C. Metode Penelitian
3. Identifikasi dan Karakterisasi Senyawa Aktif Ekstrak Biji Kamandrah Sebagai Bahan Laksatif
a. Penentuan Kandungan Fitokimia.
Penentuan kandungan fitokimia pada bagian biji tanaman kamandrah dilakukan untuk mengetahui kandungan aktif yang terdapat dalam ekstrak heksana dan etanol, menggunakan metode Harborne (1987), meliputi senyawa alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid dan tannin.
Alkaloid
Ekstrak ditambahkan 10 ml kloroform dan beberapa tetes ammonia. Fraksi
kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan H2SO4 2M. Pada fraksi asam
ditambahkan pereaksi Meyer, Dragendorf, dan Wagner secara sendiri-sendiri. Jika terdapat endapan putih dengan pereaksi Meyer, endapan merah jingga dengan pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat dengan pereaksi Wagner, maka dinyatakan positif terdapat alkaloid.
Flavonoid
Contoh dengan bobot tertentu ditambahkan air secukupnya dan dipanaskan selama 5 menit, kemudian ditambah serbuk Mg, 0,2 ml HCl pekat, dan beberapa tetes amil alkohol. Larutan dikocok dan dibiarkan terjadi pemisahan. Adanya flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna coklat pada lapisan amil alkohol.
Steroid/Triterpenoid
Contoh ditambahkan etanol lalu dipanaskan dan disaring. Filtrat diuapkan kemudian ditambahkan eter. Lapisan eter diambil untuk diuji dengan pereaksi
Lieberman Buchard. Terbentuknya warna merah ungu menyatakan positif mengandung triterpenoid dan warna hijau positif mengandung steroid.
Tanin
Contoh ekstrak sebanyak 1 g ditambah 100 ml air panas, didihkan selama 5 menit dan disaring. Ke dalam sebagian filtrat ditambahkan FeCl3 1%. Adanya tanin ditandai dengan terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman.
b. Analisis Komponen Lemak Menggunakan Gas Chromatography (GC)
Untuk mengetahui komponen asam lemak yang terkandung dalam ekstrak
heksana dilakukan identifikasi menggunakan Gas Chromatography (GC). Proses
analisis dilakukan sebagai berikut :
Sebanyak 20 mg ekstrak heksana ditimbang dalam tabung bertutup teflon, kemudian ditambahkan 1 ml NaOH 0,5 N dalam metanol. Selanjutnya dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Tabung diangkat dan didinginkan pada suhu kamar, ditambahkan larutan NaCl jenuh 2 ml dan heksana 1 ml serta dikocok selama 1-2 menit. Fasa organik dibiarkan terpisah dengan baik.
Tabel 8. Kondisi, Spesifikasi dan Program Pengaturan Gas Chromatography (GC)
Kondisi GC Spesifikasi dan Program Pengaturan
Kolom N2 H2 Suhu Injektor Suhu Detektor Suhu Kolom Volume Standar Volume Contoh
DEGS 10% dalam kromosorb WAW 6 feed x 1/8 inci 20 ml/menit
30 ml/menit 200oC 250oC
Suhu terprogram
Suhu awal 150oC--Æ ditahan 5 menit Suhu Akhir I 190oCÆ ditahan 10 menit Suhu akhir II 220oC-Æ ditahan 15 menit 2µL
2µL
Lapisan heksana dipindahkan kedalam botol kecil berisi 0,1 g NaSO4 anhidrat dan dibiarkan selama 20 menit. Selanjutnya lapisan heksana dipindahkan ke dalam
botol kecil dan contoh siap diinjeksikan ke dalam kromatografi gas dengan kondisi operasi seperti pada Tabel 8.
c. Identifikasi Ekstrak Heksana Menggunakan Gas Chromatography (GC) dan Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)
Pemisahan dan identifikasi komponen mudah menguap dari masing-masing konsentrat biji kamandrah, dilakukan dengan menggunakan alat GC-MS dan seperangkat komputer dengan program Class-5000 Ver. 1.1 (Anonim, 1994). Kondisi, spesifikasi dan program pengaturan alat GC-MS untuk pemisahan-identifikasi komponen mudah menguap biji kamandrah dilakukan menggunakan metode Kumara (1998).
Penyuntikan sebanyak 1 µL ke alat GC-MS dilakukan, masing-masing terhadap (1) udara (tanpa contoh dan pelarut), (2) pelarut dietil eter, (3) pelarut dietil eter yang telah dipekatkan, (4) konsentrat mudah menguap hasil ekstraksi 90 menit terhadap serbuk biji kamandrah hasil ekstraksi, (5) konsentrat mudah menguap hasil ekstraksi 90 menit terhadap residu serbuk biji kamandrah yang telah dikurangi lemak-minyaknya, dan (6) konsentrat mudah menguap hasil ekstrak 90 menit terhadap residu serbuk biji kamandrah yang telah dikurangi komponen polarnya. Identifikasi komponen mudah menguap dilakukan dengan bantuan komputer melalui proses pencocokan pola spektra massa masing-masing komponen mudah menguap biji kamandrah yang terpisah dengan
menggunakan koleksi spektra massa dari NIST (National Institute Standard and
Tecnology)-USA.
Fraksi yang dianalisis disuntikkan pada GS-MS sejumlah 1 µl dengan kondisi alat, spesifikasi dan pengaturan yang telah disesuaikan, seperti pada Tabel 9.
Penafsiran spektra massa GC-MS dilakukan dengan bantuan komputer dengan
Institute Standard and Tecnology (NIST) yaitu NIST 12 dan NIST 62 yang memiliki lebih dari 62.000 pola.
Tabel 9. Kondisi, Spesifikasi, dan Program Pengaturan Gas Chromatography-Mass
Spectrometry (GC-MS)
Kondisi GC Spesifikasi dan Program Pengaturan
Kolom Gas Pembawa Detektor Suhu interface Suhu Injektor Volume injeksi Teknik injeksi Waktu sampling Program suhu: -suhu awal
-laju kenaikan suhu -suhu akhir
Kolom kapiler HP 5 dengan panjang 30 meter, diameter dalam 0.32 mm, tebal film 0,25 µm
Helium, tekanan 40-45 Kpa MS (mass spectrometer) 230oC 230oC 1µL split/splitless 0.5 menit
40oC, ditahan selama 5 menit 4oC/menit
225oC, ditahan selama 5 menit
Kondisi MS Spesifikasi dan Program Pengaturan
Energi ionisasi Kisaran massa Interval Resolusi Waktu 1.20 kV 33-400 0.5 detik 1000 1.6-56.0 menit
Untuk menetapkan nilai Linier Retention Indices (LRI) dari setiap spektra yang muncul dilakukan dengan perhitungan menggunakan data waktu retensi dari n-alkana standar (C8 – C22) yang disuntikkan dengan konsentrasi 0,1% pada kondisi yang sama dengan kondisi penyuntikan contoh. Perhitungan LRI dilakukan menggunakan rumus :
LRIx = ( (tx – tn) / (tn + 1) + n) X 100 dengan,
LRIx = indeks retensi linier komponen x tx = waktu retensi komponen x (menit)
tn = waktu retensi standar alkana dengan n buah atom karbon yang muncul sebelum komponen x (menit)
tn + 1 = waktu retensi standar alkana dengan n + 1 buah aton karbon yang muncul setelah komponen x (menit)
n = jumlah atom karbon n-alkana yang muncul sebelum komponen x. Selanjutnya spektra tersebut juga dibandingkan dengan pola spektra yang tersedia pada pustaka. Setelah itu dilakukan konfirmasi identifikasi dengan
membandingkan LRI komponen hasil perhitungan dengan nilai LRI suatu komponen tertentu dari pustaka. Senyawa teridentifikasi dapat dipastikan bila nilai LRI hasil perhitungan memiliki nilai yang sama atau hampir sama dengan nilai LRI dari pustaka.
d. Identifikasi Ekstrak Etanol Menggunakan Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS)
Analisis kandungan senyawa dalam ekstrak etanol dilakukan untuk mengetahui komponen senyawa apa saja yang terdapat dalam ekstrak etanol tersebut. Oleh karena ekstrak etanol merupakan ekstrak yang bersifat polar, maka dilakukan identifikasi menggunakan Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Tatacara analisis ekstrak etanol menggunakan LC-MS dilakukan sebagai berikut :
Fraksi yang dianalisis disuntikkan pada LC-MS sejumlah 1 µl dengan kondisi alat, spesifikasi dan pengaturan yang telah disesuaikan. Penafsiran spektra massa
LC-MS dilakukan dengan bantuan komputer dengan menggunakan database software Class
5000 (Shimadzu) dengan database National Institute Standard and Tecnology (NIST) yaitu NIST 12 dan NIST 62 yang memiliki lebih dari 62.000 pola. Untuk mencari nilai Linier Retention Indices (LRI) dari setiap spektra yang muncul dilakukan dengan perhitungan menggunakan data waktu retensi dari n-alkana standar (C8 – C22) yang disuntikkan dengan konsentrasi 0,1% pada kondisi yang sama dengan kondisi penyuntikan contoh, seperti pada Tabel 10.
Selanjutnya spektra tersebut juga dibandingkan dengan pola spektra yang tersedia pada pustaka. Setelah itu dilakukan konfirmasi identifikasi dengan membandingkan LRI komponen hasil perhitungan dengan nilai LRI suatu komponen tertentu dari pustaka. Senyawa teridentifikasi dapat dipastikan bila nilai LRI hasil perhitungan memiliki nilai yang sama atau hampir sama dengan nilai LRI dari pustaka.
Tabel 10. Kondisi, Spesifikasi dan Program Pengaturan Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS)
Kondisi LC Spesifikasi dan Program Pengaturan
Program Suhu
Laju kenaikan Suhu Suhu akhir
Solvent cut time
Kondisi MS
Energi detektor Kisaran massa Kisaran waktu
80oC per menit
350oC, ditahan selama 20 menit 1 menit
1,2 kV 43 – 700
Interval 0,5 detik pada 1,2 – 20 menit
e. Uji Toksisitas Menggunakan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Terhadap larva udang Artemia salina.
Metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa aktif baru yang berasal dari tumbuhan tingkat tinggi biasanya dilakukan dengan uji toksisitas larva udang. Metode ini cukup praktis, cepat, mudah, murah dan akurasi tinggi.
Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas farmakologis suatu senyawa. Senyawa aktif yang dikandung ekstrak kasar tumbuhan akan menyebabkan tingkat kematian yang tinggi. Pemeriksaan toksisitas diperlukan untuk mengetahui berapa konsentrasi yang dapat menyebabkan keracunan sehingga dapat diketahui jumlah penggunaan konsentrasi yang tepat. Tingkat konsentrasi yang dapat menyebabkan keracunan ditentukan dengan konsentrasi letal 50 (LC50). LC50 adalah konsentrasi dari suatu bahan yang menyebabkan 50% kematian dalam suatu populasi. LC50 dapat digunakan untuk menentukan toksisitas suatu zat. Data kematian hewan uji yang diperoleh dapat diolah untuk mendapatkan nilai LC50 dengan selang
kepercayaan 95% dengan menggunakan probit analysis method yang pertama kali
dikemukakan oleh Finney. Nilai LC50 ini dijadikan sebagai batas konsentrasi tertinggi pada penentuan varian konsentrasi ekstrak dalam uji enzimatik.
Uji mortalitas larva udang Artemia salina Leach merupakan salah satu metode uji bioaktif pada penelitian senyawa bahan alam (Laughlin dan Ferrigni., 1991). Metode ini telah digunakan untuk berbagai pengamatan bioaktivitas antara lain untuk mengetahui residu pestisida, anastetik lokal, senyawa turunan morfin, mikotoksin, karsinogenesitas suatu senyawa, serta polutan air laut (Meyer et al., 1982). Beberapa keuntungan dari uji bioaktif menggunakan larva udang adalah waktu uji yang cepat, murah, tidak perlu terlalu aseptis, sederhana, tidak memerlukan keahlian khusus, dan
tidak memerlukan peralatan khusus. Menurut Meyer et al., (1982) apabila hasil
penelitian menunjukkan nilai LC50 < 1000 ppm maka bahan yang diuji dikatakan
memiliki potensi bioaktivitas.
Uji toksisitas menggunakan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Terhadap larva udang Artemia salina ini dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk
menentukan nilai LC50 sebelum melakukan uji toksisitas terhadap hewan uji mencit. Diharapkan hasil pengujian ini sebagai gambaran untuk menentukan dosis pengujian selanjutnya.
Tatacara Percobaan
Telur udang ditempatkan pada kotak penetasan yang telah disekat pada bagian tengahnya. Kemudian diberi air laut secara perlahan sampai setengah dari volume total dan bagian kotak yang berisi telur udang ditutup dengan timah aluminum, kotak yang telah ditutup ditempatkan dibawah sinar lampu, telur ditetaskan selama 24 jam, telur yang telah menetas akan menjadi larva yang kemudian akan berenang ke bagian kotak yang tidak tertutup oleh timah aluminum, sedangkan cangkangnya akan tertinggal sehingga tidak mengganggu pada saat pengambilan larva untuk uji BSLT. Setelah 48 jam larva udang siap digunakan untuk pengujian.
Pembuatan larutan induk. Sejumlah 2 mg ekstrak etanol dan ekstrak heksan ditimbang, kemudian dilarutkan dalam 1 ml air laut, contoh sukar larut ditambah 10 µl
DMSO sebelum penambahan air laut, dikocok hingga homogen. Larutan induk (200 ppm) yang telah dibuat dilakukan pengenceran sehingga didapat dosis 200 dan 20 ppm.
Pembuatan larutan seri. Untuk membuat larutan contoh konsentrasi 200 ppm dengan cara menyiapkan sebanyak 100 µl larutan induk, kemudian dipipet ke dalam
botol kecil lalu ditambah 900 µl air laut kemudian dikocok hingga homogen.
Pembuatan larutan contoh konsentrasi 20 ppm dilakukan sebanyak 100 µl dari larutan dengan konsentrasi 200 ppm dipipet ke dalam botol kecil lalu ditambah 900 µl air laut kemudian dikocok hingga homogen.
Sebanyak 10-12 ekor larva udang dimasukkan ke dalam botol kecil yang diisi 100 µl air laut, kemudian ditambah 100 µl larutan contoh. Selanjutnya botol kecil yang telah berisi larva udang dalam air laut tersebut didiamkan di bawah sinar lampu selama 24 jam. Setiap konsentrasi larutan uji dilakukan tiga kali ulangan.
Pengamatan
Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dengan menggunakan kaca pembesar (loop), kemudian jumlah larva yang mati dihitung.
Analisis Data
Data yang diperoleh dihitung menggunakan analisis probit. Rumus yang digunakan untuk menghitung toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah sebagai berikut:
a. Persentase kematian (mortalitas)
Jumlah akumulasi mati (AM)
Mortalitas (%) = X 100%
Jumlah AM + AH dengan,
AM = Akumulasi Mati AH = Akumulasi Hidup
4. Penentuan Dosis Efektif Khasiat dan Keamanan Ekstrak Terstandar Sebagai