って，回転しながら線維を伸長すること が判明した（12）
．
このようにらせん回転の問題は決着がついたが，それ
に加えてアクチン伸長加速におけるATPの重要性も明 らかになった．以前から報告されているように，プロ フィリン存在下でmDia1は，ATP-GアクチンのB端へ の結合速度を加速し，線維伸長を著明に加速する．しか し，われわれは，ADP-Gアクチン存在下では，プロ フィリンはmDia1が結合した重合中のB端へのADPア クチンの結合速度はそのままに解離速度を加速する，と いった逆の効果をもつことを見いだした（図
3
）．原
著（12）を見ていただきたいが，まず，プロフィリンが8 倍程度ADP-Fアクチンのプロセッシブ脱重合を加速す ることを見いだした．B端からの脱重合の加速は，通常 のアクチン線維でも40μ
Mの高濃度のプロフィリンがあ れば観察されるが，mDia1が結合しているB端では，5
μ
Mのプロフィリンで最大の脱重合促進作用が得られ た（図3B）．重要なことに，ADP-Gアクチンが溶液中
に存在し，線維が伸長する際にもmDia1とプロフィリ ンがB端からのアクチン解離を加速するのであるが，そ れを以下のように証明した．まず，プロセッシブに脱重合するmDia1が結合した ADP-Fアクチンに無機リン酸 （Pi） を加えるとプロフィ リンによる脱重合促進作用が消失した．通常の重合反応 において，アクチンに結合したATPは重合後速やかに 水解されADP・Piとなり，ADPは溶液中のものと交換 しないが，Piのみ数百秒の間に線維から放出される．Pi は，線維内のサブユニットに可逆的に結合・解離でき，
外から溶液中に加えるとB端からのADP-Fアクチンの 脱重合をほぼ消失させる（15）
．このPiのもつADPアクチ
ンの解離阻害作用がmDia1の結合したB端でも同様に 働くことが判明した（図3C下）．
一方，mDia1と結合するB端にADP-Gアクチンが重 合して線維が伸長する際にプロフィリンを添加すると，
図2■mDia1からプロセッシブに伸 長する線維内のTMR標識アクチン 1分子の蛍光偏光の変動
上は，TMRアクチン1分子の蛍光偏 光を縦方向 （FLV） と横方向 （FLH） の成分に分離しとらえた画像．下は，
偏光の比率の変動（Polarization）と分 子の移動距離（Displacement）を示す．
約36ナノメーターごとに偏光の向き が変わるのがとらえられている．文 献12より改変．スケールバーは1 μ m．
伸長速度が低下することが判明した．そこにPiを添加 すると，その低下が消失し，プロフィリンを加える前の 速度まで回復した（図3A）
．ADPアクチンに対するプ
ロフィリンの作用を消失させるPiの効果についてその 濃度依存性を計測したところ，脱重合アッセイにおける 解離促進作用の阻害効果においても，重合アッセイにお ける重合速度低下の回復効果においてもほぼ同じPiの 濃度で同程度の効果をもつことが確認された（図3C 上）．これらの結果より，
プロフィリンはmDia1が結合 したB端からのADPアクチンの解離を，脱重合中も重 合中も同様に促進すると判断できる．われわれの結果 は，フォルミンファミリーによるアクチン伸長の加速に はATPが必須であることを示しており，ATPの果たす 役割の重要性を再認識させるものであった．重要なことに，ADP-Gアクチンの伸長速度をもとに 計算すると，プロフィリンと結合したADP-Gアクチン のmDia1が 結 合 し たB端 へ のon-rateは，フ リ ー の ADP-Gアクチンのそれとほぼ変わらないことが計算上 予測される（16）
．上述したように，ATPアクチンの伸長
時にはフォルミンファミリーを介する場合，5 〜 10倍 on-rateが加速される．現在のところ，FH1ドメインが 複数のプロフィリン‒アクチン複合体に結合しB端近傍にとどめることで，拡散限界を超えたon-rateを実現す るという局所集積メカニズム（10） が，数理モデルと詳細 な生化学実験（7） の結果から提唱されている．ところが，
われわれの結果からは，FH1ドメインとプロフィリン，
ADPアクチン間の親和性など未確定なパラメーターが 残されてはいるものの，計測された範囲では局所集積メ カニズムがADPアクチンに対しては働かないように見 える．ATPの水解のエネルギーがどこのステップに作 用し，フォルミンファミリーによる顕著なB端の伸長加 速を可能にしているのかは，アクチン線維のターンオー バー全般におけるATP水解の役割に直結している可能 性もあり，その解明は，アクチンATPaseの役割を解く 重要な鍵を与えるかもしれない（16）
．
細胞の中で予想されるらせん回転の働き
上述したように，ガラス表面にトラップされたフォル ミンから伸びるアクチン線維は回転しながら伸長する が，P 端側で線維がガラス表面にトラップされるとプロ セッシブな重合は速やかに停止する．細胞内において は，Fアクチンと共重合した蛍光標識アクチンを単分子 可視化するスペックル顕微鏡によって，Fアクチンが流 図3■ADPアクチンの重合時には，
mDia1とプロフィリンはむしろB
端からの解離速度を上昇させる
（A） ADP-Gア ク チ ン5 μMに よ る mDia1によるプロセッシブ重合時の アクチン伸長速度．ATPアクチンを 用いたときの著明な伸長速度の促進 とは対照的に，プロフィリンはADP アクチンの伸長速度を下げる（緑の カラム）．この作用は，無機リン酸
（Pi） の添加で消失し，速度が回復す る（青のカラム）．（B） 単量体アクチ ンを除いた場合のmDia1が結合した B端からのADP-Fアクチンの脱重合 速度．プロフィリンが脱重合を低濃 度で加速することが明らかとなった．
（C） 上は，A同様に 5 μM ADP-G ア クチンによるmDia1が結合したB端 の伸長，下は，B同様に単量体アク チン非存在下でのmDia1結合端から の脱重合速度．両方とも5 μMのプロ フィリンが存在する．Piはいずれの 条件においても線維を伸長させる側 に傾け，その用量依存性と効果も類 似していた．文献12より改変．
動する方向は非常にそろっていることが観察されてい る（17）
．このことからわかるように，細胞内のアクチン
線維は高度にクロスリンクされている．したがって，細 胞内でプロセッシブにアクチンを伸長させる際は，Fア クチンでなくフォルミンが回転するはずである（図4
）．
たとえば，mDiaはアイソフォームによって，N末領域 にてRho以外にも，Liprinα
（18） やanillin（19）と結合し，分裂酵母のフォルミンであるfor3pは，tea1pやbud6p に細胞端で結合しながらアクチンケーブルをプロセッシ ブに伸長する（20）
．伸長をつづけるアクチン線維を細胞
膜にアンカーするような機能をフォルミンがもつために は，細胞膜にはフレキシブルに固定されなければならな い．また，上に述べたようにフォルミンが自由に動ける かを制御することでアクチン伸長速度が制御できるのか もしれない．反対に，らせん回転によってねじられることで，アク
チン線維構造に影響が及ぶ可能性がある．フォルミン ファミリーと線維の遠位端であるP端側が細胞構造にト ラップされたままプロセッシブなアクチン伸長がつづい た場合，アクチン線維にはロングピッチらせんを緩める 方向にトルクがかかる．一方，アクチンの主要な脱重合 因子であるコフィリンが結合したアクチンではこのねじ れが大きく増強される（21）
．よって，フォルミンファミ
リーによるらせん回転重合の力がコフィリンによる脱重 合機構と干渉することで，アクチン線維の安定性を変化 させていることも考えられる．これららせん回転から予 想される性質は，フォルミンファミリーが介在し形成さ れるアクチンストレス線維や細胞質分裂時の収縮環の形 成・崩壊の制御に密接につながっている可能性があり，興味がもたれるところである．
現在までに， でmDia1によって重合されたア クチン線維は，mDia1が結合するB端から離れた部位に おいても長い区間にわたり立体構造上の影響を受けるこ とが，アクチンのCys-374に結合した標識のFRET（22）
，
蛍光異方性（23），電子スピン共鳴
（24）の変化から報告され ている．ただし，これらは溶液中での観察であり，アク チンやmDia1は特に構造に固定されていない条件下で 行われている．また，mDia1を含む試料ではアクチン線 維の密度や線維長が大きく異なり，それらの影響を間接 的に観察した可能性も否定されておらず，報告された mDia1の効果はらせん回転によってもたらされたもの ではないことも考えられる．フォルミンファミリーのら せん回転重合の役割を解明するためには，細胞内・細胞 外で綿密な実験系を再構築したうえで検証を進めること が重要であろう．文献
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図4■フォルミンファミリーのらせん回転重合の細胞内での役 割
アクチン線維は細胞内で高度にクロスリンクされているため，プ ロセッシブ重合中のフォルミンファミリーはロングピッチらせん に沿って回転している （i）．フォルミンファミリーが制御分子と 結合し，細胞膜などにアンカーされた場合 （ii），アクチン伸長速 度とともに，アクチン線維の安定性に影響がでる可能性がある．
抗体でクロスリンクしたリコンビナントmDia1から伸びる線維が P端側でトラップされたのち，しばしば大きくバックリングする 前に伸長が止まることから，フォルミンファミリーがどれだけ強 固に細胞構造にアンカーされるかによって，アクチン伸長速度が 制御されるようなメカニズムが想像される．逆に，らせん重合の ねじれの力が線維に働き，アクチンの安定性を左右することも考 えられる．プロセッシブにアクチン重合を続けるフォルミンファ ミリーを固定すると，ロングピッチらせんが緩む方向に線維軸周 りのトルクが発生する．これはアクチン脱重合因子コフィリンの 結合によってアクチン線維のねじれる方向とは逆である．らせん 回転を介してフォルミンファミリーは線維を脱重合から守るのか もしれない．
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宮武 和孝（Kazutaka Miyatake） ＜略 歴＞1975年大阪府立大学大学院農学研究 科博士課程農芸化学専攻単位取得退学／同 年大阪府立大学農学部助手講師，助教授を 経て，1997年大阪府立大学教授／2011年 大阪府立大学教授定年退官，同大学名誉教 授／同年大阪府立大学地域連携研究機構客 員教授／2012年帝塚山学院大学教授＜現 在の研究テーマと抱負＞過熱水蒸気による 分子調理，加熱反応による有効成分の化学 変化，バイオコンバージョンによる有用物 質生産，有機栽培野菜の化学成分変化＜興 味をもっていること＞資源の高付加価値 化，生物産業の創成＜趣味＞メタボ解消の ためソフトボールを楽しむこと，調理を楽 しむこと
山下 倫明（Michiaki Yamashita） ＜略 歴＞1985年京都大学農学部水産学科卒 業／水産庁東海区水産研究所研究員，中央
水産研究所研究員，同主任研究官，研究室 長を経て，現在，水産総合研究センター中 央水産研究所水産物応用開発研究センター 安全性評価グループ長．京都大学博士（農 学）＜研究テーマと抱負＞魚介類の生化学 と遺伝子工学，特に魚食由来セレンの生合 成経路とがん予防効果を解明すること＜趣 味＞釣り
山下由美子（Yumiko Yamashita） ＜略 歴＞1986年埼玉大学大学院理学研究科化 学専攻修了／水産総合研究センター中央水 産研究所水産物応用開発研究センター主任 研究員．東京大学博士（農学）＜研究テー マと抱負＞微量元素の化学，セレノネイン の抗酸化能と解毒作用，アンチエイジング
＜趣味＞コーラス
吉澤 和徳（Kazunori Yoshizawa） ＜略 歴＞1994年九州大学農学部農学科卒業／
九州大学大学院比較社会文化研究科修了．
博士（理学）／日本学術振興会特別研究員
（DC1, PD） 北海道大学農学部助手，助教 を経て現在准教授＜研究テーマと抱負＞昆 虫の高次系統，機能形態，シラミの進化な ど＜趣味＞各地のビール飲み歩き（学会参 加などでは，学会の準備より先にビールの 検索をする）
渡邊 直樹（Naoki Watanabe） ＜略歴＞
1990年京都大学医学部卒業／1998年京都 大学医学研究科神経・細胞薬理学助手／
1999年ハーバード大学医学部研究員／
2002年京都大学医学研究科助教授（2007 年より准教授）／2010年東北大学大学院生 命科学研究科教授（単分子動態生物学分 野）＜研究テーマと抱負＞細胞内分子イ メージングによるアクチン細胞骨格制御と 細胞シグナルの解明．分子標的薬作用の可 視化解析＜趣味＞ギター
